Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-03-19Bitstream added on 2014-06-13T19:05:20Z : No. of bitstreams: 1 rinaldo_d_dr_araiq.pdf: 1188120 bytes, checksum: 1e4f3603501a8b454e918390b4c81bce (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Este trabalho abordou a determinação quali e quantitativa de enantiômeros de catequinas em extratos e infusões das folhas de espécies do gênero Byrsonima (Malpighiaceae), tais como: B.basiloba, B. cocolobifolia, B. crassa, B. intermedia e B. verbascifolia. O trabalho descreve a determinação rápida e eficiente de catequina, ent- catequina, epicatequina e ent-epicatequina por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detector de arranjo de fotodiodos e dicrísmo circular, usando coluna de fase estaconária quiral. O método possui alta seletividade e permite identificar inequivocadamente diastereômeros de catequinas em matrizes complexas como extratos vegetais, com limites de detecção (0,42 a 0,77 μg mL-1 ) e quantificação (1,27 a 2,32 μg mL-1 ) satisfatórios para as condições analisadas, e valores de precisão (0,3 to 4,8%) e exatidão (70,0 a 110,2%) recomendados pela ANVISA. Com exceção da espécie B. intermedia, quatro espécies do gênero apresentaram em seus extratos e infusões os diastereômeros catequina, epicatequina e ent-epicatequina. Experimentos para avaliar a epimerização da catequina indicaram que a incomum ent-epicatequina não é um artefato, podendo ser um produto do metabolismo de espécies do gênero Byrsonima. Enantiômeros da catequina apresentam diferentes atividades farmacológicas, o que pode causar a ocorrência de efeitos colaterais diversos, danosos à saúde humana. Portanto, esses resultados podem alertar quanto ao consumo indiscriminado de plantas medicinais pela população e contribuir para criação de políticas mais rigorosas no controle de qualidade de fitoterápicos no Brasil / This work deals with the qualitative and quantitative determination of catechin and epicatechin enantiomers both in extracts and infusions from the leaves of the Byrsonima (Malpighiaceae) species (B.basiloba, B. cocolobifolia, B. crassa, B. intermedia and B. verbascifolia). This work describes a simple and reliable analytical high performance liquid chromatographic (HPLC) method coupled with photodiode array detector and circular dichroism for simultaneous determination of catechin, ent-catechin, epicatechin and ent-epicatechin. The direct separation was obtained in normal phase by HPLC using chiral stationary phase. The method has high selectivity. Regardless of variations in retention time, it was possible to identify unequivocally the enantiomers of catechin and epicatechin in complex matrices like plant extracts with satisfactory limit of detection (0.42 to 0.77 μg mL-1 ) and limite of quantification (1.27 to 2.32 μg mL-1 ). Under the conditions used, precision values were 0.3 to 4.8%, whereas accuracy values were 75.0 to 110.2%, recommended by ANVISA. Aside from B. intermedia specie, the other four Byrsonima species presented catechin, epicatechin and ent-epicatechin diastereomers both in methanolic extract and infusions. Experiments were carried out for verification the possibility of catechin epimerization. It was observed that the unusual ent- epicatechin was not an artifact, but product of Byrsonima species metabolism. Enantiomers of catechin present dissimilar pharmacological activities, which may cause the occurrence of various side effects, harmful to human health. Therefore, these results may warn about the indiscriminate use of medicinal plants by the population and contribute to the quality control of Brazilian herbal medicines

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-02-15Bitstream added on 2014-06-13T20:26:06Z : No. of bitstreams: 1 batistajunior_jm_dr_araiq.pdf: 3011383 bytes, checksum: fd591b605558cb4d50f706b29ede19f2 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Estudos fitoquímicos visando o isolamento de benzopiranos quirais foram realizados em Peperomia obtusifolia e Piper gaudichaudianum (Piperaceae). Da espécie P. obtusifolia foram isolados dois cromanos racêmicos, a peperobtusina A e o ácido 3,4-diidro-5-hidróxi-2,7-dimetil-8-(3-metil-2-butenil)-2-(4-metil-1,3-pentadienil)-2H-1- benzopirano carboxílico, bem como oito ésteres isoméricos deste último com os monoterpenos borneol e fenchol, inéditos na literatura. P. gaudichaudianum forneceu o cromeno ácido gaudichaudiânico, também como racemato. As misturas estereoisoméricas foram resolvidas por meio de cromatografia líquida de alta eficiência quiral e os estereoisômeros purificados tiveram sua configuração absoluta determinada por comparação dos espectros experimentais de dicroísmo circular vibracional e eletrônico com aqueles preditos por cálculos mecânico-quânticos ab initio. Peperobtusina A e o ácido 3,4-diidro-5-hidróxi-2,7-dimetil-8-(3-metil-2-butenil)- 2-(4-metil-1,3-pentadienil)-2H-1-benzopirano carboxílico foram assinalados como (+)-R, enquanto o ácido gaudichaudiânico foi assinalado como (+)-S. Os ésteres de cromano com borneol foram assinalados como (−)-2S,1′′′S,2′′′R,4′′′S e (+)- 2R,1′′′S,2′′′R,4′′′S, enquanto os ésteres com fenchol foram assinalados como (−)- 2S,1′′′R,2′′′R,4′′′S e (+)-2R,1′′′R,2′′′R,4′′′S. Com a configuração absoluta assegurada, foi possível a verificação do potencial tripanocida seletivo e sinérgico para os enantiômeros do ácido gaudichaudiânico e inibidor de HIV-1 protease seletivo para o (−)-(S)-ácido 3,4-diidro-5-hidróxi-2,7-dimetil-8-(3-metil-2-butenil)-2-(4- metil-1,3-pentadienil)... / Phytochemical investigations focused on chiral benzopyrans were carried out on Peperomia obtusifolia and Piper gaudichaudianum (Piperaceae). Two racemic chromanes, peperobtusin A and 3,4-dihydro-5-hydroxy-2,7-dimethyl-8-(3-methyl-2- butenyl)-2-(4-methyl-1,3-pentadienyl)-2H-1-benzopyran carboxylic acid, as well as eight novel isomeric esters of the latter with the monoterpenes borneol and fenchol, were isolated from P. obtusifolia. P. gaudichaudianum afforded the racemic chromene gaudichaudianic acid. All stereoisomeric mixtures were resolved using chiral high performance liquid chromatography and the purified compounds had their absolute configuration determined by comparison of experimental vibrational and electronic circular dichroism spectra with those calculated using ab initio quantummechanical methods. Peperobtusin A and 3,4-dihydro-5-hydroxy-2,7-dimethyl-8-(3- methyl-2-butenyl)-2-(4-methyl-1,3-pentadienyl)-2H-1-benzopyran carboxylic acid were assigned as (+)-R, whereas gaudichaudianic acid was assigned as (+)-S. The borneol chromane esters were assigned as (−)-2S,1′′′S,2′′′R,4′′′S and (+)- 2R,1′′′S,2′′′R,4′′′S, while the fenchol esters were assigned as (−)-2S,1′′′R,2′′′R,4′′′S e (+)-2R,1′′′R,2′′′R,4′′′S. Once the absolute configuration had been established it was possible to identify a selective and synergistic trypanocidal activity for the enantiomers of gaudichaudianic acid as well as a selective HIV-1 protease inhibitory potential for (−)-(S)-3,4-dihydro-5-hydroxy-2,7-dimethyl-8-(3-methyl-2-butenyl)-2-(4- methyl-1,3-pentadienyl)... (Complete abstract click electronic access below)

Submitted by Diego Venturini null (diego.venturini@lpnet.com.br) on 2017-04-26T03:06:48Z No. of bitstreams: 1 dissertação defesa FINAL.pdf: 3454973 bytes, checksum: 46340a211534e710264ebdb1e5d788ef (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-04-26T12:43:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 venturini_d_me_bauru.pdf: 3454973 bytes, checksum: 46340a211534e710264ebdb1e5d788ef (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-26T12:43:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 venturini_d_me_bauru.pdf: 3454973 bytes, checksum: 46340a211534e710264ebdb1e5d788ef (MD5) Previous issue date: 2017-03-23 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A albumina é a proteína solúvel mais abundante no sangue e desempenha um papel crítico na manutenção da pressão osmótica e no transporte de substâncias. A divanilina apresenta propriedades antioxidantes e pode ser usada como intensificador de sabor e cremosidade nos alimentos. Em nosso trabalho realizamos um estudo abrangente sobre a interação da divanilina com a albumina do soro bovino (BSA) aplicando técnicas de fluorescência molecular e dicroísmo circular (CD) para determinar a constante de ligação, as características físico-químicas de suas interações e utilizar a divanilina como sonda suscetível a dicroísmo circular na discriminação de sítios de ligação na albumina a partir do monitoramento do sinal de Dicroísmo Circular Induzido (ICD). Os resultados obtidos indicaram que a divanilina pode se ligar aos sítios I e II, mas liga-se preferencialmente ao sítio de drogas I da BSA com constante de associação (Ka) de 3,33, 2,83, 2,03x105 M-1, em temperaturas de 298, 308 e 318 K, respectivamente. Esses valores foram cerca de 4 vezes mais elevados em comparação com a vanilina. Os valores obtidos de energia livre de Gibbs, variação de entalpia e entropia para a ligação a partir da equação de Van't Hoff foram de -31,5 kJ/mol, -19,42 kJ/mol e 40,8 J/mol.K-1, respectivamente, demonstrando que as forças principais que atuaram para a estabilização do complexo foram ligações de hidrogênio e interações hidrofóbicas. Em presença de BSA a divanilina tornou-se uma molécula quiral, fato evidenciado pelo seu espectro de dicroísmo circular induzido. A quiralidade axial foi teoricamente confirmada a partir do estudo das conformações mais estáveis adotadas pela divanilina usando a Teoria Funcional da Densidade (DFT). Os estudos de Docking molecular confirmaram a estrutura conformacional a qual a divanilina se ligou na BSA sendo a anti-aS com ângulo diedro entre 230º e 241º. A preferência pelo sítio I também pôde ser confirmada pelo docking devido a energia conformacional apresentada para a estrutura da divanilina quando inserida nesse sítio, sendo de -63,1 Kcal/mol enquanto que no sítio 2 a energia obtida foi de -59,7 Kcal/mol. / The albumin is the most abundant soluble protein in blood and plays a critical role in maintaining the osmotic pressure and transport of substances. The divanillin has antioxidant properties and can be used as flavor enhancer in food and creaminess. In this work, we carried out a comprehensive study on the interaction of divanillin with bovine serum albumin (BSA) applying molecular fluorescence techniques and circular dichroism (CD) to determine the binding constant and the physicochemical characteristics of their interactions and use divanillin as susceptible probe circular dichroism in discrimination of albumin binding sites from the ICD signal monitoring. The results indicated that divanillin can bind to sites I and II, but preferentially binds to site I of drugs in BSA with association constant (Ka) 3.33, 2.83, 2.03x105M-1, at temperatures (298, 308, 318K) respectively. These values were about 5 times higher compared to vanillin. The values of Gibbs free energy, enthalpy and entropy changes for the connection from the van't Hoff equation were -31,5 kJ/mol, -19,42 kJ/mol and 40,8 J/mol.K-1, respectively, showing that the main forces that have acted to stabilize the complex were hydrogen bonds and hydrophobic interactions. In the presence of BSA, divanillin became a chiral molecule as evidenced by its induced circular dichroism spectrum. The axial chirality was theoretically confirmed from the study of the most stable conformations adopted by divanillin using the Functional Theory Density (DFT). Axial chirality was theoretically confirmed from the study of the more stable conformations adopted by divanilin using the Functional Density Theory (DFT). Molecular docking studies confirmed the conformational structure to which divanilin bound in BSA with anti-aS having a dihedral angle between 230° and 241°. The preference for site I can also be confirmed by docking due to the conformational energy presented for the divanilin structure when inserted at that site, being -63.1 Kcal/mol while at site 2 the energy obtained was -59.7 Kcal/mol.

Montamos um espectrômetro o qual nos permite obter dados de atividade ótica Dispersão Rotatória (DRO) e Dicroísmo Circular (DC) simultaneamente. O sistema ótico consiste de uma fonte de luz, um monocromador, um suporte para amostra, um analisador gigante e um detector de luz. O analisador girante é sustentado por um mancal pneumático e gira usando um motor de passo, o qual é controlado por um microcomputador. Um outro motor de passo também controlado por microcomputador é usado para girar a grade de difração do monocromador. Para obter os espectros de DRO e DC, o monocromador pára em um certo comprimento de onda, enquanto o eixo de transmissão do analisador é posicionado em &#946= 0&#176, 45&#176, 90&#176 e -45&#176 relativo ao eixo de transmissão do polarizador. O microcomputador através do detector de luz lê as quatro intensidades de luz e usando um formalismo desenvolvido por nós, relaciona-as à elipticidade e a rotação ótica naquele comprimento de onda. O monocromador é então girado a um novo comprimento de onda e o procedimento é repetido. No final, os espectros de DC e DRO podem ser mostrados em uma Tabela ou com um Gráfico. Além de funcionar como um espectropolarímetro, o equipamento pode ser usado também como um espectrofotômetro, para acompanhar cinética de reação, para medir dicroísmo linear, etc... Devido à relação sinal/ruído, temos nos ângulos medidos, uma resolução de 1&#186 / We have assembled a spectrometer which provides the optical activity data Optical Rotatory Dispersion (ORD) and Circular Dichroism (CD) simultaneously. The Optical System consists of a source of light, a monochromator, a polarizer, a sample holder, a rotating analyzer and a light detector. The rotating analyzer is supported by a pneumatic bearing and rotates using a step motor which is controlled by a microcomputer. Another spet motor also controlled by the microcomputer is used to rotate the diffraction grating of the monochromator. To obtain the ORD and CD spectra, the monochromator stops at a certain wave length, while the transmission axis of the analyzer is positioned at &#946= 0&#176, 45&#176, 90&#176 e -45&#176 relative to the transmission axis of the polarizer. The microcomputer through the light detector reads the four light intensities and using the formalism developed by us relates them to the elipticity and optical rotation at that wavelength. The monochromator is then rotated to a new wavelength and the procedure is repeated. At the end the CD and ORD spectra can be shown in a Table or as a graph. Besides functioning as a spectropolarimeter, the equipment can be use also as a regular spectrometer, to follow kinetic of recreations, to measure linear dichroism, etc Due to the signal/noise ratio we have in the measured angles a resolution of 1&#176

Os estudos sobre o mecanismo de enovelamento das proteínas é o resultado de um estudo intenso utilizando métodos bioquímicos, biofísicos e teóricos. \"In vitro\", o estado inicial deste estudo é a proteína desnaturada. Neste trabalho, temos estudado o reenovelamento, após desnaturação térmica, de uma glicoproteína denominada frutalina; da família das lectinas. A característica principal desta classe de proteínas é sua habilidade para interagir com carboidratos e, portanto, combinar-se com glicocomponentes da superfície da célula, induzindo suas propriedades biológicas. A frutalina é uma lectina tetramérica extraída das sementes de Artocarpus incisa. Ela é ligante de D-galactose e o espectro de CD (dicroísmo circular) de sua estrutura nativa foi identificado como sendo dominado por folhas ?. A desnaturação térmica e as etapas do reenovelamento foram monitoradas por espectroscopia de CD, fluorescência e também pela perda da atividade hemaglutinante. As condições de desnaturação utilizadas foram aquecimento à 60°C por 30 a 60 minutos, dependendo do tempo de estocagem (a -18°C) da proteína na forma nativa. Os resultados indicaram que o reenovelamento é promovido por um processo de congelamento na presença de PBS contendo 0,l M de D-galactose seguida por centrífugoconcentração em Centriprep 3. A hemaglutinação positiva ocorreu tanto para a fração nativa quanto para a fração reenovelada. O reenovelamento da frutalina desnaturada também ocorreu com PBS contendo 0,1 M de solução de D-glicose. Quando a forma desnaturada foi concentrada antes do congelamento em PBS sem D-galactose ou em PBS contendo xilose, o reenovelamento não ocorreu. Estes resultados mostraram que o reenovelamento da frutalina foi dependente da ligação com a D-galactose ou D-glicose, bem como a importância do congelamento para obter a forma biologicamente ativa. A análise da estrutura secundária utilizando o programa CCA forneceu um resultado importante: para a forma nativa da frutalina obtivemos 85% de folhas ? paralelas e antiparalelas, incluindo voltas ?, enquanto que para a forma reenovelada obtivemos 73%, mostrando que a estrutura reenovelada, a nível secundário, se aproximou satisfatoriamente da nativa, concordando com os resultados obtidos nos testes de hemaglutinação. / Our current understanding of the protein folding mechanism is the result of intense study employing biophysical, biochemical and theoretical methods. \"In vitro\", the initial state of the protein in this puzzle is its unfolded form. In the present work we have studied the refolding, after thermal denaturation, of the glycoprotein frutalin, a member of the lectin class. The main characteristic of these proteins is their ability to interact with carbohydrates and thus combine with glycocomponents of the cell surface, leading to their biological properties. Frutalin is a tetrameric lectin extracted from the seeds of Artocarpus incisa. It is D-galactose specific and its native CD spectrum was identified as being dominated by ? -sheet. The thermal unfolding and refolding steps were measured by CD and fluorescence spectroscopies together with the loss of hemagglutinating activity. The unfolding conditions used were 60°C for 30 to 60 minutes, depending on the protein storage time. The results indicate that refolding is promoted by the freezing process in the presence of 0,1 M D-galactose-PBS followed by three-fold concentration in a Centriprep 3. Positive hemagglutination occurred for both the native and refolded forms. Refolding of denatured frutalin also occurred with PBS containing 0,1 M D-glucose. When the unfolded form was concentrated before freezing in PBS without D-galactose or in PBS containing xylose, refolding did not occur. These results show that the refolding of frutalin is dependent on the binding of D-galactose or D-glucose, and demonstrate the importance of freezing in order to obtain the biologically activity form. An analysis of secondary structure using the CCA program showed an important result: the native form, presented 85% ? -sheet/ ?-turns, while in the refolded form, this content fell to 73%. These results show that the refolded form is very similar to the native protein, which is in agreement with the hemagglutination results.

O estudo de enovelamento de proteínas tem sido um problema de fundamental importância em biofísica e biologia molecular. Neste trabalho, estudamos os processos de desnaturação e renovelamento das lectinas jacalina e frutalina. Estas lectinas são tetraméricas, apresentam alta homologia estrutural, porém diferem em atividade biológica, sendo a frutalina mais potente. Apesar desta homologia, estas lectinas diferem também nos processos de desnaturação e renovelamento como função da temperatura e o comportamento frente ao desnaturante químico hidrocloreto de guanidina (GndHCl). Ambas proteídas foram desnaturadas pela ação de GndHCl e suas curvas de desnaturação medidas por espectroscopia de fluorescência e CD. As medidas de fluorescência da frutalina deram valores de estabilidade conformacional de 17,12 kJ/mol e 12,34 kJ/mol, na presença e na ausência de D-Galactose, enquanto a jacalina forneceu valores de 8,12 kJ/mol para a transição NI e 5,61 kJ/mol para a transição IU em PBS. Os valores na presença de açúcar foram similares. NOs estudos da frutalina foram separadas as formas nativa, desnaturada, renovelada e uma forma molecularmente distinta chamada mal-enovelada, por cromatografia de exclusão molecular. Estas formas foram analisadas por atividades hemaglutinante e espectroscopias de CD e fluorescência. Todos os resultados obtidos confirmaram a ocorrência do renovelamento de ambas lectinas e que os monômeros renovelados, depois de alcançarem sua estrutura tridimensional, se associam espontaneamente para a formação dos tetrâmeros. / Protein refolding is currently a fundamental problem in biophysics and molecular biology. We have studied the refolding process of jacalin and frutalin. They are tetrameric lectins that present structural homology, buti jacalin shows a more marked biological activity than the latter. These proteins, despite their homology, have different unfolding/refolding behaviors as function of temperature and chemical agents. Both proteins were unfolded induced by guanidine hydrochlroide and their dnaturation curves mesuared by fluorescence emission and CD. Fluorescence measurments of frutalin gave values of conformational stability of 17.12 kJ/mol and 12.32 kJ/mol, in the presence and absence of D-Galactose, while jacaline gave values of 8.12 kJ/mol for NI transition and 5.61 kJ/mol for IU transition in PBS. In sugar presence the values are similar. In the frutalin studies were separeted the native, unfolded, refolded and a distinct molecular form denoted misfolded, by Size Exclusion Chromatography. These forms were analyzed for hemagglutination activity, CD and fluorescence spectroscopy. All the results obtained confirmed the successful refolding of the both lectins and the refolded monomers, after adopting their native three-dimensional structures, spontaneously assembled to form tetramers.

Neste trabalho, apresentamos resultados da caracterização Magneto-Óptica de íons terras-raras (Nd3+ e Yb3+) em monocristais de niobato de lítio (LiNbO3). Medidas de Dicroísmo Circular Magnético (MCD) e de Emissão Circularmente Polarizada em Presença de Campo Magnético (MCPE) foram realizadas pela primeira vez nesses sistemas. Os resultados foram obtidos à temperatura de 2K, e em campos magnéticos de até 5 T. Através desses estudos, foi possível identificar os números quânticos cristalinos (&#956) dos subníveis Zeeman desses íons. A partir da dependência do sinal de MCD com a intensidade de campo magnético, determinou¬se o fator giromagnético efetivo g// do estado fundamental de cada íon, obtendo-se os valores: g//Nd = (1,4 &#177 0,1) e g//Yb = (4,7 &#177 0,1). Esses valores foram confirmados através de medidas de espectroscopia de Ressonância Paramagnética Eletrônica (EPR), realizadas a baixa temperatura (4-8 K), em banda X. Os espectros de EPR foram tomados em função da orientação relativa do campo magnético externo com o eixo c cristalino dos cristais, em 3 planos perpendiculares entre si. Os espectros de EPR mostram a existência de diferentes sítios ocupados pelos íons terras-raras. O sítio mais populado tem simetria axial, e para esse centro determinaram-se os fatores g efetivos g//Nd = (1,440 &#177 0,005) e g//Nd = (2,959 &#177 0,004), para o íon Nd3+, e g//Yb = (4,705 &#177 0,008) e g//Yb = (2,693 &#177 0,005) para o íon Yb3+. Espectros de MCD e MCPE obtidos para um cristal de rubi ilustram as convenções utilizadas e atestam que o sistema experimental funciona adequadamente. Os espectros obtidos nessa amostra também são originais, tendo sido resolvidas as transições permitidas com luz circularmente polarizada entre os subníveis Zeeman correspondentes aos níveis de energia 4A2 e &#8254E (2E) do íon Cr3+. / In this work we present Magneto-Optícal characterizations of rare-earth ions (Nd3+ e Yb3+) in lithium niobate (LiNbO3) single crystals. Magnetic Circular Dichroism (MCD) and Magnetic Circularly Polarized Emission (MCPE) measurements were performed for the first time on those systems. Spectra were obtained at 2K and at magnetic field strength up to 5T. From these studies, it was possible to assign the crystal quantum number (&#956) of the Zeeman sublevels of these ions, so that the sign and allowance of the electronic transitions could be predicted. From the dependence of suitable MCD spectral lines on the magnetic field strength, the effective parallel gyromagnetic factor (g//) of the ground state for each of the rare earth ions has been determined to be: g//Nd = (1,4 &#177 0,1) e g//Yb = (4,7 &#177 0,1). These values are in dose agreement to those obtained by means of Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy, at 4-8 K, and at X-band frequency. EPR spectra were recorded as a function of the external magnetic field orientation relative to the c crystalline axis in three mutual perpendicular planes. These spectra show evidence of multiple sites occupied by the rare-earth ions. For the most intense line seen in the spectra of each ion, it could be clearly assigned a site with axial symmetry, with effective g factors of g//Nd= (1,440 &#177 0,005) and g//Nd = (2,959 &#177 0,004), for the Nd3+3+ ion, and g//Yb = (4,705 &#177 0,008) and g//Yb= (2,693 &#177 0,005) for the Yb3+ ion. MCD and MCPE spectra recorded for a ruby crystal shows the experimental conventions used so far in this work, as well as assure that the experimental system works properly. These results are original ones, by means of which, the spectral transitions between the Zeeman sublevels of the 4A2 and &#8254E (2E) of the Cr3+ ions in ruby could be resolved.

Orientador: Marco Aurelio Zezzi Arruda / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-10T13:14:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_MarceloAnselmoOseasda_M.pdf: 1369513 bytes, checksum: 35e33836144e52420b1164f512aa97e9 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Nesta dissertação foi estudado o comportamento de partição da albumina, proteína presente em elevada concentração no plasma sangüíneo e que interfere na determinação em diversas técnicas analíticas. No estudo efetuado foram avaliados diferentes sistemas aquosos de duas fases, explorando um fenômeno denominado ponto nuvem. Tais sistemas empregam surfactantes, sob condições experimentais específicas, obtendo-se a formação de duas fases imiscíveis: uma rica e outra pobre em tensoativo. Observou-se que devido às características hidrofílicas da albumina, bem como à dimensão dos agregados formados, sua extração para fase rica em tensoativo apresenta valores de coeficiente de partição que não ultrapassam 0,66 o que representa uma eficiência de extração de ca.40%. A extração da proteína apresentou-se viável mediante a utilização de uma mistura composta por um tensoativo não-iônico (Triton® X-114), que possibilita a separação de fases em temperatura biocompatível, na presença de outro tensoativo iônico (dodecil sulfato de sódio - SDS), que atua favorecendo as interações eletrostáticas entre os agregados e as moléculas protéicas, desde que se trabalhe em meio com pH abaixo de 5,0. Análises de dicroísmo circular complementaram o estudo e fornecerem evidências de que a aplicação do sistema baseado na mistura composta por Triton® X-114 e SDS causava desnaturação parcial da proteína, o que não inviabilizou sua aplicação para extração da mesma em uma amostra real. A eficiência deste sistema foi, então, avaliada para a remoção de albumina em plasma sangüíneo. Um coeficiente de partição de 1,1 foi obtido, indicando que ca.51% das proteínas encontravam-se na fase rica em tensoativo. As amostras submetidas ao procedimento de extração também foram avaliadas frente à técnica de eletroforese em gel, sendo que a fase pobre em sufactante apresentou um perfil eletroforético mais detalhado quando comparada a uma amostra que não foi submetida ao procedimento proposto. Já na fase rica em surfactante, foi observada a presença majoritária de albumina e, em menor concentração, outras proteínas de grande abundância no plasma tais como imunoglobulina G e transferrina. Por fim, o método apresentou desempenho semelhante ao de sistemas disponíveis comercialmente para remoção de albumina, tal como o sistema da Millipore®, apresentado neste trabalho / Abstract: In this work the partition behavior of albumin was studied, which is found at high concentrations in blood plasma, which interferes in many analytical techniques determinations. The present study evaluated different aqueous two-phase systems, exploiting a phenomenon called of cloud point. These systems employ surfactants under specific experimental conditions, enabling formation of two immiscible phases: one rich and another poor in surfactant. Due to the hydrophilic characteristcs of albumin, as well as its aggregate dimensions, its extration to the surfactant rich phase presented partition coefficients lower than 0.66, representing and extraction efficiency of ca. 40%. Protein extraction was feasible by applying a mixture comprised of a nonionic surfactant (Triton® X-114), which allowed the phase separation at biocompatible temperatures, and an ionic one (sodium dodecylsufate - SDS), wich promotes eletrostatic interactions between aggregates and protein molecules, since the extraction procedure is carried out at pH 5.0. Circular dichroism analysis complemented the study and it showed that a system based on a Triton® X-114 and SDS mixture causes partial protein denaturation, but its application for a real sample is feasible. The efficiency of this was evaluated for albumin removal from blood plasma. A partition coefficient of 1.1 was obtained, indicating that ca. 51% of proteins were contained in the surfactant rich phase. Albumin depleted samples were submitted to gel eletrophoresis and the surfactant poor phase presented a more detailed gel electrophoresis profile, when compared with a crude sample. The surfactant rich phase reveled that albumin is the predominant protein present, but it is possible to find other highly concentrated plasmatic proteins including immunoglobulin G and transferrin. Finally, the method presented similar performance when compared with commercially available systems for albumin removal, such as the Millipore® system, wich was also evaluated in this work / Mestrado / Quimica Analitica / Mestre em Química

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2016-05-19T12:14:27Z No. of bitstreams: 1 Amanda Emmanuelle Sales.pdf: 4982712 bytes, checksum: 90011cbdafe7a0363213b2fff5735b44 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-19T12:14:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Amanda Emmanuelle Sales.pdf: 4982712 bytes, checksum: 90011cbdafe7a0363213b2fff5735b44 (MD5) Previous issue date: 2015-12-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Fibrinolytic proteases are enzymes that degrade fibrin, the main component of blood clots. The accumulation of this protein leads to thrombosis responsible for cardiovascular disease including myocardial infarction. A promising alternative to thrombolytic therapy has been the production of these enzymes by microorganisms which promotes low cost, high efficiency and capacity for large scale production. This study aimed to select species of filamentous fungi isolated from Caatinga soil samples - Pernambuco - Brazil and assess their potential for production of proteases with fibrinolytic activity. Among the 36 isolates studied, 58% showed fibrinolytic activity above 100 U/mL. The microorganism with the higher activity in terms of enzyme production was Mucor subtilissimus UCP 1262 with 415 U/mL. Further optimization of the fermentation process resulted in the production of 1075 U/mL of enzymatic activity. The fibrinolytic enzyme had a capacity of enzymatic degradation of the blood clot of 16.7 % in vitro. Extraction of fibrinolytic protease produced at submerged fermentation was carried out using a PEG/ammonium sulphate aqueous two-phase system (ATPS). PEG 8000 15% and 25% ammonium sulphate were selected as the most appropriate components for extraction with Fibrinolytic Activity in salt phase: 345 U/mL; K: 0.65; Y: 253.1 % and FP: 8.8. The fibrinolytic enzyme from Mucor subitilissimus UCP 1262 was pre-purified using extractive fermentation in PEG and ammonium sulphate ATPS, in which the fungal strain was able to grown even in high salt concentration, produced and extracted simultaneously to the PEG phase. A novel protease with fibrinolytic activity was purified also by chromatographic methods using a two-step purification protocol. Compared to the crude enzyme extract, the specific activity of the enzyme increased 5.30 fold with a recovery of 36.31%. The initial crude extract with the enzyme was pre-purified using acetone precipitation and adsorbed by ion exchange chromatography on DEAE-sephadex G50. The two-dimensional electrophoresis system (2DE) coupled with SDS-PAGE showed a single protein band of approximately 15.3 kDa and isoelectric focusing point of 3.9, exhibiting a nature as an acidic enzyme. Additionally, the activity was slightly inhibited by EDTA, but significantly inhibited by PMSF and also had a higher affinity for the N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilide (SAApNA) and azocasein substrates, suggesting to be a chymotrypsin-like protease. Protein unfolding induced by pH and temperature were applied to study the protein conformational changes and showed from the thermal denaturation curve, change in ellipticity at 222 nm, indicated Tm (Melting temperature) of the protein to be 58.14°C. The far UV circular dichroism (CD) of the fibrinolytic protease showed the secondary structure with most content percentage of α-helix. These results demonstrate an economical, viable enzyme purification protocol. And studying the purified fibrinolytic enzyme have established basis for elucidating mechanisms responsible for the changes in conformation of the new fibrinolytic enzyme under varying conditions of temperature and pH. This novel fibrinolytic enzyme may represent a new source of therapeutic agents to treat thrombosis diseases. / Proteases fibrinolíticas são enzimas que degradam a fibrina, o principal componente dos coágulos sanguíneos. O acúmulo da fibrina nos vasos sanguíneos leva a trombose, fenômeno responsável por doenças cardiovasculares. Uma alternativa promissora para a terapia trombolítica tem sido a produção dessas enzimas por micro-organismos que promovem baixo custo, alta eficiência e capacidade de produção em larga escala. Produzir proteases fibrinolíticas por linhagens de fungos filamentosos por fermentação submersa e desenvolver o processo de purificação utilizando Sistemas de Duas Fases Aquosas (SDFA) e cromatografia líquida, além de caracterizar bioquímico e estruturalmente a enzima. Dentre as 36 espécies estudadas, 58% apresentaram atividade fibrinolítica acima de 100 U/mL A espécie com maior atividade foi Mucor subtilissimus UCP 1262 com 415 U/mL. Foram realizados processos fermentativos que resultaram na produção de 1075 U/mL de atividade fibrinolítica, com capacidade de degradação do coágulo sanguíneo de 16,7% in vitro. A extração da protease fibrinolítica produzida por fermentação submersa foi realizada utilizando o sistema de duas fases aquosas (SDFA) com Polietileno glicol (PEG) e sulfato de amônio. O PEG 8000 (g/mol) a 15% e sulfato de amônio a 25% foi selecionado como a condição mais eficiente para a extração da enzima na fase do sal, apresentando 345 U/mL de atividade, coeficiente de partição K=0,65; Recuperação Y=253,1% e Fator de purificação FP=8,8. A protease fibrinolítica produzida por Mucor subitilissimus UCP 1262 foi também pré-purificada utilizando fermentação extrativa com SDFA (PEG e sulfato de amônio), onde a espécie fúngica foi capaz de crescer mesmo em altas concentrações de sal, produzir e extrair simultaneamente para a fase do PEG do sistema. A protease fibrinolítica foi purificada também através de métodos cromatográficos utilizando um protocolo de purificação com dois passos. O extrato bruto inicial com a enzima foi pré-clarificado utilizando precipitação com acetona e adsorção em cromatografia de troca-iônica em DEAE-sephadex G50, o qual foi capaz de aumentar a pureza em 5,30 vezes com a recuperação de 36, 31%. O sistema de eletroforese bidimensional 2DE acoplado ao SDS-PAGE mostrou uma banda única de aproximadamente 15,3 kDa e a focalização isoelétrica apresentou o ponto isoelétrico no pH 3,9, exibindo uma natureza de enzima ácida. Adicionalmente a enzima foi significativamente inibida por PMSF e alta afinidade catalítica para o substrato sintético amidolítico N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilide (SAApNA) e azocaseína. Sugerindo ser uma serino-protease semelhante à quimotripsina. Desdobramento proteico induzido por pH e temperatura foram aplicados para estudar as mudanças conformacionais da enzima e mostraram através da curva de desnaturação térmica, mudança da elipticidade a 222 nm, indicando um Tm (Temperatura de desnaturação) da proteína de 58,14°C. O dicroísmo circular no UV distante (far UV CD) da protease fibrinolítica mostrou a estrutura secundária da proteína com maior teor de α-hélix. Estes resultados demonstram um protocolo de purificação de enzimas eficiente. E o estudo da enzima purificada estabeleceu bases para elucidar mecanismos responsáveis pelas mudanças de conformação de uma nova enzima fibrinolítica sob a variação de condições variadas de temperatura e pH. Esta enzima fibrinolítica pode representar uma nova fonte de agente terapêutico no tratamento de doenças trombolíticas.

Utilizando cristais de KCl:SH- dopados com centros F2+ na ausência de centros F e F2, permitiu-nos estudar o Dicroísmo Circular Magnético (DCM) em absorção das transições 1s ?g(493?m) e 1s ?g - 2py?w (509 ?m) como função do campo magnético de 0 < H < 48 KG e temperatura entre 1.5 < T < 77K. A transição 1s ?g, 2p? (1.4 ?m) em absorção não apresentou DCM dentro do limite de detecção de nosso equipamento (1.2 X 10-4); o mesmo aconteceu com a transição (2p?w- 1s ?g) em emissão (1.2 X 10-4). Irradiando com luz polarizada na banda ?, os centros F2+ se .reorienta ao longo da direção [110] em até 1.5 K, apresentando uma forte birrefringência. Medidas em absorção com centros F2+ alinhados em várias geometrias, permitiu estudar a contribuição ao DCM de cada orientação do defeito. Apresentamos um modelo teórico em bom acordo com os resultados experimentais. Utilizando uma técnica de Detecção óptica de EPR, determinamos o fator de Landé para o estado fundamental (g =1.965 ± 0.007) e o tempo de relaxação spin-rede do estado fundamental a H = 3.2 KG, que é típico do processo direto T1-1 = 4.3 X 10-2cotgh(g?H/2kT). / Using KCl:SH- doped with F2+ centers without F and F2, we studied the Magnetic Circular Dichroism (MCD), in absorption of yhe transition 1s ?g(493?m) and 1s ?g - 2py?w (509 ?m) as a function of the magnetic field 0 < H < 48 KG and temperature 1.5 < T < 77K. The transition 1s ?g, 2p? (1.4 ?m) does not present any MCD within the limit of detection of our equipament (1.2 X 10-4); No dichroism has been observed in emission in the 2p?w- 1s ?g transition (1.2 X 10-4). F2+ centers reorient along the [110] direction down to 1.5 K by polarized light excitation in the ? bands and present a strong birefringence. Measurements in absorption with aligned F2+ in various geometry allows as to determine the contribution of each orientation to the DCM. A theorical model is presented in good agrement with the experimental results. The optical detection of the EPR in X-band give the Landé factor af the graund state is g =1.965 ± 0.007) and the spin-lattice relaxation measured at H = 3.2 KG is typical of a direct process T1-1 = 4.3 X 10-2cotgh(g?H/2kT).