L’objectif de cette thèse est de définir la chorégraphie de ségrégation des deux chromosomes circulaires de Vibrio cholerae, c’est à dire le positionnement de l’information génétique au cours de la croissance de la cellule, ainsi que les mécanismes dirigeant ces ségrégations. Il a longtemps été supposé que les bactéries étaient trop petites pour avoir une organisation intra-cellulaire, et le manque de techniques appropriées ne permettait pas d’infirmer cette hypothèse. Or la taille des chromosomes comparée à celle de la bactérie impose une compaction et aujourd’hui, de nouvelles techniques de microscopie et d’analyse génétique permettent d’affirmer que les chromosomes bactériens étudiés jusqu’à maintenant ont tous une organisation et une chorégraphie de ségrégation précises et différentes selon les espèces. Toutes les espèces étudiées à ce jour ont un chromosome circulaire unique : la réplication du chromosome commence à une origine unique bidirectionnelle, les deux fourches de réplication se déplacent le long des deux bras de réplication (ou réplichores) et finissent la réplication au terminus, diamétralement à l’opposée de l’origine de réplication sur la carte du chromosome. Peu d’espèces ont été étudiées, et Vibrio cholerae émerge progressivement comme un nouveau modèle : son génome est réparti sur deux chromosomes, et la chorégraphie de plusieurs chromosomes dans une cellule n’a jamais été décrite. De plus, cette espèce semble être au croisement évolutif entre Caulobacter crescentus et Escherichia coli : Vibrio cholerae a d’une part une morphologie en croissant, des systèmes de partition aux origines et un positionnement de l’origine du chromosome I, semblables à C. crescentus, et d’autre part un système de compaction du terminus et un set de gènes impliqués dans la maintenance du chromosome ayant co-évolué, qu’on ne retrouve que dans peu d’espèces proches d’E. coli. Une autre caractéristique intéressante de V. cholerae est que le chromosome II semble avoir été acquis récemment et n’est donc peut être pas gouverné par les mêmes mécanismes que le chromosome I, comme en témoignent le positionnement de son origine et son terminus, inédits pour des chromosomes bactériens. Parmi les Vibrios (environ 60 espèces principalement retrouvées dans les environnements aquatiques), certaines espèces sont des pathogènes dévastateurs pour les poissons, le corail, les crustacés ou les fruits de mer. Mais la plus documentée est Vibrio cholerae, car elle provoque chez l’Humain une maladie provoquée par l’ingestion d’eau contaminée qui peut être mortelle si le patient n’est pas réhydraté à temps. Bien que facilement traitable, le choléra fait encore de nombreuses victimes dans les pays en développement où les structures de santé et les règles d’hygiène font parfois défaut. Ainsi l’étude de Vibrio cholerae présente un intérêt médical, mais également par extension aux autres Vibrios, un intérêt environnemental non négligeable. / The aim of this thesis is to define the segregation choreography of the two circular chromosomes of Vibrio cholerae, which is the positionning of the genetic information during cell growth, as well as the mecanisms directing those segregations. It was supposed for a long time that bacteria were too small to have a intra-cellular organization and the lack of appropriate tools could not prove this hypothesis wrong. The size of the chromosomes compared to the size of the cell means there has to be a compaction and today, new tools for microscopy and genetic analysis allow us to affirm that all bacterial chromosomes studied so far have an organization and a segregation choreography which are precise and different between specie. Most bacterial specie studied to this day have a unique circular chromosome : the replication of the chromosome starts at a unique and bidirectionnal origin, both replication forks move along the two replication arms (or replichores) and end the replication at the terminus which is diametrically to the opposite of the origin on the chromosome map. A few specie have been studied, and Vibrio cholerae progressively emerges as a new model : its genome is divided between two chromosomes, and the choreography of several chromosomes in a cell has never been described. Moreover, this species seems to be at the crossover between Caulobacter crescentus and Escherichia coli : Vibrio cholerae as on one hand, a crescent shape, partition systems positionned at both origins and a positionning of the chromosome I origin similar to C. crescentus, and on the other hand a compaction system of the terminus and a set of genes involved on the maintenance of chromosomes that one only finds in very few specie closely related to E. coli. An other interesting characteristic of V. cholerae is that the chromosome II seems to have been acquired recently and thus might not be governed by the same mecanisms as the chromosome I, as shown by the positionning of its origin and terminus which are completely new to bacterial chromosomes. Among Vibrios (about 60 species mostly found in aquatic environments), some species are devastating pathogens for fish, coral, crustacean and shellfish. But the most documented one is Vibrio cholerae, because it induces a disease in humans caused by the ingestion of contaminated water, which can be deadly if the patient is not rehydrated on time. Although easily treatable, cholera still makes a lot of victims in developing countries where health structures and basic hygiene sometimes lack dramatically. The study of Vibrio cholerae has a medical interest, but also by extention to other Vibrios, a non-negligible environmental interest.

Le cancer est désormais considéré comme une maladie génomique de la cellule. Les moyens d’étude de l’oncogénome étaient basés sur les différentes modalités du caryotype, peu résolutif. L’application des techniques de micromatrices d’oligonucléotides, notamment l’aCGH, a permis une avancée majeure dans la caractérisation des génomes des cancers.La première partie de notre travail a porté sur les lymphomes de Burkitt (LB), caractérisés par une translocation entre un gène d'immunoglobuline et MYC. L’étude portait sur 12 tumeurs primaires et 15 lignées cellulaires. L’aCGH (44K et 244K), concordait avec les cytogénétiques morphologique et moléculaire (FISH) sauf pour les translocations. Plus de la moitié des variations du nombre de copies (<2Mb) étaient des polymorphismes (CNV). Les anomalies pathologiques (CNA) (n=136) intéressaient les régions suivantes : gains 1q, 13q, 7q, 8q, 2p, 11q et 15q ; pertes 3p, 4p, 4q, 9p, 6p, 17p, 6q, 11pterp13 et 14q12q21.3. Vingt régions minimales critiques (MCR) d’une taille varie entre 0.07-71.36 Mb, étaient délimitées. Trois MCR étaient identifiées sur le 1q : 1q21.1q25.2, 1q32.1 et 1q44. La région proximale de 1q21.1q25.2 était le siège d’une amplification, contenant entre autres les gènes BCA2, PIAS, BCL9. L’étude par transcriptome, sur 15 lignées, a démontré la surexpression uniquement de BCL9, remanié dans les LAL B et faisant partie de la voie de signalisation de MYC. Sur la région 11q23.1, le gain intéressait le gène POU2AF1 dont le messager était élevé. La MCR 13q31.3q32.1 était le siège d’une amplification contenant ABCC4, et le polycistron miR17-92. La corrélation des résultats d’aCGH à ceux du transcriptome et du mirnome ont démontré une surexpression du miR17-92 qui contrôle le développement des lymphocytes B et intervient dans la voie de signalisation de MYC. Sur le 9p21.3, la perte emportait le locus p16INK4A/p15INK4B. Le transcriptome avait démontré une sous expression de p15INK4B. Le locus p16INK4A/p15INK4B contrôle les 2 voies majeures, pRB et p53.La seconde partie de notre travail a consisté à étudier 17 tumeurs congelées de carcinomes adénoïdes kystiques (CAK) par aCGH 44K. Les CNA étaient validées par FISH et/ou MLPA. L’expression protéique était étudiée par immunohistochimie. Les pertes excédaient les gains (41 versus 24). La t(6;9)(q23;p22) récurrente dans les CAK était indétectable car équilibrée. Dans un seul cas, le der(6)t(6;9) est probablement présent sur le profil aCGH. Les MCR les plus fréquentes (-6q22 et -6q24) n’incluaient pas 6q23. Treize MCR étaient identifiées. La MCR délétée en 8q impliquait le miR-124A2 qui régule les gènes CDK6 et MMP2. Sur le 9p21.3, le locus p16INK4A/p15INK4B était de nouveau perdu. Des gains isolés étaient observés au niveau des locus CCND1, KIT/PDGFRA/KDR, MDM2 et JAK2. Le gène MDM2, qui était amplifié sous forme de double minutes, est un élément clé de l’axe p16INK4A-ARF-p53.Pour la troisième partie de notre travail nous avons étudié 60 tumeurs primaires d’adénocarcinomes pulmonaires (AD) de non fumeur par aCGH (244K). Dans 50/60 tumeurs, le nombre de MCR était de 14. Cinq MCR contenaient un seul gène (MOCS2, NSUN3, KHDRBS2, SNTG1 et ST18). Une MCR gagnée, 5q35, contenait le gène NSD1. Une amplification, sous forme de HSR et mise en évidence par FISH, intéressait l’oncogène FUS. Une PCR quantitative avait permis de confirmer la surexpression FUS. A notre connaissance, c’est la première étude qui incrimine le gène FUS dans la carcinogenèse de l’AD du non-fumeur. D’autres gènes étaient également impliqués : ARNT, BCL9, CDK4, p15INK4B, EGFR, ERBB2, MDM2, MDM4, MET, MYC, NKX2-1 et KRAS. Un clustering non supervisé avait permis de dégager un groupe avec un gain de MYC ; un autre groupe caractérisé par la perte des gènes suppresseurs RB et WRN et un dernier groupe caractérisé par un gain 7p et 7q, et présentait une fréquence élevée de mutations de l’EGFR. Dans 10/60, le nombre de CNA était très rare et aucune MCR n’était détectée. / Much of our current understanding of cancer is based on the hypothesis that it is a genetic disease, arising as a clone of cells that expand in an unregulated fashion because of somatically acquired mutations. High-throughput tools for nucleic acid characterization, such as array comparative genomic hybridization (aCGH), now provide the means to conduct comprehensive analyses of somatic anomalies in the oncogenome.In the first part of our work we have carried out a fine mapping of additional chromosomal anomalies in Burkitt lymphoma (BL). The hallmark of this disease is the translocation t(MYC;IG). We have applied whole-genome 244K and 44k oligonucléotides aCGH to 15 cells lines and 12 primary tumors of BL respectively. Karyotype and FISH analysis were used to validate aCGH results. As expected, all translocations remained undetectable with aCGH. More than half of the copy number alterations (CNAs) < 2 Mb were mapped to Mendelian CNVs, including GSTT1, and BIRC6. Somatic cell line-specific CNVs localized to the IG locus were consistently observed with the 244 K aCGH platform. Among 136 CNAs, gains were found in 1q, 13q, 7q, 8q, 2p, 11q and 15q. Losses were found in 3p, 4p, 4q, 9p, 13q, 6p, 17p, 6q,11pterp13 and 14q12q21.3. Twenty one minimal critical regions (MCR), (range 0.04–71.36 Mb), were delineated in tumors and cell lines. Three MCRs were localized to 1q: 1q21.1q25.2, 1q32.1 et 1q44. The proximal one was mapped to 1q21.1q25.2 with a 6.3 Mb amplicon (1q21.1q21.3) harboring BCA2, BCL9 and PIAS3. Only BCL9 high level transcrit was noted on oligonucleotide microarray gene expression that was done on 15 cells lines. BCL9, was implicated in a LAL B translocation t(1;14)(q21;q32) and it is a member of MYC pathway. The 13q31.3q32.1, 89.58–96.81 Mb MCR contained an amplicon with several genes. The miR-17-92 cluster, upregulated on mirnome analysis that was done on 15 cells lines, is the gene driver of 13q MCR. The miR-17-92 cluster is a member of MYC pathway. The 9p21.3 MCR harbored p16INK4A/p15INK4B locus which is downregulated. MYC activates ARF,a protein encodes by p16INK4A/p15INK4B locus. . On the second part of our work, a 44k aCGH was applied on 17 frozen adenoid cystic carcinoma (ACC) to delineate with a high resolution the CNA associated with ACC. aCGH results were validated with FISH and/or MLPA. Protein expression was screened with immunohistochemistry analysis. The translocation t(6;9)(q23;p23p24)/ MYB-NFIB recurrent in ACC, was not detected with aCGH. In one case, the der(6)t(6;9) was suspected in the aCGH pattern. There were recurrent gains at 7p15.2, 17q21–25, 22q11–13, and recurrent losses at 1p35, 6q22–25, 8q12–13, 9p21, 12q12–13, and 17p11–13. Thirteen MCR were detected. The recurrent deletion at 8q12.3–13.1 contained miRN124A2 gene, whose product regulates MMP2 and CDK6. The 9p21.3 MCR harbored p16INK4A/p15INK4B locus which was deleted. On 17p11p13, the MCR contained several genes and TP53 was deleted in 2 cases. The MDM2 gene, a member of p16INK4A-ARF-p53 pathway, was amplified and overexpressed in one case. Among the other unique CNAs, gains harbored CCND1, KIT/PDGFRA/KDR, and JAK2. On the third part of this these, a high-resolution 244K aCGH was conducted on 60 frozen lung adenocarcinoma (AD) of never smokers patients in order to establish a catalog of CNA. In 50/60 tumors, fourteen new MCR of gain or loss was noted. One larger MCR of gain contained NSD1.One focal amplification and nine gains contained FUS. NSD1 and FUS are oncogenes hitherto not known to be associated with lung cancer. FUS was over-expressed in 10 tumors with gain of 16p11.2 compared to 30 tumors without that gain. A FUS hsr was observed with FISH screening. FUS was over-expressed in 10 tumors with gain of 16p11.2 compared to 30 tumors without that gain. Other cancer genes present in aberrations included ARNT, BCL9, CDK4, p15INK4B, EGFR, ERBB2, MDM2, MDM4, MET, MYC, NKX2-1 and KRAS.

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Le chromosome circulaire de la bactérie Escherichia coli est composé de quatre macrodomaines et deux régions non structurées. Cette organisation influence la ségrégation des chromatides sœurs et la mobilité de l’ADN chromosomique. La structuration de la région terminus (Ter) en macrodomaine est lié à l’interaction de la protéine MatP avec la séquence cible de 13 pb (sic) appelée matS répétée 23 fois dans ce domaine de 800 kb. Le travail réalisé durant ma thèse a permis l’identification et la caractérisation d’un système site-spécifique qui restreint à la région Ter un effet associé à la protéine MatP qui contraint la mobilité de l’ADN et retarde la ségrégation de loci après réplication. Deux séquences spécifiques de 12 pb localisées dans les macrodomaines Right et Left sont requises et suffisantes pour arrêter la propagation du processus de contrainte sur le reste du chromosome. Les changements de propriétés de l’ADN ne sont pas dus à la présence d’un procédé agissant en trans mais probablement à un effet agissant en cis à longue distance et partant des sites matS. De manière remarquable, ces changements de propriétés sont régulés au cours du cycle cellulaire et ne sont présents seulement quand le macrodomaine Ter est associé à la machinerie de division au centre de la cellule. L’insulation de la région Ter requière une protéine nouvellement identifiée comme encrée à la membrane que nous avons nommé TidP et qui a été conservé avec la protéine MatP au cours de l’évolution. Nos résultats indiquent que deux systèmes d’organisation spécifiques sont requis pour l’organisation du macrodomaine Ter au cours du cycle cellulaire. Un second aspect de mon travail a été la caractérisation des mécanismes de contraintes affectant les macrodomaines Right et Left. Nous avons montré, en étudiant le comportement de grands cercles d’ADN excisés, que les propriétés de ces macrodomaines sont conservées dans un contexte extra-chromosomique. Ces résultats suggèrent l’implication d’éléments associés à la molécule d’ADN dans ces macrodomaines et responsable de leur organisation. / The organization of the Escherichia coli chromosome into a ring composed of four macrodomains and two less-structured region influences the segregation of sister chromatids and the mobility of chromosomal DNA. The structuring of the terminus region (Ter) into a macrodomain relies on the interaction of the protein MatP with a 13 bp target called matS repeated 23 times in the 800-kb long domain. The work performed during my Ph. D. allowed the identification and characterization of a site-specific system that restricts to the Ter region an effect associated to MatP that constrains DNA mobility and delays loci segregation. Two specific 12 bp sequences located in the flanking Left and Right macrodomains are required and sufficient to impede the spreading of the constraining process to the rest of the chromosome. The change of DNA properties does not rely on the presence of a trans-acting process but rather involves a cis-effect acting at a long distance from matS sites. Remarkably, the constraining process is regulated during the cell cycle and occurs only when the Ter MD is associated with the division machinery at mid-cell. Insulation of the Ter region requires a newly identified membrane-anchored protein designated TidP conserved with MatP through evolution. Our results indicate that 2 specific organizational systems are required for the management of the Ter region during the cell cycle. A second aspect of my work, consisted in the characterization of constraining mechanisms affecting the Right and Left macrodomains. I have shown, using excisions of large chromosomal rings, that their macrodomain properties were conserved in an extrachromosomal context, suggesting that a chromatin like structuring was involved in their organization.

<p>PIWI proteins belong to an evolutionary conserved protein family as the sister sub-family of ARGONAUTE (AGO) proteins. While AGO proteins are functionally well-characterized and shown to mediate small-RNA guided gene regulation, the function of PIWI proteins remain elusive. Here we pursued functional characterization of PIWI proteins by studying MILI and MIWI, two PIWI proteins in the mouse.</p><p>We first show that both MIWI and MILI co-immunoprecipitate with a novel class of non-coding small RNAs from the post-natal mouse testis extract, which are named Piwi-interacting RNAs (piRNAs). Our cloning efforts identified thousands of different piRNA sequences, mostly derived from intergenic regions. Interestingly, both MILI and MIWI piRNAs correspond to the same regions on the genome and differ primarily in length. We propose piRNAs in the adult testis are produced by the processing of long, single stranded RNA precursors, based on the observation that piRNAs originate in clusters from a number of sites on the genome in a head-to-tail homology. In support, we bioinformatically predicted putative promoters, and yeast one hybrid analysis on two such regions found out that they interact with Krueppel C2H2 type zinc finger transcription factors. We did not observe the features of the "ping-pong" mechanism in their biogenesis: Both MILI and MIWI piRNAs are biased for 5` Uracil without an Adenine bias on the 10th nucleotide position, and do not significantly consist of sequences complementary to each other along their first 10nt. Moreover, MILI piRNAs are not down-regulated in Miwi-/- testis. These results indicate that the post-natal testicular piRNAs are produced independent of the ping-pong mechanism. </p><p>Although piRNAs are highly complex, PAGE and in situ analyses showed that piRNAs are germ cell-specific with predominant expression in spermatocytes and round spermatids, suggestive of a meiotic function. Correspondingly, we found that Miwi-/-; Mili-/- mice undergo only male infertility with terminal spermatogenic arrest during meiosis. piRNAs show a nucleo-cytoplasmic distribution, with enrichment in the chromatoid and dense bodies, two male germ cell-specific structures. The dense body has been implicated in synapsis and in the heterochromatinization of the sex chromosomes during male meiosis, a process known as meiotic sex chromosome inactivation (MSCI). Our histological analysis on Miwi-/-; Mili-/- testes showed that, while the overall synapsis is not affected, the sex chromosomes retain the euchromatin marker acetyl-H4K16 and lacks the heterochromatin marker H3K9-dimethyl. These observations indicate that murine PIWI proteins are necessary for MSCI. Moreover, we identified piRNA production from the X chromosome before MSCI, and propose PIWI proteins utilize piRNAs to target and silence unpaired chromosomal regions during meiosis.</p> / Dissertation

Thesis (Ph. D.)--University of Nevada, Reno, 1999. / Includes bibliographical references. Online version available on the World Wide Web.

At the core of evolutionary biology stands the study of divergence between populations and the formation of new species. This dissertation applies a diverse array of theoretical and statistical approaches to study how chromosomes evolve. In the first chapter, I build models that predict the amount of neutral genetic variation in chromosomal inversions involved in local adaptation, providing a foundation for future studies on the role of these rearrangements in population divergence. In the second chapter, I use a large dataset of the geographic variation in frequency of a chromosomal inversion to infer natural selection and non-random mating, revealing that this inversion could be implicated in strong reproductive isolation between subpopulations of a single species. In the third chapter, I use coalescent models for recombining sex chromosomes coupled with approximate Bayesian computation to estimate the recombination rate between X and Y chromosomes in European tree frogs. This novel approach allows me to infer a rate so low that would have been hard to detect with empirical methods. In the fourth chapter, I study the theoretical conditions that favor the evolution of a chromosome fusion that reduces recombination between locally adapted alleles. / text

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2005. / Härtill 6 uppsatser.

Thesis (M.S.)--Brandeis University, 2009. / Title from PDF title page (viewed on May 29, 2009). Includes bibliographical references.