( )-linalool (LIN) is a monoterpene alcohol majority in the essential oils of several aromatic species commonly found in northeastern Brazil, such as Ocimum basilicum and Cinnamomum verum. Recent studies have shown that LIN has important therapeutic properties, including its antinociceptive, anti-inflammatory and anticonvulsant. Despite the benefits described above, the LIN, such as monoterpenes generally exhibits low solubility in water, high volatility and short half-life, thus incorporation into cyclodextrins (CDs), especially β-CD, has emerged as a tool important to improve the physicochemical properties and biological isoprênico this derivative. Thus, we investigated the possible antinociceptive effects of LIN isolated and included in β-CD in chronic non-inflammatory muscle pain model, besides to the effects on the motor activity and the central action. Male Swiss mice (25-35 g) were divided into groups and subjected to induction protocols non-inflammatory nociception by injecting acid saline (pH 4; 20 μL) in the belly left of gastrocnemius muscle. Subsequently, they were treated orally (p.o.) with LIN (25 mg/kg) LIN/β-CD (25, 50 and 100 mg/kg) tramadol (TRM 4 mg/kg, i.p.) or vehicle (solution 0.9% saline), and evaluated for behavioral parameters over a period of 27 days. The animals were subjected to tests of mechanical hyperalgesia (von Frey digital), motor coordination (Rota Rod) and muscle strength (Grip Strength Metter), and to determine the possible involvement of areas of the central nervous system (CNS), the animals were treated and ninety minutes, were anesthetized, perfused, the brains extracted and cut in a cryostat. The brain sections were subjected to immunofluorescence protocol for Fos protein. The results were expressed as mean ± standard error of the mean. Differences between groups were analyzed by ANOVA test, a path followed by Bonferroni test. P values <0.05 were considered statistically significant. Treatment with LIN and LIN/β-CD showed antinociceptive activity in animal model of chronic non-inflammatory muscle hyperalgesia in mice at all doses tested, with the LIN/β-CD prolonged activity against isolated substance, confirming the possibility of significant improvement in the therapeutic action; treatment with LIN and LIN/β-CD did not induce motor incoordination or change in muscle strength. By immunofluorescence, we observed that treatment of LIN and LIN/β-CD presented action in the CNS, acting in the brain, whereas the retrosplenial cortex and periaqueductal gray central structures are strictly related to the mechanisms of pain modulatory. / O ( )-linalol (LIN) é um monoterpeno alcoólico majoritário nos óleos essenciais de várias espécies aromáticas comumente encontradas no nordeste brasileiro, tais como Ocimum basilicum e Cinnamomum verum. Estudos recentes tem demonstrado que o LIN produz importantes propriedades terapêuticas, incluindo seus efeitos antinociceptivo, anti-inflamatório e anticonvulsivante. Apesar dos benefícios supracitados, o LIN, como os monoterpenos em geral, exibe baixa solubilidade em água, alta volatilidade e curta meia vida plasmática; desta forma a incorporação em ciclodextrinas (CDs), especialmente a β-CD, vem se destacando como uma ferramenta importante para melhorar as propriedades físico-químicas e biológicas deste derivado isoprênico. Assim, foram investigados os possíveis efeitos antinociceptivos do LIN, isolado e incluso em β-CD no modelo animal de hiperalgesia muscular não inflamatória, além dos efeitos do tratamento na atividade motora e a ação central. Camundongos Swiss machos (25-35 g), foram divididos em grupos e submetidos ao protocolo de indução da nocicepção não inflamatória através da injeção de solução salina ácida (pH 4; 20 μL) no ventre do músculo gastrocnêmio esquerdo. Posteriormente, foram tratados, por via oral (v.o.) com LIN (25 mg/kg), LIN/β-CD (25, 50 e 100 mg/kg), tramadol (TRM 4 mg/kg, i.p.) ou veículo (solução salina 0,9%), e avaliados quanto à parâmetros comportamentais durante um período de 27 dias. Os animais foram submetidos aos testes da hiperalgesia mecânica (von Frey digital), da coordenação motora (Rota Rod) e da força muscular (Grip Strength Metter), e para determinar o possível envolvimento de áreas do Sistema Nervoso Central (SNC), os animais foram tratados e, noventa minutos após, foram anestesiados, perfundidos, os cérebros extraídos e cortados em criostato. As secções cerebrais foram submetidas ao protocolo de imunofluorescência para proteína Fos. Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média. As diferenças entre os grupos foram analisadas por meio do teste de variância ANOVA, uma via, seguido pelo teste de Bonferroni. Valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significantes. O tratamento com LIN e LIN/β-CD apresentou atividade antinociceptiva no modelo animal de hiperalgesia muscular crônica não inflamatória em camundongos, em todas as doses testadas, tendo o LIN/β-CD atividade prolongada em relação a substância isolada, confirmando a possibilidade de melhora significativa na ação terapêutica; o tratamento com LIN e LIN/β-CD não induziu incoordenação motora nem alteração da força muscular. Através da imunofluorescência, observou-se que o tratamento de LIN e LIN/β-CD apresentou ação no SNC, atuando no encéfalo, visto que o córtex restrosplenial e a substância cinzenta periaquedutal são estruturas centrais intimamente relacionadas com os mecanismos modulatórios da dor.

( )-linalool (LIN) is a monoterpene alcohol majority in the essential oils of several aromatic species commonly found in northeastern Brazil, such as Ocimum basilicum and Cinnamomum verum. Recent studies have shown that LIN has important therapeutic properties, including its antinociceptive, anti-inflammatory and anticonvulsant. Despite the benefits described above, the LIN, such as monoterpenes generally exhibits low solubility in water, high volatility and short half-life, thus incorporation into cyclodextrins (CDs), especially β-CD, has emerged as a tool important to improve the physicochemical properties and biological isoprênico this derivative. Thus, we investigated the possible antinociceptive effects of LIN isolated and included in β-CD in chronic non-inflammatory muscle pain model, besides to the effects on the motor activity and the central action. Male Swiss mice (25-35 g) were divided into groups and subjected to induction protocols non-inflammatory nociception by injecting acid saline (pH 4; 20 μL) in the belly left of gastrocnemius muscle. Subsequently, they were treated orally (p.o.) with LIN (25 mg/kg) LIN/β-CD (25, 50 and 100 mg/kg) tramadol (TRM 4 mg/kg, i.p.) or vehicle (solution 0.9% saline), and evaluated for behavioral parameters over a period of 27 days. The animals were subjected to tests of mechanical hyperalgesia (von Frey digital), motor coordination (Rota Rod) and muscle strength (Grip Strength Metter), and to determine the possible involvement of areas of the central nervous system (CNS), the animals were treated and ninety minutes, were anesthetized, perfused, the brains extracted and cut in a cryostat. The brain sections were subjected to immunofluorescence protocol for Fos protein. The results were expressed as mean ± standard error of the mean. Differences between groups were analyzed by ANOVA test, a path followed by Bonferroni test. P values <0.05 were considered statistically significant. Treatment with LIN and LIN/β-CD showed antinociceptive activity in animal model of chronic non-inflammatory muscle hyperalgesia in mice at all doses tested, with the LIN/β-CD prolonged activity against isolated substance, confirming the possibility of significant improvement in the therapeutic action; treatment with LIN and LIN/β-CD did not induce motor incoordination or change in muscle strength. By immunofluorescence, we observed that treatment of LIN and LIN/β-CD presented action in the CNS, acting in the brain, whereas the retrosplenial cortex and periaqueductal gray central structures are strictly related to the mechanisms of pain modulatory. / O ( )-linalol (LIN) é um monoterpeno alcoólico majoritário nos óleos essenciais de várias espécies aromáticas comumente encontradas no nordeste brasileiro, tais como Ocimum basilicum e Cinnamomum verum. Estudos recentes tem demonstrado que o LIN produz importantes propriedades terapêuticas, incluindo seus efeitos antinociceptivo, anti-inflamatório e anticonvulsivante. Apesar dos benefícios supracitados, o LIN, como os monoterpenos em geral, exibe baixa solubilidade em água, alta volatilidade e curta meia vida plasmática; desta forma a incorporação em ciclodextrinas (CDs), especialmente a β-CD, vem se destacando como uma ferramenta importante para melhorar as propriedades físico-químicas e biológicas deste derivado isoprênico. Assim, foram investigados os possíveis efeitos antinociceptivos do LIN, isolado e incluso em β-CD no modelo animal de hiperalgesia muscular não inflamatória, além dos efeitos do tratamento na atividade motora e a ação central. Camundongos Swiss machos (25-35 g), foram divididos em grupos e submetidos ao protocolo de indução da nocicepção não inflamatória através da injeção de solução salina ácida (pH 4; 20 μL) no ventre do músculo gastrocnêmio esquerdo. Posteriormente, foram tratados, por via oral (v.o.) com LIN (25 mg/kg), LIN/β-CD (25, 50 e 100 mg/kg), tramadol (TRM 4 mg/kg, i.p.) ou veículo (solução salina 0,9%), e avaliados quanto à parâmetros comportamentais durante um período de 27 dias. Os animais foram submetidos aos testes da hiperalgesia mecânica (von Frey digital), da coordenação motora (Rota Rod) e da força muscular (Grip Strength Metter), e para determinar o possível envolvimento de áreas do Sistema Nervoso Central (SNC), os animais foram tratados e, noventa minutos após, foram anestesiados, perfundidos, os cérebros extraídos e cortados em criostato. As secções cerebrais foram submetidas ao protocolo de imunofluorescência para proteína Fos. Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média. As diferenças entre os grupos foram analisadas por meio do teste de variância ANOVA, uma via, seguido pelo teste de Bonferroni. Valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significantes. O tratamento com LIN e LIN/β-CD apresentou atividade antinociceptiva no modelo animal de hiperalgesia muscular crônica não inflamatória em camundongos, em todas as doses testadas, tendo o LIN/β-CD atividade prolongada em relação a substância isolada, confirmando a possibilidade de melhora significativa na ação terapêutica; o tratamento com LIN e LIN/β-CD não induziu incoordenação motora nem alteração da força muscular. Através da imunofluorescência, observou-se que o tratamento de LIN e LIN/β-CD apresentou ação no SNC, atuando no encéfalo, visto que o córtex restrosplenial e a substância cinzenta periaquedutal são estruturas centrais intimamente relacionadas com os mecanismos modulatórios da dor.

Orientadores: Eneida de Paula, Leonardo Fernandes Fraceto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T01:05:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lima_RobertaAlineFrancode_M.pdf: 1479897 bytes, checksum: 3c9af4bda36adc886426ab930c957a40 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A dor desempenha um papel biológico muito importante como indicador da presença de um estímulo nocivo, que pode representar dano real ou potencial ao organismo; entretanto, não é interessante que essa sinalização persista além das necessidades fisiológicas a ponto de tornar-se um incomodo, podendo dificultar o desempenho das atividades normais, comprometer a qualidade de vida do indivíduo e impedir a realização de práticas cirúrgicas curativas. Os anestésicos locais são fármacos empregados para alívio da dor aguda ou crônica, pois bloqueiam a condução do estímulo nervoso em membranas neuronais. Dentre eles, está a Tetracaína (TTC) um amino-éster de grande utilidade na prática clínica, empregado em procedimentos que requerem anestesia tópica, como aqueles oftalmológicos que necessitam de intervenções na córnea. As limitações do uso clínico da TTC está relacionadas à sua baixa estabilidade química (hidrólise da ligação éster por esterases plasmáticas) e sua toxicidade sistêmica. Sistemas de liberação modificada de fármacos, que empregam carreadores como ciclodextrinas, constituem uma alternativa para aumentar o tempo de ação anestésica e diminuir a toxicidade. As ciclodextrinas são capazes de formar complexos de inclusão com diversos fármacos, alterando propriedades como a solubilidade aquosa, o que torna esses oligosacarídeos cíclicos promissores para este tipo de aplicação. Neste trabalho, estudamos a complexação da TTC com beta-ciclodextrina (?-CD) e hidroxipropil-beta-ciclodextrina (HP-?-CD) em pH fisiológico e sua influência na toxicidade celular e efeito antinociceptivo, induzidos por aquele anestésico, objetivando a preparação de novas formas farmacêuticas. Para caracterização dos complexos de inclusão TTC:?-CD e TTC:HP-?-CD foram empregados métodos espectroscópicos (Ressonância Magnética Nuclear, fluorescência, absorção UV/VIS), difração de raios-X e calorimetria diferencial de varredura. A partir das análises realizadas, encontrou-se que a estequiometria de complexação da TTC com ambas as ciclodextrinas é de 1:1. A constante de associação aparente da TTC, determinada por DOSY-NMR, é de 777 M-1 e 2243 M-1, para ?-CD e HP-?-CD respectivamente, indicando uma forte interação entre as moléculas de anestésico e das ciclodextrinas, em pH fisiológico. Os dados de proximidade espacial, determinados por RMN (1DROESY) revelaram interações entre os hidrogênios Hh e Hi, (que fazem parte do anel aromático da TTC) e hidrogênios da cavidade interna das ciclodextrinas, permitindo assim propor a geometria dos complexos de inclusão da TTC com ambas ciclodextrinas. Ensaios in vitro, em cultura de fibroblastos da linhagem 3T3, mostraram aumento na viabilidade celular após complexação da TTC com ?-CD e HP-?-CD, em relação à TTC em solução. Testes de atividade biológica, de bloqueio do nervo infraorbital em ratos, demonstraram aumento significativo do tempo de duração da anestesia nos animais tratados com os complexos TTC:?-CD e TTC:HP-?-CD (40 min e 40 min), em relação ao grupo tratado com 0,5% de TTC livre (30 min). Os resultados obtidos neste estudo demonstram a formação de complexos de inclusão com forte interação entre TTC e ?-CD e HP-?-CD; indicam ainda que a utilização destes complexos de inclusão é promissora como forma farmacêutica alternativa para este anestésico, devido ao aumento da duração da anestesia (pois os complexos apresentaram maior eficácia quando comparados à TTC livre nas mesmas doses), ou ainda a diminuição da toxicidade (atingindo a mesma eficácia da TTC livre, com menores concentrações de TTC complexada). / Abstract: Pain plays an important biological role as a sign of the presence of a noxious stimulus, that denotes actual or potential damage to the body. However, it is not interesting this signal to persist beyond the physiological point, to become a nuisance that impairs the performance of normal activities, the quality of life or prevents the procedure of healing surgical practices. Local anesthetics are used for the relief of acute or chronic pain since they block the conduction of the painful stimulation in neuronal membranes. Among them is Tetracaine (TTC) an amino ester useful in clinical procedures requiring local anesthesia such as those ophthalmic ones with intervention in the cornea. The clinical use of TTC is limited by its low chemical stability (hydrolysis of the ester bond by plasma esterases) and systemic toxicity. The use of drug-delivery systems, in carriers such as cyclodextrins is a good approach to improve the duration of action and to diminish the toxicity of local anesthetics. Cyclodextrins are suitable for this type of application since these cyclic oligosaccharides are able to form inclusion complexes with several drugs improving their water solubility. Here we have studied the complexation of TTC with beta (?-CD) and hydroxypropyl-beta-cyclodextrin (HP-?-CD) and its influence in cell toxicity and antinociceptive effects induced by that anesthetic, aiming the development of new pharmaceutical forms. TTC and ?-CD or HP-?-CD inclusion complexes were characterized using spectrophotometric methods (Nuclear Magnetic Resonance, fluorescence, UV-VIS absorption), X-ray Diffraction and Differential Scanning Calorimetry. A 1:1 stoichiometry of complexation was found for both complexes. The association constant determined by DOSY was 777 M-1 and 2.243 M-1 for TTC complexation with ?-CD and HP-?-CD, respectively, indicating a strong association between the anesthetic and both cyclodextrins, at physiological pH. The nuclear overhauser NMR data (ROESY) had disclosed trough the space proximities between hydrogens Hh and Hi - at the aromatic ring of TTC - and hydrogens from the inner cavity of the cyclodextrins, allowing us to suggest the geometry of TTC:?-CD and TTC:HP-?-CD complex formation. In vitro culture tests on 3T3 fibroblasts cells revealed an increase in cell viability after TTC complexation with ?-CD and HP-?-CD, in comparison to the effect of free TTC. Biological activity was assessed in rats, through the infraorbital nerve blockade test. The results revealed a significant increase in the duration of anesthesia in animals treated with TTC:?-CD and TTC:HP-?-CD (40 min and 40 min), in comparison to a solution of 0.5% tetracaine (30 min). The results presented here demonstrate the formation of strong associated inclusion complexes between TTC and ?-CD and HP-?-CD. The in vivo results allow us to consider those complexes as promising pharmaceutical forms to increase the duration of anesthesia induced by tetracaine (since both complexes showed higher anesthetic potency when compared to free TTC at equivalent doses) or to diminish its toxicity (since the same activity can be achieved with lower concentrations of the complexed TTC formulations). / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

In the present study, compounds derived from β-lapachone were electrochemically studied in protic (phosphate and acetate buffer) and aprotic (DMF + TBAP) media, using glassy carbon as working electrode. The electroreducedintermediatesof the quinones reacted with oxygen, indicative of the generation of reactive oxygen species. The interaction of the quinones β-lapachone, α-lapachone and nor-β-lapachone with DNA, was investigated using the technique of quartz crystal microbalance.To increase the solubility of the quinones, in order to allow in vivo studies, the formation of inclusion complexes with β-cyclodextrin was evaluated. Positive results were obtained, leading to a viable formulation alternative for further biological studies with the compounds. β-lapachone was studied spectroelectrochemically through the techniques of Polarization Modulation Infrared Reflection Absorption Spectroscopy + Cyclic Voltammetry to confirm the formation of the hydrogen bondfrom the electroreduced β-lapachone and the secondary hydroxy group of β-cyclodextrin. The inclusion complex betweenmangiferin, an antioxidant polyphenoland β-cyclodextrin, was confirmed using the techniques of Fourier Transform Infrared Spectroscopy, Hydrogen Nuclear Magnetic Resonance, Differential Scanning Calorimetry and Polarization Modulation Infrared Reflection Absorption Spectroscopy. Also, the increase of the antioxidant activity of mangiferin was demonstrated when in presence of β-cyclodextrin, by means of radical scavenging activity toward 2,2’-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical (RSA-DPPH ), with additional analysis of solvent effects, being demonstrated that below 50% of organic solvent, it is impossible to work with this method. The assay of the capacity of oxygen radical absorbance capacity-fluorescein (ORAC-FL) was also used, showing that the complex mangiferin: β-cyclodextrin is fifteenfold more potent than the standard molecule,Trolox. Using Electrophoresis and Differential Pulse Voltammetry, it was possible to emphasize that the method used by our research group for the ssDNA production (treatment acid-base with heating) is useful, simple, cheap and completely reproducible, being this, one of the methods used to show the interaction between DNA and free or complexed thymol with cyclodextrin. This interaction was still evaluated using dsDNA biosensor through Differential Pulse Voltammetry, Electrochemistry Quartz Crystal Microbalance and Scanning Electrochemistry Microscopy. / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Neste trabalho, derivados da nor-β-lapachona e nor-α-lapachona, foram estudados eletroquimicamente nos meios prótico (tampão fosfato e acetato) e aprótico (DMF + TBAP), utilizando carbono vítreo como eletrodo de trabalho.Os intermediáriosda eletro-redução das quinonas reagiram com oxigênio, indicativo da geração de Espécies Reativas de Oxigênio. A interação das quinonas β-lapachona, α-lapachona e nor-β-lapachona com DNAfoi investigada,utilizando-sea técnica de microbalança de cristal de quartzo. Com o objetivo de aumentar a solubilidade das quinonas, para posteriores estudos in vivo, foi avaliada a formação de complexos de inclusão com β-ciclodextrina, sendo a β-lapachona estudada espectroeletroquimicamente através das técnicas de Espectroscopia de Reflexão-Absorção no Infravermelho com Polarização Modulada + Voltametria Cíclica para confirmar a formação da ligação hidrogênio entre a hidroquinona gerada a partir da β-lapachonae as hidroxilas secundárias da β-ciclodextrina. A formação do complexo de inclusão entre a mangiferina, um composto antioxidante polifenólico, e a β-ciclodextrina foi confirmado utilizando-se as técnicas de Infravermelho com transformada de Fourier, Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio, Calorimetria Diferencial e Espectroscopia de Reflexão-Absorção no Infravermelho com Polarização Modulada. Foi,também, demonstrado o aumento da atividade antioxidante da xantona supracitada quando em presença de β-ciclodextrina através da medida da atividade sequestradora de radicais frente ao radical 2,2’-difenil-1-picrilidrazil (RSA-DPPH ),com análise adicional do efeito do solvente sendo assim demonstrado que abaixo de 50% de solvente orgânico, é impossível trabalhar com este método. O ensaio da capacidade de absorbância do radical oxigênio-fluoresceína (ORAC-FL) também foi utilizado, mostrando que o complexo mangiferina:β-ciclodextrina é quinze vezes mais potente que a molécula padrão trolox. Com a utilização de ensaios de Eletroforese e Voltametria de Pulso Diferencial, foi possível enfatizar que o método usado por nosso grupo de pesquisa para a produção de ssDNA (tratamento ácido-base com aquecimento) é útil, simples, barato e completamente reprodutível,sendo este um dos métodos utilizados para mostrar a interação entre DNA e timol livre e complexado com ciclodextrina. Esta interação foi ainda avaliada usando biossensor de dsDNA por Voltametria de Pulso Diferencial, Microbalança Eletroquímica de Cristal de Quartzo e Microscopia Eletroquímica de Varredura.