grecase@um.es,ntma@um.es;jmoraled@um.es / Objetivos: La membrana timpánica (MT) tiene capacidad de repararse fisiológicamente tras traumatismos, infecciones y otras patologías. Es lógico deducir que existe un nicho de células madre con capacidad regenerativa responsable de la reparación tisular a este nivel, pero existe muy poca información contrastada sobre ello. Nuestro objetivo fue confirmar la existencia y localización de células madre de la MT y realizar su aislamiento y caracterización. Metodología: Se utilizo un modelo murino C57BL/6J de 8-10 semanas, procedente del animalario de la Universidad de Murcia, siguiendo normativa vigente. Para extracción de MT se utilizaron varios protocolos quirúrgicos con inclusión o ausencia de martillo y annulus. Se realizaron técnicas de digestión enzimática y explantes para obtención de cultivo primario. Las células se sembraron a 1,25 x106 en frascos de cultivo de 25cm2 con alfa-MEM suplementado según protocolos estandarizados en estufas a 37ºC y 5% de C02. Se realizaron subcultivos, curvas de crecimiento y cuantificación de la proliferación celular con MTT. Se utilizó citómetro FACSCanto y un panel de 8 Ac monoclonales para la tipificación inmunofenotípica y RT-PCR para expresión de Nestina, Nanog y Slug. Se emplearon medios de cultivo específicos para la capacidad de diferenciación multipotente. El estudio del nicho se realizó mediante cortes histológicos en zonas estructuradas de la MT y análisis histológico convencional e inmuno-histoquímico para Ki-67, Nestina, Tuj-1 y Oct-3/4. Resultados: Se extrajeron 333 tímpanos de 207 ratones, de los que se lograron realizar 25 explantes. La digestión enzimática produjo una baja viabilidad y escasa proliferación celular en relación directa con el tiempo de exposición. En contraste las técnicas de explante produjeron una viabilidad >75% alcanzándose confluencia más rápidamente y durante mayor número de pases que con colagenasa. Los mejores explantes para cultivos primarios incluyeron el martillo y el annulus. En los cultivos primarios se observaron células de morfología epitelial y otras células de morfología fibroblástica. Las curvas de crecimiento demostraron un promedio de 3,54x105 en los explantes con martillo y annulus en comparación con 2,9 x105 y 3,1 x105 en los que no incluyeron annulus. El MTT mostró una proliferación exponencial proporcional al tiempo de cultivo y a la densidad de la muestra inicial. Las células de la MT fueron negativas para CD45, CD19 y citoqueratina, y positivas para CD90, CD105, CD73, (marcadores mesenquimales), así como para Ki67 y Nestina (marcadores de proliferación e inmadurez). Fueron parcialmente positivas para CD34. La PCR mostró positividad para Nanog, Slug y Nestina. La diferenciación adipocítica se demostró por la presencia de tinción celular positiva para Oil Red O; la diferenciación osteocítica por los depositos de calcio Alizarin red, tinción positiva de fosfatasa alcalina e inmunofluorescencia para osteopontina, y diferenciación condrocítica con inmunofluorescencia positiva a colágeno II. Los estudios histológicos fueron positivos para Ki67, Nestina y Oct-3/4 no así como para Tuj-I. Los nichos de células con características de células madres se encontraron en las áreas de engrosamiento de la membrana timpánica junto al mango del martillo y al annulus. Conclusiones: Nuestros datos confirman la presencia en la membrana timpánica de células progenitoras inmaduras con características de células madre. Las células madre de la MT se sitúan preferentemente en la zona de inserción del mango del martillo, y con menor frecuencia en el annulus. La técnica optima de explante para la obtención de cultivos primarios eficaces debe incluir el martillo y el annulus. Las células obtenidas del cultivo de la MT identificadas en nuestro estudio, tienen capacidad de diferenciación multipotencial a líneas celulares mesodérmicas y presentan un fenotipo inmunológico, compatibles con la definición de células madre mesenquimales aceptada por la ISCT, por lo que podrían emplearse en ensayos de terapia celular. / Goals: The tympanic membrane (TM) has the ability to repair after trauma, infections and other diseases. It is logical to conclude that there is a niche of stem cells with regenerative capacity responsible for tissue repair at this level, but there is little authoritative information about it. Our aim was to confirm the existence and location of these cells within the TM and to try to isolate and characterize them. Methododology: An 8-10 weeks mouse model C57BL/6J from the animal facility of the University of Murcia was used following current regulations. For the TM extraction, various surgical protocols were used including combinations of hammer or and annulus extractions. Different techniques were performed to obtain primary cultures including explants and enzymatic digestion. Cells were seeded at a concentration of 1.25 x 106 in 25cm2 culture flasks with alpha-MEM supplemented by standardized protocols in a stove at 37C with 5% C02. Subcultures, growth curves and quantification of cell proliferation was performed with MTT. A FACSCanto cytometer with a panel of 8 monoclonal Antibodies was used for immunophenotypic characterization and RT-PCR for expression of Nestin, Nanog and Slug. Specific culture media for multipotential differentiation capacity were used. To localize the stem cell niche structured sections of different TM areas were performed using conventional histological staining and immunohistochemical analysis for Ki-67, Nestin, Tuj-I and Oct-3/4. Results: 333 eardrums of 207 mice were extracted, of which we were able to perform 25 explants. Enzymatic digestion produced a low viability and low cell proliferation in direct relation to the exposure time. In contrast explants techniques produced viability greater than 75% with confluence being reached more quickly and for most passes compared with collagenase. The best explants for primary cultures included the hammer and the annulus. In primary cultures cell with epithelial and fibroblast morphology were observed. The growth curves showed an average 3,54x105 cells in explants of hammer and annulus compared to 3.1x105 and 2.9x105 cells in the two explants that didn’t include annulus. The MTT showed proportional exponential proliferation to the time of cultivation and initial cell density. TM cells were negative for CD45, CD19 and cytokeratin, and positive for CD90, CD105, CD73, (mesenchymal markers) and Nestin and Ki67 (proliferation markers and immaturity). They were partially positive to CD34. The PCR was positive for Nanog, Slug and Nestin. Adipocyte differentiation was demonstrated by the presence of cell staining positive for Oil Red O. The osteocytic differentiation by calcium deposits Alizarin red, positive staining of alkaline phosphatase and immunofluorescence for osteopontin. Chondrocyte differentiation by collagen II was positive in immunofluorescence. Histological studies were positive for Ki-67, Nestin and Oct-3/4 and not to Tuj-I. Cells with characteristics of stem cells were found in the areas of thickening of the tympanic membrane near the handle of malleus and the annulus. Conclusions: Our data confirms the presence in the TM of immature progenitor cells with stem cell characteristics. TM stem cells are preferably located in the insertion of the handle of the malleus, and less frequently in the annulus. The optimum explants technique for obtaining efficient primary cultures should include hammer and annulus. The cells obtained from culture of TM identified in our study, have multipotential differentiation capacity to mesodermal cell lines and express a immunological phenotype compatible with the definition of mesenchymal stem cells accepted by the ISTC, so could be used in for cell therapy.

OBJETIVO. Elaborar e implementar una vía clínica de atención al paciente subsidiario de nutrición enteral domiciliaria en el Sistema Murciano de Salud. Tras su puesta en marcha se evalúan las mejoras en la calidad asistencial y en la contención del consumo de dietoterápicos en el Área Sanitaria I Murcia Oeste, así como el impacto del proyecto sobre el gasto regional en estos productos tras la generalización del procedimiento al resto de áreas. MÉTODO. Inicialmente se diseñó la vía y se llevaron a cabo los pasos necesarios para su aplicación, en fase de pilotaje, en el Área de Salud I Murcia Oeste. Posteriormente se procede a realizar un análisis prospectivo y descriptivo de 1.192 peticiones recibidas en la Unidad de Nutrición del Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca, mediante una serie de indicadores de calidad definidos en la Guía de Nutrición Enteral Domiciliaria publicada por el Ministerio de Sanidad y otros propios. Este estudio se realiza en un periodo inicial (2010), antes de la puesta en marcha del trabajo y en uno final (2013-2014), tras su completa instauración. Por otra parte se estudia la evolución del gasto en nuestra área y a nivel regional en nutrición enteral domiciliaria, antes y después de la implantación del nuevo protocolo de soporte nutricional. RESULTADOS. Existe un bajo cumplimento de ambos tipos de índices de calidad en el grupo de pacientes portadores de nutrición enteral domiciliaria antes de la implementación de la vía clínica que mejora significativamente cuando el control se lleva a cabo desde la unidad de nutrición. Por otro lado, en los años de aplicación del protocolo (2010-2014) se ha conseguido una importante contención acumulada del consumo de dietoterápicos tanto en nuestra área, donde asciende al 240% en envases y a los siete millones de euros en importe, como a nivel regional, con cifras del 126,58% (-244.096) en envases y más de 23 millones de euros en importe. En los dos últimos años se alcanza una meseta en ambas medidas de gasto. CONCLUSIÓN. El perfil de pacientes con soporte nutricional enteral domiciliario descrito en este estudio es similar a otras experiencias, aunque no totalmente comparables por las diferencias en los registros. Se ha revertido el desequilibrio existente en Murcia respecto al Sistema Nacional de Salud en consumo de productos dietoterápicos, y se han obtenido unos resultados sin precedentes en contención de gasto farmacéutico. Además, se ha logrado mejorar la calidad asistencial en este proceso en el Área de Salud I Murcia Oeste, estableciendo un circuito de coordinación centrado en las unidades de nutrición hospitalarias. / OBJECTIVE. To develop and implement a clinical pathway for subsidiary patients to home enteral nutrition support in the ‘Región de Murcia’ Health Service (Spain). After its implementation in a western area (Área I Murcia Oeste), improvements in the quality of care and containment consumption are evaluated, as well as the regional spending of these products after the expansion of the procedure to other areas. METHOD. Initially the pilot phase was designed for the western area of Murcia Health Service, in which the way and the bases for its implementation were established. Then, prospective descriptive analysis of 1,192 received petitions in the Nutrition Unit of the `Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca’ (Murcia) are analized following quality indicators defined in the Home Enteral Nutrition Guide published by the Ministry of Health and others defined for us. This study was performed in two periods, first in 2010, were the design was developed, and secondarily between 2013 and 2014, after complete compliance. Moreover, the changes in home enteral nutrition expenditure of our area and the rest of the region, before and after implementation of the new nutritional support protocol, are studied. RESULTS. Before implementation of the clinical pathway, the group of patients with home enteral nutrition sparsely meet both types of quality rates. These indicators improve significantly when control is carried out by the nutrition unit. In addition, during the application of the protocol (2010-2014) a significant accumulated restriction of containment consumption, both in our area, which reaches 240% in packaging and seven million Euros, as well as regional level, up to 126.58% in containers and tweinty-three million Euros. In the last two years of the study, a plateau is reached in both spending measures. CONCLUSION. The profile of patients with home enteral nutritional support described in this study is similar to other experiences, albeit not entirely comparable because of the differences in the records. The Imbalance of products consumption has been reversed in Murcia compared to the National Health Service, and we have obtained unprecedented results in containment of pharmaceutical expenditure. In addition, quality of care has been improved in the western area of `Región de Murcia’ Health Service, establishing a circuit coordinated by the Hospital Nutrition units.

por compendio / La anguila europea (Anguilla anguilla) se encuentra en un estado de conservación vulnerable debido a múltiples causas antropogénicas y naturales, entre las que adquieren gran importancia las infecciones parasitarias. Esto motivó el interés por describir la composición y estructura de la comunidad de helmintos de las anguilas del Mar Menor, laguna costera hipersalina en el sureste de la Península Ibérica, con particular atención al nematodo invasor Anguillicoloides crassus. Asimismo, se determinó el impacto de esta comunidad parasitaria en la aptitud ecológica de la población de anguilas de esta laguna. Se realizó la necropsia a 298 anguilas capturadas entre los años 2008 y 2010 en el Mar Menor. Se calcularon índices epidemiológicos (prevalencia, abundancia e intensidad media) para las diferentes especies parasitarias identificadas, así como índices ecológicos (riqueza específica, diversidad y dominancia) aplicados tanto a la comunidad como a la infracomunidad intestinal. Asimismo, se evaluó la aptitud ecológica de las anguilas mediante el empleo de tres aproximaciones, i) la condición corporal, calculada a partir del índice de masa escalada, ii) la asimetría fluctuante observada entre diferentes medidas de estructuras anatómicas pares y iii) el índice somático del bazo. Finalmente, se relacionó dicha aptitud ecológica con la riqueza parasitaria específica y con la intensidad individual de las especies de parásitos más prevalentes. Los resultados de nuestros estudios indican que la helmintofauna de esta población está compuesta por dos trematodos digeneos (Deropristis inflata y Bucephalus anguillae), dos nematodos (Contracaecum sp. y A. crassus) y dos plerocercoides de la familia Proteocephalidae. La infección de A. crassus en anguilas del Mar Menor está estabilizada en valores mínimos, ya que la prevalencia se mantuvo estable en torno al 3%, durante los 3 años en los que se llevaron a cabo estos estudios, lo que se puede atribuir a la ausencia de hospedadores intermediarios. Se observó una mayor prevalencia de parasitación total (93%) en las anguilas del Mar Menor en comparación con las descritas en hábitats semejantes. El 99.99% de los parásitos aislados pertenecían a especies eurihalinas o típicas de hábitats salobres (D. inflata, B. anguillae, Contracaecum sp.), mientras que tan sólo el 0.1% de los mismos eran especies parasitarias frecuentes en aguas continentales (A. crassus y los cestodos de la familia Proteocephalidae). Cabe destacar, que éste último porcentaje es muy inferior al detectado en otros estudios realizados en ecosistemas salinos y salobres, relacionándose con la permanente hipersalinidad del Mar Menor. Como ocurre en otras lagunas costeras, los dos trematodos especialistas (D. inflata y B. anguillae) fueron las especies más prevalentes y abundantes, siendo la primera la especie dominante en la comunidad y en la infracomunidad. El estudio de la estructura de la comunidad de helmintos demostró que el máximo número de especies de parásitos por anguila no excedió de cuatro, y tanto la riqueza específica de la comunidad (seis especies) como la diversidad (índice de Shannon-Wiener = 0.71) fueron bajas, al igual que se describe en otras lagunas hipersalinas. De esta manera, nuestros resultados corroboran que las comunidades de parásitos de anguila europea que habitan lagos costeros mediterráneos son similares en composición y estructura, aunque se pueden diferenciar características específicas de cada ecosistema, basadas en sus distintos grados de salinidad. Finalmente, se evidenció que la relación entre los índices ecológicos empleados para medir la aptitud ecológica y la riqueza parasitaria específica y la intensidad individual de las especies de helmintos fue positiva. Asimismo, se observó que la condición corporal de las anguilas no se ve negativamente afectada a pesar de que la intensidad y la riqueza específica aumenten. No obstante, esta parasitofauna sí provoca una mayor asimetría fluctuante y un ligero incremento del índice somático del bazo. Todo lo anterior parece indicar que los trematodos digeneos y Contracaecum sp. han coevolucionado con la anguila europea y por ello parecen ser tolerados por esta especie, a la que ocasionan escasos daños / European eel population is considered critically endangered in the IUCN red list. Decline in eel recruitment has been associated to a combination of multiple natural and anthropogenic causes, including parasite infections. Therefore, the aim of this study was to determine the helminth community composition and structure of the European eel population from Mar Menor, as well as describe their infra-community, with particular attention to the invasive nematode A. crassus. In addition, the impact of the parasite community on the ecological fitness of this eel population was determined. From 2008 to 2010 a total of 289 eels were captured in Mar Menor, a coastal permanent hypersaline lagoon located on the southeast of the Iberian Peninsula. A detailed parasitological study of eels was performed, and prevalence, abundance and intensity for each parasite species were calculated, as well as parasite richness, diversity and dominance, all determined at community and infra-community levels. Additionally, eel’s ecological fitness was evaluated using (1) body condition calculated from somatic mass index (SMI), (2) fluctuating asymmetry (FA) and (3) the spleen somatic index (SSI). Finally, the helmintofauna effect on these eel’s ecological fitness was estimated. The following parasites species were isolated from Mar Menor eels: Deropristis inflata and Bucephalus anguillae (digeneans), Contracaecum sp. and Anguillicoloides crassus (nematodes) and two Proteocephalidae plerocercoids (cestodes). Prevalence of parasitic infection in this study was 93%, the highest record described in similar habitats. Most of the isolated helminths (99.9%) were euryhaline or brackish waters species, while only the 0.01% of the isolated parasites were common freshwater species (A. crassus and Proteocephalidae larvae). This value was much lower than the ones registered in other brackish and marine ecosistems, probably due to the permanent hipersalinity of Mar Menor. Deropristis inflata and B. anguillae, both of them eel specialist trematodes, were the most prevalent and most abundant species of helminths, as reported in other coastal lagoons. Moreover, D. inflata was the dominant species at both community and the infra-community levels. The study of the helminth community structure revealed that the maximum number of parasitic species per eel was four. In this sense, parasite richness (six species) and diversity (Shannon-Wiener index = 0.71) were low, as previously described for other saline lagoons. Our results provided further evidence of the similar composition and structure of helminth communities between eels from different coastal lagoons; however, salinity-dependent singularities were also found and could reflect the life history of individual eels. On the other hand, a positive relationship between parasite intensity and richness and ecological fitness measures was described. Furthermore, the increase of parasite intensity and richness did not seem to damage Mar Menor eels’ body condition; however, parasitism was associated to an increment of the FA and the slight raise in spleen somatic index. These minimum costs suggest that both trematodes and Contracaecum sp. coevolved with the European eel, and eels inhabiting the Mar Menor tend toward these parasites tolerance. Finally, our studies demonstrated that A. crassus infection is stabilized at minimum values in Mar Menor eel population since a low prevalence (around 3%) has been maintained along last three years, probably due to the absence of intermediate hosts in this habitat.

Objetivos: Estudiar in vitro el efecto sobre la viabilidad y la proliferación celular de los compuestos: extracto de semilla de uva (flavan-3-oles polímeros de catequinas), extracto de cacao (flavan-3-oles epicatequinas), extracto de pomelo (glicósidos de flavanonas naringina y neohesperidina), extracto de piel de limón (glicósido de flavanona eriocitrina), naringenina (flavanona), apigenina (flavona) y apigenina potásica. Así mismo estudiar la influencia de estas sustancias sobre el ciclo celular y la apoptosis de las líneas celulares Vero y Ca-Co2. Material y Métodos: Los compuestos fueron ensayados sobre la línea celular no tumoral Vero (túbulo renal de mono verde africano) y la línea celular tumoral CaCo-2. Utilizamos el test de MTT con diferentes concentraciones de los extractos. Todo ello junto con el conocimiento de la composición cromatográfica de cada extracto nos permitió hallar posibles relaciones entre la estructura molecular y su efecto en la proliferación celular. Resultados: En las condiciones de nuestro estudio, no hallamos efecto negativo significativo sobre la proliferación celular en ninguno de los extractos testados a concentraciones inferiores a 10 μM en la línea celular Vero. Podría establecerse como orden de actividad antiproliferativa de las estructuras flavonoides estudiadas: flavan-3-ol > flavanona > flavona. Sobre la línea transformada CaCo-2, todos los extractos estudiados mostraron efecto antiproliferativo y/o citotóxico, sobre todo apigenina potásica. Sobre la línea Vero apigenina potásica y extracto de semilla de uva, provocaron un mayor bloqueo del ciclo celular. Y sobre la línea CaCo-2, extracto de piel de limón y de cacao. El análisis del porcentaje de población celular que se encontraba en apoptosis mostró unos valores en general muy bajos en relación a la población total analizada en la línea celular Vero. Sin embargo, sobre CaCo-2, consideramos especialmente relevantes los resultados obtenidos por la flavona apigenina potásica, que mostró una capacidad apoptótica significativa a partir de las 72 horas de tratamiento. Conclusión: Las estructuras moleculares más complejas y de mayor peso molecular causan mayores efectos antiproliferativos, y parecen influir más sobre el ciclo celular y la apoptosis. / Introduction: Molecular structure is a very important factor in relation of any substances with cells or biological system. Objective: Present study is an in vitro research about the viability and proliferation activity of following products and extracts: grape seed extract (flavan-3-ols catechins polymers), cocoa extract (flavan-3-ol epicatechins), grapefruit extract (flavanones glycosides naringin y neohesperidin), skin lemon extract (flavanone glycoside eriocitrin), naringenin (flavanone), apigenin (flavone). Also study the influence of these extracts on cellular cycle and apoptosis on Vero and CaCo2. Material and Methods: We have study the different extracts and products effects concentrations on Vero cells proliferation and CaCo-2 cells culture, using the MTT assay. It together with the knowledge of the chromatographic composition of every extract of the experiment allows us to find relations between structures or molecular skeletons and his effect on the cellular proliferation. Results: In our study conditions, we have not negative effect on cellular proliferation with all the extracts, on concentrations lower than 10 µMa on Vero. The order in antiproliferative capacity could be: flavan-3-ol > flavanone > flavone. On CaCo-2, all the extracts showed antiproliferative effect or citotoxicity especially apigenine. On Vero apigenine and grape fruit seed, showed the best arrest in cell cycle. On CaCo-2, citrus and cocoa were he most significant. Cellular population percentage analyses, in apoptosis were very low regarding the total population in Vero. But, on CaCo-2, we considered relevant results on Apigenine, which showed an important apoptotic capacity after 72 hours. Conclusion: We have found the more complex molecular structures it provokes antiproliferative activity increase. This fact would interact in relationship between cell and environment.

Objetivos: (i) Esbozar una imagen general del metabolismo central de C. salexigens a partir de la información del genoma, (ii) determinar los principales flujos extracelulares (asimilación de carbono, excreción de subproductos) y de síntesis de sus solutos compatibles, las ectoínas, y analizar el efecto de la salinidad sobre dichos flujos empleando fuentes de carbono marcadas isotópicamente, (iii) estudiar el efecto de la composición del medio (en términos de ratio C/N y tipo de fuente de nitrógeno) sobre los flujos metabólicos, síntesis de ectoínas/biomasa y excreción de subproductos y aplicar esta información en el diseño de una estrategia de cultivo que maximice la producción de biomasa/ectoínas, (v) analizar el efecto del uso de fructosa como fuente de carbono sobre la fisiología de C. salexigens y (vi) identificar las rutas de consumo de fructosa y demostrarlas experimentalmente. Metodología: Se aplicó HPLC para identificación y cuantificación de metabolitos y ectoínas, 13C-RMN para cuantificación de ectoínas y rastreo de marcaje isotópico y 31P-RMN para medida de actividad enzimática en extractos crudos. Se usaron métodos espectrofotométricos para medida de actividades enzimáticas (en extractos crudos y en proteínas purificadas). Se aplicó RT-PCR en determinaciones de expresión génica y técnicas de biología molecular en la clonación y expresión heteróloga de genes de C. salexigens en E. coli. Resultados: Se llevan a cabo cultivos crecidos en glucosa a diferentes salinidades que muestran una menor eficacia metabólica a baja salinidad, en forma de metabolismo overflow (excreción de piruvato y acetato), menor síntesis de biomasa y mayor velocidad de consumo de glucosa. Los estudios con glucosa marcada con 13C indican que i) C. salexigens carece de ruta glucolítica funcional, metabolizando la glucosa casi exclusivamente mediante la ruta de ED, debido a la probable falta de una enzima Pfk funcional, ii) el nivel de anaplerosis es alto en comparación con microorganismos relacionados, iii) algunos flujos relativos clave del metabolismo central no se alteran con la salinidad, lo que implica una rigidez metabólica que podría justificar la presencia de overflow a baja salinidad. En cultivos con distintas ratios C/N, se observa un mayor nivel de overflow en ratios C/N altas (fuente de nitrógeno limitante). La eficacia en síntesis de ectoínas es mayor en medio con menor cantidad de fuente de carbono (glucosa) y de nitrógeno (amonio). Estos resultados se aplican al diseño de una estrategia de cultivo fed-batch en dos fases, con la que se consigue alcanzar alta densidad celular y eliminar el overflow. La ratio C/N no afecta a las ratios de flujos centrales confirmando la rigidez metabólica. En cultivos con fructosa como fuente de carbono se observa la ausencia de overflow y mayor síntesis de biomasa. El empleo de fructosa marcada con 13C confirma la presencia de dos rutas para el catabolismo de la fructosa en C. salexigens: la ruta de ED, mayoritaria, y la ruta de EMP que contribuye en un 15-20% del flujo. Conclusiones: La glucólisis no es funcional debido a la carencia de Pfk, y la glucosa se asimila mediante la ruta de ED, más eficaz en producción de NADPH; existe un alto nivel de anaplerosis. Estos datos apuntan a una adaptación al gran esfuerzo anabólico para síntesis de ectoínas. El metabolismo central del carbono es rígido, sus flujos relativos no varían con la salinidad, ni con la proporción C/N en el medio. Esta rigidez hace el metabolismo menos eficiente en medios pobres en fuente de nitrógeno y con baja salinidad. Esto indica una adaptación a ambientes pobres en nutrientes. Las condiciones en las que el metabolismo es menos eficiente dan lugar a un menor crecimiento, y la aparición de metabolismo overflow. C. salexigens metaboliza la fructosa mediante dos rutas: las rutas de ED y EMP. ED es mayoritaria, debido a las altas necesidades de cofactores reducidos. La disponibilidad adicional de la ruta de EMP hace al metalismo en fructosa más eficiente que en glucosa, lo que se traduce en ausencia de overflow en fructosa, y mayor síntesis de biomasa. / Objectives: (i) Drawing a draft of central metabolism from C. salexigens based on the annotated genome, (ii) assessing the main extracellular fluxes (carbon source uptake, by-products excretion) and the synthesis of the main compatible solutes, ectoines, and analyzing the effect of salinity on such fluxes using isotopically labeled carbon sources, (iii) studying the effects of medium composition (as C/N ratio and nitrogen source) on metabolic fluxes, biomass/ectoines synthesis and by-products excretion and applying this information to devise a culture strategy able to maximize biomass/ectoines production, (v) analyzing the effect of fructose as carbon source on the C. salexigens physiology and (vi) identifying the pathways for fructose uptake and give experimental evidence of them. Methodology: HPLC was applied to identify and quantify metabolites and ectoines, 13C-NMR for ectoines quantification and isotopic label tracing and 31P-NMR for assessing enzyme activities on crude extracts. Spectrophotometric methods were applied for measuring enzyme activities (both in crude extracts and purified proteins). RT-PCR was used in gene expression experiments and molecular biology techniques for cloning and heterologous expression of genes from C. salexigens in E. coli. Results: Glucose grown cultures were performed at different salinities, showing a less efficient metabolism at low salinity as overflow metabolism (pyruvate and acetate excretion), lower biomass synthesis and higher glucose uptake rate. Studies using 13C-labeled glucose show that i) C. salexigens lacks a functional glycolytic pathway, and metabolizes glucose almost exclusively through ED pathway, which is likely due to the lack of Pfk enzyme, ii) high anaplerosis levels, compared to related microorganisms, iii) certain key flux ratios from central metabolism were not affected by salinity, involving a metabolic rigidity which could explain the presence of overflow at low salinity. Higher overflow levels are shown by cultures grown on a higher C/N ratio (limiting nitrogen source). Ectoines synthesis yield is higher when growing in media with low carbon (glucose) and nitrogen (ammonium) sources content. These results are applied to devising a two-step fed-batch culture strategy, which allowed reaching high cell density and overflow removal. C/N ratio did not affect central metabolism flux ratios, further confirming the metabolic rigidness. Lack of overflow and higher biomass yields are shown by fructose grown cultures. Using 13C-labeled fructose confirmed the existence of two alternative pathways for fructose uptake in C. salexigens: ED pathway which contributes to 80-85% of fructose uptake flux, and EMP pathway for the remaining part of carbon flux. Conclusions: Glycolysis is not present due to lack of Pfk enzyme, thus, glucose must be assimilated through ED pathway, which is more efficient in NADPH production; anaplerosis is relatively high. These results suggest C. salexigens has adapted to meet the high biosynthesis needs posed by salinity. Central metabolism is rigid, as central flux ratios were not affected by salinity or C/N ratio in growth medium. Such rigidity makes metabolism less efficient in low nitrogen and low salinity growth media. This could be understood as an adaptation to grow in nutrient-poor environments. Environmental conditions where central metabolism is less efficient lead lower growth yield due to overflow metabolism. C. salexigens can metabolize fructose by means of two different routes: ED and EMP pathways. Most of fructose is assimilated by ED pathway, due to high cofactor synthesis needs. The availability of an additional EMP route makes fructose metabolism more efficient than glucose metabolism, resulting in lack of overflow and higher biomass yields in fructose.

La otitis media crónica en humanos es una afectación del oído medio que se presenta de distintas formas clínicas, siendo la más frecuente la perforación timpánica. Esta entidad es una solución de continuidad del tímpano y su tratamiento consiste en una intervención denominada miringoplastia. Otro tipo de otitis media crónica es la otitis seromucosa, descrita como la acumulación de contenido mucoso en oído medio. Su tratamiento consiste en el drenaje del moco y la colocación de una prótesis transtimpánica para mantener abierta la perforación (miringotomía) realizada. La gran variedad de materiales utilizados en la miringoplastia es evidencia de que los resultados no son satisfactorios y por ello se mantiene abierta la investigación sobre nuevas alternativas de andamiajes biológicos que pudieran facilitar la cicatrización, como la membrana amniótica. Para ello necesitamos un modelo animal con cronificación de perforación timpánica. En nuestra revisión de la literatura encontramos estudios que conseguían la cronificación de las perforaciones timpánicas mediante la realización de miringotomías con láser y la aplicación de hidrocortisona o mitomicina C, siendo esta última un citostático que se ha utilizado para retrasar la cicatrización en diversas patologías de oftalmología y otorrinolaringología. Debido a que el láser no está disponible habitualmente en los laboratorios de investigación, se decidió desarrollar un modelo de cronicidad de perforación timpánica mediante miringotomías incisionales con mitomicina C. Se ha realizado un ensayo prospectivo analítico con 34 ratas machos Sprague Dawley, con un peso medio de 331.4 gramos, distribuídas en tres grupos: A, B y C. El grupo A formado por 10 ratas a las que se les ha realizado una miringotomía con amputación del mango del martillo y aplicación posterior de mitomicina C (0.4 mg/ml) a los oídos izquierdos (brazo A1) y solución salina (0.9%) a los oídos derechos (brazo A2). El grupo B lo constituían 12 ratas divididas en 4 brazos, dos brazos (B1 y B2) formados por 10 oídos cada uno, a los que se les aplicó mitomicina C antes de las miringotomías sin amputación de los mangos de los martillos (B1) y con amputación (B2). Los 4 oídos restantes de este grupo fueron tratados con solución salina previamente a la miringotomía, dos sin amputación de los mangos de los martillos (B3) y otros dos con amputación (B4). El grupo C formado por 12 ratas estaba estructurado igual que el grupo B, pero se les añadió dexametasona (4mg/ml) en las cuatro primeras revisiones de los brazos C1 y C2 y se aplicó solución salina en las mismas revisiones de los brazos C3 y C4. Los resultados muestran una duración media de las perforaciones en los oídos tratados con solución salina de 8.3 días. Los oídos tratados con mitomicina C tuvieron una duración media de las perforaciones de 18.6 días el grupo A, 15.1 días el grupo B y 112.7 días el grupo C. No obtuvimos diferencia entre realizar miringotomía con amputación del mango del martillo o sin amputación, como tampoco la hubo entre aplicar la mitomicina C antes o después de la miringotomía. Sí hubo diferencia significativa entre las perforaciones tratadas con mitomicina C y las tratadas con solución salina y también entre las tratadas con mitomicina C sola y con mitomicina C asociada a dexametasona. Como la cronicidad de las perforaciones timpánicas en animales se establece a partir de 8 semanas, podemos considerar como modelo murino de perforaciones timpánicas crónicas cuando aplicamos mitomicina C previamente a la miringotomía incisional y asociamos dexametasona. La duración de las perforaciones timpánicas en nuestro modelo, mayor de 3 meses, justificaría promover ensayos para estudiar este método como tratamiento de las otitis seromucosas, sin utilizar drenajes transtimpánicos. / Chronic otitis media in humans is an affectation of the middle ear that occurs in different clinical forms, the most frequent of them is eardrum perforations. This entity is an integral part of the tympanic membrane and its treatment is a procedure called myringoplasty. Another type of chronic otitis media is otitis media with effusion which is described as the accumulation of mucus in the middle ear. Treatment consists on draining the mucus and placing a transtympanic prosthesis to hold the previously made drilling (myringotomy) open. The great variety of materials used in the myringoplasty is evidence that the results are unsatisfactory and therefore research into new alternatives for biological scaffolds that may promote healing, such as amniotic membrane remains open. For this, we need an animal model with chronicity of perforated eardrum. In our review of the previous research, we have found studies that could get the chronicity of the tympanic perforations by conducting laser myringotomy and applying hydrocortisone or mitomycin C, the latter being a cytostatic that has been used to delay healing various diseases in ophthalmology and otolaryngology. Due to the fact that a laser is not routinely available in research laboratories, it was decided to develop a model of chronic tympanic perforation by incisional myringotomy with mitomycin C. We performed a prospective analytical trial with 34 male Sprague Dawley rats with an average weight of 331.4 grams, divided into three groups: A, B and C. Group A consisted of 10 rats which have undergone a myringotomy with amputation of the handle of the hammer and subsequent application of mitomycin C (0.4 mg / ml) to the left ears (subgroup A1) and saline solution (0.9%) to the right ears (subgroup A2). The B group were 12 rats divided into 4 subgroups, two of them (B1 and B2) formed for 10 ears each, which were applied mitomycin C before myringotomies without amputation of the handles of the hammers (B1) and with amputation (B2). The remaining 4 ears of this group were treated with saline prior to myringotomy , two of them without amputation of the handles of the hammers (B3) and the other two with amputation (B4). The C group of 12 rats was structured like the B group, but dexamethasone (4 mg / ml) was added in the four first reviews of the C1 and C2 subgroups and saline in the same revisions of the C3 and C4 subgroups. The results show an average duration of the drillings in the ears treated with saline of 8.3 days. Ears treated with mitomycin C had an average duration drillings of 18.6 days in group A, group B 15.1 days and 112.7 days group C. There was no significant difference between performing myringotomy obtained with or without amputation of the hammer handle, nor was there when appliying mitomycin C before or after myringotomy. But there was a significant difference between those drillings treated with mitomycin C and those treated with saline and also between the drillings treated exclusively with mitomycin C and those treated with mitomycin C together with dexamethasone. As the chronicity of the tympanic perforations in animals is set from 8 weeks, we can consider murine model of chronic tympanic perforations when applying mitomycin C prior to incisional myringotomy and associate dexamethasone. The duration of the tympanic perforations in our model, greater than 3 months, would justify to increase trials to study this method for the treatment of otitis media with effusion without using ear tubes.

La osteoporosis y la artrosis son enfermedades cada vez más prevalentes en nuestro medio debido al aumento de la esperanza de vida, estando muy influenciadas por factores ambientales y genéticos. El objetivo de este estudio fue determinar la implicación de algunos mecanismos epigenéticos en estas enfermedades, mediante el análisis de expresión de microRNAs. Hemos analizado los microARNs en muestras de hueso de sujetos con osteoporosis (n=8) y artrosis (n=8), determinando las diferencias de expresión en los microRNAs mediante arrays. Encontramos diferencias significativas entre los grupos en 9 de los microARNs analizados. Estos resultados fueron validados en un segundo análisis en el que incluimos muestras de hueso de sujetos con osteoporosis (n=19), artrosis (n=19) y controles (n=6). Analizamos la expresión de aquellos microARNs más destacados en los arrays, que fueron miR-187, miR-193a-3p, miR-210, miR-214 y miR-518f. Había una mayor expresión de miR-518f en pacientes con osteoporosis frente a controles y artrosis, mientras que miR-187 mostraba una mayor expresión en artrosis que en controles y pacientes con osteoporosis. Aunque no hemos podido confirmar en cultivos celulares la funcionalidad de estos microARNs, estos resultados sugieren que miR-518f y miR-187 pueden estar implicados en la patogenia de algunas alteraciones esqueléticas como la osteoporosis y la artrosis / The prevalence of osteoporosis and osteoarthritis is increasing in parallel with the increased life expectancy. They are determined by the interplay of environmental and genetic factors. The aim of this study was to determine how epigenetic mechanisms are involved in these diseases, and specifically the analysis of expression of microRNAs. We measured microRNAs in bone samples of patients with osteoporosis (n=8) and osteoarthritis (n=8), using mini-arrays. Significant between group differences were found in 9 of the microRNAs analyzed. These findings were replicated in a second analysis that included bone samples from subjects with osteoporosis (n=19), osteoarthritis (n=19) and controls (n=6). In the replication stage we analyzed the expression of the microRNAs showing the most significant differences in arrays: miR-187, miR-193a-3p, miR-210, miR-214 and miR-518f. We found that miR-518f displayed a significantly higher expression in patients with osteoporosis. On the other hand, miR-187 displayed a signifciantly higher expression in patients with osteoarthritis. Although we could not confirm the functional effects of these microARNs in vitro, our data suggest that miR-518f and miR-187 may participate in the pathogenesis of skeletal disorders, such as osteoporosis and osteoarthritis.

Esta tesis justifica, desde un marco teórico, la necesidad de adaptar, para la población infantil y adolescente española, un cuestionario sobre la emoción de la alegría, como es el Stait-Trait Cheerfulness Inventory for Kids (STCI for Kids de Hösli, Sommers& Ruch, 2006). Se especifica una definición de alegría, intentando salvar las dificultades existentes, dentro de la comunidad investigadora. Se parten de los siguientes objetivos generales: en primer lugar el objetivo es traducir, retrotraducir y adaptar el Inventario Estado Rasgo de Alegría (STCI, Hösli & Sommers, 2006) al castellano y comprobar si resulta un instrumento psicométricamente adecuado que permita la medida de esta capacidad humana y en segundo lugar el objetivo es comprobar la relación existente entre los factores Alegría, Seriedad y Mal humor, y el factor Ansiedad, tanto estado como rasgo. OBJETIVOS GENERALES: 1. El primer y principal objetivo de esta investigación es traducir, retrotraducir y adaptar el Inventario Estado Rasgo de Alegría (STCI, Hösli & Sommers, 2006) al castellano y comprobar si resulta un instrumento psicométricamente adecuado que permita la medida de esta capacidad humana. 2. Un segundo objetivo es comprobar la relación existente entre los factores Alegría, Seriedad y Mal humor, y el factor Ansiedad, tanto estado como rasgo. Para la traducción del cuestionario se siguió el método de traducción-retrotraducción con panel de profesionales, la ayuda de dos personas bilingües, con el fin de determinar las posibles modificaciones, según marcan las directrices del Comité Internacional de Tests (ITC). Se han utilizado las dos versiones, estado y rasgo, traducidas al español a partir de la versión en inglés, del Inventario de Alegría Estado-Rasgo, así como los cuestionarios de ansiedad STAIC y STAI. Los resultados fueron obtenidos a partir de diferentes técnicas estadísticas, y todos los análisis estadísticos se han realizado con el paquete estadístico SPSS 19.0. • Como resultado podemos decir que: las partes que evalúan Alegría y Mal humor en el STCI-T<30>, se muestra más fiable y valida que en los estudios originales. La Seriedad en el STCI-T<30>, se muestra menos fiable y válida. • Los factores en el STCI-S<20>, son fiables y válidos. • Los niños están más predispuestos para la Alegría, más que para la Seriedad y el Mal humor. • La Alegría como rasgo es lo que hace que nos recuperemos antes de una situación de Mal humor o de Seriedad. • Los factores, estado y rasgo, tienen una fuerte relación entre sí. No existe relación entre los estados de Alegría y la prevalencia de estados serios. Alegría estado y rasgo se relaciona negativamente con ansiedad estado y rasgo.La Alegría puede hacer que la ansiedad disminuya. La Seriedad y el Mal humor, estado-rasgo, se relacionan positivamente con ansiedad estado-rasgo. Seriedad y Mal humor pueden influir positivamente en la activación de la ansiedad. / This thesis justifies, from a theoretical framework, the need to adapt, for the Spanish child and adolescent population, a questionnaire on the emotion of cheerfulness, as it is the State-trait Cheerfulness Inventory for Kids (STCI for Kids of Hösli, Sommers & Ruch, 2006). Specifies a definition of cheerfulness, trying to save the existing difficulties, within the research community. Depart from the following general objectives: first of all, the objective is to translate, retrotraducir and adapt the inventory feature state of cheerfulness (STCI, Hösli & Sommers, 2006) Spanish and check if an instrument adequate psychometrically that allows measurement of this human capacity and secondly is the objective is to check the relationship between factors, Serious and moodiness, and the anxiety factor, both State as a feature. GENERAL OBJECTIVES: 1. The first and main goal of this research is to translate and adapt the inventory feature state of cheerfulness (STCI, Hösli & Sommers, 2006) Spanish and check if it is an instrument adequate psychometrically that allows the measurement of this human capacity. 2. A second objective is to check the relationship between cheerfulness, seriousness and bad mood factors, and both State and trait anxiety factor. For the translation of the questionnaire was followed the method of translation-retrotranslation with panel of professionals, the help of two bilingual people, in order to determine any modifications, as they mark the guidelines of the international testing Committee (ITC). Both versions, State and trait, translated into the Spanish from the English version, of the cheerfulness State-trait inventory, as well as anxiety questionnaires STAIC and STAI have been used. The results were obtained from different statistical techniques, and all the statistical analysis was performed using the statistical package SPSS 19.0. • As results we can say that: Parties assessing cheerfulness and bad mood the STCI-T < 30 >, it shows more reliable and valid than in the original studies. The seriousness of the STCI-T<30>, shown less reliable and valid. • Factors in the STCI-S < 20 >, are reliable and valid. • Children are more predisposed to cheerfulness, more than for the seriousness and the bad mood. • Cheerfulness as a feature is what makes us recover before a situation in a bad mood or seriousness. • Factors, State and trait, have a strong relationship between them. There is no relationship between the States of cheerfulness and the prevalence of serious States. cheerfulness State and trait is negatively related to anxiety State and trait. cheerfulness can do that the anxiety decreases. The seriousness and the bad mood, state-trait, are positively related to anxiety state-trait. Serious and moodiness can positively influence the activation of anxiety.

El objetivo de la presente tesis fue investigar el efecto de la luz de diferente longitud de onda y el fotoperiodo durante el desarrollo temprano, el ritmo de eclosión y la actividad locomotora de larvas de pez cebra. Además, el estudio de un sincronizador adicional (alimento) con diferente periodo permitió evaluar los ritmos de alimentación en dos especies. Finalmente, se describió en el pez cebra adulto los ritmos diarios de genes implicados en la diferenciación sexual. Objetivos Específicos 1 Determinar la ontogenia de la expresión de genes reloj (clock1, bmal1, per1b, per2, dbp) larvas de zebrafish sometidos a ciclos de luz-oscuridad de 12:12 horas, y diferente espectro (LDW, LDB, LDR, DD). 2 Investigar la influencia de varias condiciones de iluminación de diferente longitud de onda, sobre la ontogenia de la actividad locomotora de larvas de pez cebra. 3 Determinar el efecto de los cambios de iluminación de diferente espectro de luz (LDW, LDB, LDR) sobre la actividad locomotora de larvas de zebrafish y la presencia de foto receptores capaces de mediar la respuesta a la luz. 4 Describir la existencia de ritmo de eclosión y la sincronización de embriones a diferentes ciclos de luz (LD, DL1, DL2, LL, DD). 5 Evaluar la existencia de actividad anticipatoria a la comida cuando proporcionada de manera periódica en el pez cebra y el pez hipogeo bajo condiciones oscuridad continua y la capacidad de re-sincronización y la presencia de desplazamientos progresivos de la fase. 6 Describir la variación diaria en la expresión de genes involucrados en la diferenciación sexual en macho y hembra de pez cebra adultos. Metodología 1 Los embriones se mantuvieron en condiciones de LD 12:12 horas LDW (blanco), LDB (azul) and LDR (rojo). Las larvas se muestrearon el 0,3,7 dpf a ZT3,9,15,21,3. Se extrajo el ARN y se medio la expresión de los genes con qPCR. 2 Embriones fueron mantenidos en LDW, LDB, LDR. Las larvas se grabaron con una cámara y los videos analizados con un software de seguimiento. 3 Larvas mantenidas bajo LDW, LDB, LDR fueron grabada hasta el 11 dpf con una cámara. El 3 dpf se muestrearon y se analizó la existencia de expresión de los genes con PCR. 4 Embriones bajo LD,DL1,DL2,LL y DD a 28°C. Fueron visualizado cada dos horas para calcular la tasa de eclosión 5 Pez cebra y pez de cueva en DD fueron alimentados en manera periódica con comederos automáticos. Se utilizaron fotocélulas de rayo infrarrojo para la grabación de la actividad locomotora y el software “el Temps” para la representación de los datos. 6 Machos y hembras en ciclo LD 12:12, y 28 ºC, fueron muestreados durante un día ZT2,6,10,14,18,22. cerebro y gónadas, Se midieron lo genes de interés en cerebro y gónadas con qPCR. Conclusiones. 1 La ontogenia de la expresión de los genes reloj se desarrolla de manera diferente dependiendo de los ciclos de luz y también de la longitud de onda. Los genes del bucle negativo (per1b and per2) parecen desarrollar antes la ritmicidad, durante el desarrollo, respeto a aquellos del bucle positivo (clock and bmal) que no resulta dependiente de la luz. 2 La actividad locomotora está influenciada por los ciclos de luz, no mostrando ninguna ritmicidad bajo oscuridad continua. El diferente espectro de la luz influye en el inicio de la ritmicidad de las larvas a diferentes momentos. 3 El incremento de la actividad locomotora debido al cambio de iluminación de los ciclos de luz y del diferente espectro está relacionado con la presencia de varios fotorreceptores no visuales presentes desde el día 3 dpf. 4 La eclosión del pez cebra tiene un ritmo diario y está sincronizada a los ciclos de luz-oscuridad. La fase de este ritmo depende del tipo de ciclo de iluminación. 5 La actividad de anticipación al alimento es de origen endógeno en las dos especies. El pez cebra tiene una elevada plasticidad en el encarrilamiento de su ritmo a ciclos de comida de periodo diferente de 24 horas y presenta resincronización gradual tras retrasar la hora de alimentación. 6 La expresión de genes involucrados en la diferenciación sexual en adultos varia durante el día y la fase depende del ciclo de luz y del sexo. / Summary of Doctoral Thesis entitled “Impact of lighting conditions and feeding cycles on rhythms of early development, behaviour and sexual differentiation in zebrafish Danio rerio”. The aim of the present thesis was to investigate the effect of light of different wavelength and photoperiod on early development, hatching rhythms and locomotor activity of zebrafish larvae. Morover, the study of an additional zeitgeber (food) permitted to evaluate the feeding rhythms synchronized to different feeding period in adult zebrafish and cavefish blind specie. Finally we aims to describe in adult zebrafish, the daily rhythms of genes involved on sexual differentiation. In the present Doctoral thesis the specific objectives were established: 1 To determine the ontogeny of zebrafish larvae clock genes expression (clock1, bmal1, per1b, per2 dbp) under light-dark cycle of 12:12 hours and different spectrum (LDW, LDB, LDR, DD). 2 To investigate the influence of several lighting conditions of different wavelength on the ontogeny of locomotor activity of zebrafish larvae. 3 To determine the effect of illumination changes of different light spectrum (LDW, LDB, LDR) on locomotor activity of zebrafish larvae and the presence of photo receptors capable to mediate the response to light. 4 To describe the existence of hatching rhythms and embryo synchronization to different light cycle (LD, DL 1, DL2, LL, DD). 5 To evaluate the existence of feeding anticipatory activity when food is periodically provided in zebrafish and cavefish under continuous dark conditions. Evaluate the ability of the fish to re-synchronize when feeding time is delayed. 6 To describe the daily variation in the expression of genes involved in sexual differentiation into male and female zebrafish adults. Methodology 1. Embryos were maintained under LD 12:12 LDW (white), LDB (blue) and LDR (red). Larvae were sampled at 0,3,7 dpf and different time point ZT3,9,15,21. RNA was extracted and the gene expression analyzed with qPCR. 2. Embryos were kept in LDW, LDB, LDR. The larvae were recorded with a video camera and analyzed with specialized tracking software. 3. The larvae kept under LDW, LDB, LDR were recorded until 11 dpf with a camera. At 3 dpf were sampled and the presence of gene expression analyzed by PCR. 4. Embryos under LD, DL, DL, LL and DD at 28 ° C. They were visually analyzed every two hours to calculate hatching rate. 5. Zebrafish and cavefish were fed periodically with automatic feeder. Photocell with infrared beam were used to record the locomotor activity and a software "El Temps" used for data representation. 6 Zebrafish males and females maintained under cycle LD 12:12, and 28 degrees, were sampled during a day at different time point ZT2,6,10,14,18,22. The expression genes were measured in gonads and brain of both sexes with qPCR. Conclusions. 1. The ontogeny of clock genes expression develops differently depending on the light cycles and the wavelength of the light. The genes of the negative loop (per1b and per2) develop rhythmicity before, during development, respect those positive loop (clock and bmal). 2. The locomotor activity is strongly influenced by light cycles, showing no rhythmicity under continuous darkness. The different spectrum of light induces the asynchronous start of locomotor rhythmicity in larvae. 3. The locomotor activity increment as response of illumination change of different spectrum of the light cycles is related to the presence of several non visual photoreceptors already at 3 dpf. 4. Zebrafish hatch rhythmically during the light phase, appearing strongly synchronized to light-dark cycles. The phase of this rhythm at constant temperature depends on the lighting cycle. 5. The feeding anticipatory activity has endogenous origin in both species. The oscillator appears to posses: high plasticity in the synchronization of its rhythm to feeding cycle different of 24-hour and ability to re-synchronize when feeding time is delayed. 6. The expression of genes involved in sexual differentiation in adults varies during the day and the phase depends on the light cycle and sex.

Las L-aminoácido oxidasas (LAOs) son enzimas que oxidan aminoácidos generando el cetoácido correspondiente, amonio y peróxido de hidrógeno. Generalmente, estas enzimas tienen una flavina como cofactor. En la bacteria marina Marinomonas mediterranea se han descrito las dos primeras LAOs que poseen un cofactor quinónico. Este tipo de cofactores se generan mediante modificación post-traduccional de aminoácidos. La primera LAO descrita en M. mediterranea, LodA, es una novedosa L-lisina-épsilon-oxidasa (EC 1.4.3.20). De forma paralela a la realización de este trabajo, se ha descrito GoxA, una glicina oxidasa con características distintas a las glicinas oxidasas descritas previamente en otros organismos. Ambas proteínas son codificadas en operones. En el caso del operón lod, inmediatamente después al gen lodA, se encuentra el gen lodB que codifica la flavoproteína LodB. Datos previos indicaban que en M. mediterranea ambas proteínas son necesarias para obtener LodA activa. El objetivo de este trabajo ha sido estudiar el papel de LodB en la generación del cofactor quinónico de LodA. Así mismo, se han abordado por primera vez estudios de relación estructura/función de LodA para determinar residuos implicados en el proceso de generación del cofactor quinónico y en la actividad enzimática. El estudio presentado en esta memoria se ha llevado a cabo principalmente mediante expresión recombinante, solas o en combinación, en Escherichia coli de las distintas proteínas de los operones que codifican las LAOs. Las proteínas recombinantes se analizaron mediante espectrometría de masas para detectar la masa molecular de la proteína completa y de los péptidos generados por digestión enzimática, con el fin de identificar los residuos que son modificados post-traduccionalmente durante la generación del cofactor quinónico. Adicionalmente, el papel de los residuos seleccionados por estar conservados en LodA y proteínas similares o por su localización estructural, se ha estudiado mediante mediante mutagénesis dirigida. Finalmente, se ha realizado un análisis comparativo de las proteínas del operón lod y gox. Se ha determinado que LodA recombinante posee como cofactor cisteína triptofilquinona (CTQ) generado por modificación de los residuos Cys516 y Trp581. La expresión de LodA en ausencia de LodB, genera una forma precursora de LodA, a la que se ha denominado PreLodA, que no muestra actividad enzimática y está monohidroxilada en Trp581. Este resultado indica que la síntesis de la proteína activa requiere la flavoproteína LodB que actuaría sobre PreLodA. Por su parte, los experimentos de mutagénesis han permitido determinar que el residuo conservado Asp512 es esencial en la generación de PreLodA. Otros residuos analizados importantes para la actividad están localizados en la entrada del canal del centro activo de LodA o en la proximidad del cofactor. Las deleciones realizadas en el extremo C-terminal sugieren que esa zona podría participar en la generación de la forma activa de LodA. Mediante análisis bioinformático se ha detectado en genomas microbianos que los operones que codifican proteínas similares a LodA generalmente contienen, además del gen similar a lodA, un segundo gen que codifica una hipotética flavoproteína similar a LodB. El estudio del operón gox ha revelado que, al igual que ocurre con LodA, cuando se expresa GoxA en ausencia de GoxB, se detecta una forma intermedia monohidroxilada sin actividad enzimática que se ha denominado PreGoxA, por su similitud con PreLodA. Por último, se ha demostrado que las flavoproteínas que acompañan a LodA y GoxA no son intercambiables, indicando una alta especificidad de la quinooxidasa que modifica. Este trabajo supone un avance en el estudio de la nueva familia de LAOs con cofactor quinónico. En concreto, se ha puesto de manifiesto un mecanismo novedoso de modificación post-traduccional de proteínas, ya que con anterioridad no se había descrito la participación de flavoproteínas en este tipo de procesos. / L-amino acid oxidases (LAOs) oxidize amino acids releasing ammonium, hydrogen peroxide and the corresponding alpha keto acid. The marine bacterium Marinomonas mediterranea synthesizes two novel LAOs which contain a quinone cofactor, in contrast to other LAOs that contain a flavin cofactor. Quinone cofactors are generated by post-translational modification of amino acid residues. The first LAO described in M. mediterranea, LodA, is a novel L-lysine-epsilon-oxidase (EC 1.4.3.20). During the realization of this work, it has been described GoxA, a glycine oxidase which is different from the glycine oxidases previously described in other organisms. Both proteins are encoded in operons containing two genes. The operon lod contains immediately downstream to the gene coding for LodA, a second gene coding for the flavoprotein LodB. Previous data have demonstrated that both proteins are required for the generation of the active form of LodA in M. mediterranea. The aim of this work has been to study the role of LodB in the generation of the quinone cofactor of LodA. In addition, studies about structure/function relationship of LodA has been carried out for the first time with the aim of determining the residues involved in the biogenesis of the quinone cofactor and the enzymatic activity of LodA. This work has been carried out by heterologous expression in Escherichia coli of the different genes coding for either LodA or GoxA, alone or in combination with the genes encoding LodB or GoxB. In order to identify which residues are post-translationally modified, the recombinant proteins were analyzed by mass spectrometry to determine the molecular mass of the complete protein and that of the peptides generated by enzymatic digestion. In addition, the role of residues conserved in LodA and LodA-like proteins has been studied by site directed mutagenesis. Finally, a comparative analysis of protein encoded by lod and gox operons has been also performed. It has been determined that recombinant LodA contains a cysteine tryptophyl quinone cofactor (CTQ) which is generated by post-translational modification of residues Cys516 and Trp581. When LodA is expressed in absence of LodB, an inactive monohydroxylated intermediate of LodA, named PreLodA is generated. It is. This result indicates that LodB is required to obtain active LodA and that PreLodA would be its substrate. A critical role in the generation of this precursor of a conserved Asp residue has been revealed by site directed mutagenesis. Other important residues to obtain enzymatic activity are located at the entrance of the active site of LodA or in close vicinity to the quinone cofactor. Moreover, deletions in C-terminal region of LodA suggest a role of that region in the generation of the active form of LodA. Using bioinformatic analysis it has detected that operons encoding LodA-like proteins in microbial genomes usually contain a second gene encoding a hypothetical LodB-like flavoprotein. The analysis of the recombinant synthesis of GoxA in absence of GoxB has revealed, similarly to LodA, a soluble inactive precursor with partial post-translational modifications. This precursor has been named PreGoxA because of its similarity to PreLodA. Finally, it has been demonstrated that the roles of LodB and GoxB are not interchangeable and each flavoprotein acts specifically on its partner protein. This study gets insights in a novel family of LAOs with quinone cofactors. The data presented in this work have revealed a new mechanism of post-translational modification of proteins involving a flavoprotein.