ACTH (hormônio adrenocorticotrópico) e fatores peptídicos de crescimento regulam a proliferação celular em células adrenocorticais. Resultados preliminares de ensaios biológicos, cromatografia de heparina-sefarose e \"Westem blotting\" indicaram a produção de fatores peptídicos de crescimento das famílias de PDGF e de FGF na linhagem celular adrenocortical Y-1. No entanto a relação entre o estímulo promovido por ACTH e a expressão de fatores peptídicos de crescimento e sua contribuição para o controle do ciclo celular em células adrenocorticais ainda não estão definidas. Os principais objetivos deste projeto consistiram em: 1. Detectar e caracterizar os fatores peptídicos de crescimento e seus correspondentes receptores expressos em células adrenocorticais; 2. Investigar a regulação da expressão de fatores peptídicos de crescimento sob o estímulo de ACTH; 3. Definir os mecanismos de ação para os fatores peptídicos de crescimento localmente expressos e sua contribuição na regulação do ciclo celular. Os modelos experimentais utilizados foram: a linhagem Y-1 de células tumorais de adrenocorticais de camundongo e culturas primárias de células adrenocorticais de rato. Os resultados obtidos foram: 1. Fatores peptídicos de crescimento e seus respectivos receptores, correspondentes a PDGF (A e B), FGF2 (isoformas de alto e de baixo peso molecular), IGF (1 e 2), TGFβ (1, 2 e 3), VEFG-A, TGFα e EGF, foram detectados por RT-PCR e confirmados por clonagem e sequenciamento; 2. mRNAs correspondentes às formas de \"splicing\" alternativo para FGF2, bem como as isoformas de baixo (LMW-FGF2) e de alto (HMW-FGF2) peso molecular para a proteína FGF2 foram detectados em células Y-1. Os níveis basais de LMW-FGF2 foram aumentados sob estímulo de ACTH; 3. Com relação à distribuição subcelular em células adrenocorticais, LMW-FGF2 endógeno (produzido sob estímulo de ACTH) foi encontrado predominantemente no citoplasma, enquanto LMW-FGF2 exógeno (recombinante) foi internalizado para o núcleo de maneira dose e tempo-dependente; 4. Receptores para FGF foram detectados e caracterizados em células adrenocorticais. As isoformas detectadas, correspondentes a FGFRlb, FGFR2c e FGFR3b, foram reguladas sob tratamentos de ACTH e de FGF2. A expressão de FGFRs foi silenciada utilizando-se RNAs de interferência (RNAi), permitindo investigar a contribuição da sinalização promovida por FGF e seus receptores no ciclo celular. / ACTH and locally produced peptide growth factors regulate the proliferation in adrenocortical cells. Our previous results of biological assays, heparin-sepharose chromatography and Western blot indicated that PDGF and FGF-like factors are synthesized in Y-1 adrenocortical cell line. But the interaction among the ACTH stimulation and locally produced peptide growth factors, and their contribution for the cell cycle control, remains to be investigated. The main objectives of these project were: 1. To characterize peptide growth factors and their respective receptors expressed in adrenocortical cells; 2. To investigate the regulation of the expression of peptide growth factors under ACTH stimulation; 3. To find the mechanism of action of the locally produced peptide growth factors and to determine their contribution in the cell cycle control. The experimental models utilized were the Y-1 mouse adrenocortical cell line and primary cultures from rat adrenocortex. The results found were: 1. Several peptide growth factors and their respective receptors, corresponding to PDGF (A and B), FGF2 isoforms, IGF (1 and 2), TGFβ (1 , 2 and 3), VEGF-A, TGFα and EGF were detected by RT-PCR and confirmed by cloning and sequencing; 2. Two mRNAs splicing variants, as well the low (LMW-FGF2) and the high (HMW-FGF2) molecular weigh isoforms for FGF2 were detected in adrenocortical cells. The very low basal level of the endogenous LMW-FGF2 in untreated cells was up regulated after the ACTH stimulation; 3. In regard to the intracellular distribution of FGF2 in adrenocortical cells, the endogenous (ACTH induced) LMW-FGF2 was found predominantly in he cytoplasm, but the exogenous (recombinant) LMW-FGF2 was internalized into the nucleus in a time and dose dependent manner; 4. FGFRs corresponding to FGFRlb, FGFR2c and FGFR3b isoforms were detected and characterized in adrenocortical cells. All of them were up regulated under ACTH and FGF2 treatments. The expression of FGFRs could be silenced by RNAi approach, allowing to investigate the contribution of the FGF signaling for the cell cycle control.

ACTH (hormônio adrenocorticotrópico) e fatores peptídicos de crescimento regulam a proliferação celular em células adrenocorticais. Resultados preliminares de ensaios biológicos, cromatografia de heparina-sefarose e \"Westem blotting\" indicaram a produção de fatores peptídicos de crescimento das famílias de PDGF e de FGF na linhagem celular adrenocortical Y-1. No entanto a relação entre o estímulo promovido por ACTH e a expressão de fatores peptídicos de crescimento e sua contribuição para o controle do ciclo celular em células adrenocorticais ainda não estão definidas. Os principais objetivos deste projeto consistiram em: 1. Detectar e caracterizar os fatores peptídicos de crescimento e seus correspondentes receptores expressos em células adrenocorticais; 2. Investigar a regulação da expressão de fatores peptídicos de crescimento sob o estímulo de ACTH; 3. Definir os mecanismos de ação para os fatores peptídicos de crescimento localmente expressos e sua contribuição na regulação do ciclo celular. Os modelos experimentais utilizados foram: a linhagem Y-1 de células tumorais de adrenocorticais de camundongo e culturas primárias de células adrenocorticais de rato. Os resultados obtidos foram: 1. Fatores peptídicos de crescimento e seus respectivos receptores, correspondentes a PDGF (A e B), FGF2 (isoformas de alto e de baixo peso molecular), IGF (1 e 2), TGFβ (1, 2 e 3), VEFG-A, TGFα e EGF, foram detectados por RT-PCR e confirmados por clonagem e sequenciamento; 2. mRNAs correspondentes às formas de \"splicing\" alternativo para FGF2, bem como as isoformas de baixo (LMW-FGF2) e de alto (HMW-FGF2) peso molecular para a proteína FGF2 foram detectados em células Y-1. Os níveis basais de LMW-FGF2 foram aumentados sob estímulo de ACTH; 3. Com relação à distribuição subcelular em células adrenocorticais, LMW-FGF2 endógeno (produzido sob estímulo de ACTH) foi encontrado predominantemente no citoplasma, enquanto LMW-FGF2 exógeno (recombinante) foi internalizado para o núcleo de maneira dose e tempo-dependente; 4. Receptores para FGF foram detectados e caracterizados em células adrenocorticais. As isoformas detectadas, correspondentes a FGFRlb, FGFR2c e FGFR3b, foram reguladas sob tratamentos de ACTH e de FGF2. A expressão de FGFRs foi silenciada utilizando-se RNAs de interferência (RNAi), permitindo investigar a contribuição da sinalização promovida por FGF e seus receptores no ciclo celular. / ACTH and locally produced peptide growth factors regulate the proliferation in adrenocortical cells. Our previous results of biological assays, heparin-sepharose chromatography and Western blot indicated that PDGF and FGF-like factors are synthesized in Y-1 adrenocortical cell line. But the interaction among the ACTH stimulation and locally produced peptide growth factors, and their contribution for the cell cycle control, remains to be investigated. The main objectives of these project were: 1. To characterize peptide growth factors and their respective receptors expressed in adrenocortical cells; 2. To investigate the regulation of the expression of peptide growth factors under ACTH stimulation; 3. To find the mechanism of action of the locally produced peptide growth factors and to determine their contribution in the cell cycle control. The experimental models utilized were the Y-1 mouse adrenocortical cell line and primary cultures from rat adrenocortex. The results found were: 1. Several peptide growth factors and their respective receptors, corresponding to PDGF (A and B), FGF2 isoforms, IGF (1 and 2), TGFβ (1 , 2 and 3), VEGF-A, TGFα and EGF were detected by RT-PCR and confirmed by cloning and sequencing; 2. Two mRNAs splicing variants, as well the low (LMW-FGF2) and the high (HMW-FGF2) molecular weigh isoforms for FGF2 were detected in adrenocortical cells. The very low basal level of the endogenous LMW-FGF2 in untreated cells was up regulated after the ACTH stimulation; 3. In regard to the intracellular distribution of FGF2 in adrenocortical cells, the endogenous (ACTH induced) LMW-FGF2 was found predominantly in he cytoplasm, but the exogenous (recombinant) LMW-FGF2 was internalized into the nucleus in a time and dose dependent manner; 4. FGFRs corresponding to FGFRlb, FGFR2c and FGFR3b isoforms were detected and characterized in adrenocortical cells. All of them were up regulated under ACTH and FGF2 treatments. The expression of FGFRs could be silenced by RNAi approach, allowing to investigate the contribution of the FGF signaling for the cell cycle control.

Orientador: Jorg Kobarg / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T15:15:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_EdmarciaElisa_D.pdf: 15682912 bytes, checksum: e58bfe67bbf5f3bc0979ec28db650292 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: As proteínas Neks (NIMA-related kinases) representam uma família de 11 quinases humanas nomeadas Nek1 a 11 que compartilham 40 a 45% de identidade de sequência com o regulador mitótico NIMA identificado em Aspergillus nidulans. O sinergismo entre os mecanismos que dirigem a mitose é essencial para a adequada divisão celular e sua desregulação é correlacionada ao aparecimento de cânceres humanos. As Neks são essenciais para progressão do ciclo celular e por isso têm recebido especial atenção como alvos para terapia do câncer. A Nek7 humana, por sua vez, contribui para formação do fuso mitótico e biogênese dos centrossomos. Neste trabalho, nós revelamos a Nek7 como uma quinase multifuncional. Nossos estudos demonstraram um amplo espectro de proteínas de interações com a Nek7 humana, classificadas dentro de múltiplas categorias funcionais, sobretudo, da divisão celular. Alguns novos parceiros de interação também são seus potencias substratos e, ainda, localizam com a Nek7 em estruturas essenciais para a mitose e citocinese. Nós evidenciamos ainda, que através de mecanismos distintos, os domínios N- e C-terminal de Nek6 e Nek7 podem contribuir diferencialmente para a regulação e catálise e podem proporcionar a base estrutural para a independência funcional dessas quinases na sinalização celular. Além disso, usando estudos baseados microscopia confocal e RNAi (RNA interference), nós mostramos que o interactor de Nek7, a proteína RGS2, é necessária para organização e orientação do fuso mitótico. Células em metáfase suprimidas de RGS2 apresentaram fenótipos tais como: prisão na mitose; defeitos na tensão dos cinetocóros e alinhamento dos cromossomos; desorganização do fuso mitótico; perturbação na redistribuição de proteínas do polo do fuso envolvidas em nucleação; mal-orientação do fuso mitótico; e redução de microtúbulos dos ásteres e de dinâmica. Além disso, tanto a supressão quanto a superexpressão das formas selvagem e quinase dead de Nek7 prejudicaram o recutamento de ?-tubulina para o polo do fuso. Esses achados introduz a participação de RGS2 na mitose e indicam que esta pode atuar cooperativamente com Nek7 para a precisa organização e formação do fuso mitótico. Por fim, empregando biologia de sistemas, nós mostramos um compreensivo interactoma das Neks, destacando para um possível crosstalking de todos os membros da família nos processos de regulação de centríolos e mitose; função ciliar e ciliopatias; e resposta a dano de DNA / Abstract: The Neks (NIMA-related kinases) proteins represent a human kinases family named Nek1 to 11 that share 40 to 45% of sequence identity with the established NIMA mitotic regulator, identified in Aspergillus nidulans. The synergism of the mechanisms that drive mitosis is essential for proper cell division and its dysregulation is correlated with the occurrence of human cancers. The Neks are essential for cell cycle progression and therefore have received attention as targets for cancer therapy and other diseases. Human Nek7 contributes to mitotic spindle formation and centrosome biogenesis. Herein, we reveal Nek7 as a multifunctional kinase. Our proteomic studies have demonstrated a broad spectrum of interaction proteins of human Nek7 classified into multiple functional categories, especially, cell division. Some new interaction partners are also potential Nek7 substrates and localize in key structure during mitosis and cytokinesis. We also evidenced that, through different mechanisms, the N- and C- terminal domains of Nek7 and Nek6 can differentially contribute to the regulation and catalysis and provide the basis for a functional independence of Nek6 and Nek7 in cell signaling. Furthermore, using studies based in confocal microscopy and RNAi we showed the Nek7 interactor, RGS2 protein, is required for organization and orientation of the mitotic spindle. Metaphase cells RGS2-depleted showed phenotypes such as: arrest in mitosis; defects in tension kinetochores and alignment chromosomes; disruption of the mitotic spindle; disturbance in the proteins redistribution of the spindle pole involved in nucleation and microtubule dynamics; mitotic spindle misorientation; and astral microtubules reduction. Furthermore, the suppression or both overexpression of Nek7 wild type or kinase dead impaired the recruitment of ?-tubulin to the spindle pole. These findings introduce the involvement of RGS2 in mitosis and indicate that it may act cooperatively with Nek7 for proper mitotic spindle organization and formation. Finally, employing systems biology, we showed a comprehensive Neks interactome, highlighting for a possible crosstalking of all family members in centrioles and mitosis regulation; ciliary and ciliopathies function; and response to DNA damage / Doutorado / Bioquimica / Doutora em Biologia Funcional e Molecular