Aim: To develop an immunomagnetic assay for the isolation of circulating tumor cells (CTCs) followed by the analysis of a multimarker panel, which will enable the characterization of these malignant cells with high accuracy. Patients and Methods: Peripheral blood (PB) was collected from 32 metastatic breast cancer patients and 42 negative controls. The antibodies BM7 and VU1D9 were used for immunomagnetic tumor cell enrichment. A real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) approach for the markers KRT19, SCGB2A2, MUC1, EPCAM, BIRC5 and ERBB2 was used for CTC detection and characterization. Results: The positivity rates for each marker were as follows: 46.9% for KRT19, 25.0% for SCGB2A2, 28.1% for MUC1, 28.1% for EPCAM, 21.9% for BIRC5, and 15.6% for ERBB2. After the creation of individualized cutoffs, the sensitivity and specificity of the combined marker gene panel increased to 56.3% and 100%, respectively. Interestingly, 27.0% of the HER2-negative tumor patients showed ERBB2 mRNA-positive CTCs. Conclusions: The described technique can be used to measure CTCs with great accuracy. The use of a multimarker panel for the characterization of CTCs may provide real-time information and be of great value in therapy monitoring. / Ziel: Entwicklung eines immunomagnetischen Verfahrens zur Isolierung zirkulierender Tumorzellen (CTCs) in Kombination mit einer molekularen Multimarkeranalyse für die hochspezifische Identifizierung maligner Zellen. Patientinnen und Methoden: Peripheres Blut (PB) von 32 Patientinnen mit metastasiertem Mammakarzinom und von 42 gesunden Kontrollen wurde für die immunomagnetische Tumorzellanreicherung mit den Antikörpern BM7 und VU1D9 genutzt. Eine Real-Time Reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)-Methodik mit den Markern KRT19, SCGB2A2, MUC1, EPCAM, BIRC5 und ERBB2 wurde für den CTC-Nachweis und die Tumorzellcharakterisierung entwickelt. Ergebnisse: Für die einzelnen Marker wurden die folgenden Positivitätsraten ermittelt: 46,9% für KRT19, 25,0% für SCGB2A2, 28,1% für MUC1, 28,1% für EPCAM, 21,9% für BIRC5 und 15,6% für ERBB2. Nach der Bestimmung individualisierter Cut-off-Werte ergab sich für den kombinierten Multimarkernachweis eine Sensitivität und Spezifität von 56,3% bzw. 100%. Bemerkenswert war der Befund, dass 27,0% der HER2-tumornegativen Patientinnen ERBB2-mRNA-positive CTCs aufwiesen. Schlussfolgerung: Die hier beschriebene Methodik bestimmt CTCs mit hoher Spezifität. Die molekulare Multimarkeranalyse liefert wertvolle Real-Time-Informationen für personalisierte Behandlungsmodalitäten. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Arrière-plan: les cellules tumorales circulantes (CTC) sont détectables dans de nombreux cancers et peuvent être utiles cliniquement pour le pronostic de la maladie, pour mesurer la récidive et pour prédire la sensibilité aux medicaments chimiothérapeutiques. Au cours des dernières années, l’études des CTC dans de nombreux cancers tels que le cancer du sein, du poumon, du côlon et de la prostate a grandement évolué. Alternativement, il y peu d'études à ce sujet concernant le cancer du col de l’utérus (CCU). Objectifs: Notre objectif est d’optimiser le processus d'enrichissement des CTC dans le CCU et la détection moléculaire des biomarqueurs E6 et E7. Matériel et Méthodes: Dans l’optique de mimer la présence de CTC dans le sang, nous avons dilué des cellules cancéreuses CaSki VPH16-positif provenant d’un CCU dans du sang humain prélevé sur des volontaires sains. Les CaSki ont été collectées suite à une centrifugation par densité avec le Ficoll, la lyse des globules rouges (RBC) et la lyse des RBC combinée avec un enrichissement positif et négatif à l’aide de marqueurs de surface cellulaire. Les CTC ont été détectées par la mesure d’expression des oncogènes E6 et E7 du virus du papillome humain (VPH), de la cytokératine 19 (CK19) et de la cycline p16INK4 en utilisant la technique quantitative en temps réel de Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR). Pour valider notre méthode de détection des CTC in vivo, nous avons recruté dix patientes atteintes d’un CCU VPH16 positif et six contrôles sains. Résultats: Dans le modèle de dilutions de cellules CaSki, la lyse des RBC seule ou combinée avec l'enrichissement négatif ou positif suggèrent des limites de détection de 1 CTC par mL de sang pour tous les biomarqueurs moléculaires utilisés. La sensibilité de détection est accrue lors de l'utilisation de l’enrichissement positif et négatif en réduisant le bruit de fond causé par les monocytes sanguins. Contrairement aux oncogènes E6 et E7, les marqueurs CK19 et p16INK4A ont été détectés chez des individus sains, les niveaux d'expression de base appropriés doivent donc être déterminés avec précision par rapport aux patientes CCU. Le gradient de densité par Ficoll a une limite de détection de seulement environ 1000 cellules par mL de sang. Enfin, les CTC ont été détectées dans 2/10 patientes en utilisant le marqueur CK19. Cependant, ces patientes étaient négatives pour les oncogènes E6/E7. Le marqueur p16INK4A était exprimé au même niveau dans tous les échantillons (CCU et normaux). Conclusion: Notre étude suggère que les oncogènes E6 et E7 du VPH16 sont les marqueurs biologiques les plus sensibles et spécifiques en qRT-PCR pour détecter les CTC dans le modèle de dilution de cellules de CCU dans le sang. Chez les patientes atteintes d’un CCU de stade précoce, seulement CK19 a révélé la présence potentielle de CTC, ce qui suggère que ces cellules sont rares à ce stade de la maladie. Mots clés: cancer du col de l’utérus, cellules tumorales circulantes, RT-qPCR, E6 et E7, CK19, p16INK4A, enrichissement immunomagnétique, détection moléculaire. / Background: Circulating tumor cells (CTCs) have been detected in many cancers and are used in multiple clinical applications including disease prognosis, tumor recurrence prediction and prediction of tumor sensitivity to chemotherapeutic drugs. Studies in most major solid cancer(s) (breast, lung, colon and prostate) are progressing rapidly, but there has been very little progress concerning uterine cervical cancer (UCC).Objective: our aim is to optimize enrichment processes and the molecular biomarker-based detection of human circulating tumor cells (CTCs) in uterine cervical cancer (UCC). Material & Methods: To mimic CTCs in patients, we designed an experimental spiking model where the CaSki HPV16-positive UCC cell line was serially diluted and spiked into human blood collected from healthy volunteers. CaSki CTCs were enriched using either Ficoll density centrifugation, red blood cell (RBC) lysis or RBC lysis combined with cell surface markers negative or positive enrichment. CTCs were detected using real-time quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) to measure the gene expression of human papillomavirus (HPV) viral oncogenes (E6 and E7), cytokeratin 19 (CK19), or the cyclin dependent kinase inhibitor p16INK4A. Finally, ten HPV16- positive UCC patients and six healthy controls were recruited to validate CTCs detection in vivo. Result: In the spiking model, RBC lysis alone or combined with negative or positive enrichment suggests detection limits close to 1 CTC per mL of blood for all molecular biomarkers used. The sensitivity of detection increased when using positive and negative enrichment probably by reducing the peripheral blood mononuclear cell-derived RNA background. Unlike HPV oncogenes, CK19 and p16INK4A were detected in normal individuals, thus appropriate basal expression levels need to be accurately determined compared to cancer patients. Alternatively, Ficoll density gradient had a detection limit of only about 1000 cells per mL of blood. Finally CTCs were detected in 2/10 patients using CK19. None of the patients had E6/E7 transcripts and p16INK4A was expressed at similar level across all samples (cancer and healthy). Conclusion: qRT-PCR of HPV16 E6 and E7 is the most sensitive and specific biomarker used to detect CTCs in the spiking model. In early disease UCC patients, only CK19 revealed the presence of CTCs suggesting that these cells are rare at that stage of the disease. Keywords: uterine cervical cancer, circulating tumor cells, qRT-PCR, E6 and E7 oncoprotein, CK19, p16INK4A, immune-magnetic enrichment, molecular detection.

Contexte. Le cancer bronchopulmonaire (CBP) demeure la première cause de mortalité par cancer dans le monde. Malgré l’espoir suscité par le développement des thérapies ciblées, son pronostic demeure sombre, particulièrement dans les cas de CBP à petites cellules (CBP-PC) et de CBP non à petites cellules (CBP-NPC) présentant une activation de l’oncogène KRAS. Matériel et Méthodes. Nous avons mené 3 études successives, visant à (i) radiosensibiliser des modèles de CBP-PC par l’ajout d’un inhibiteur de BCL2, (ii) cibler des modèles de CBP-NPC mutés KRAS par l’association d’un inhibiteur de mTOR et d’un inhibiteur de RAF, et (iii) créer un modèle préclinique orthotopique murin de CBP reproduisant la progression tumorale observée en clinique. Résultats. Dans la première étude, l’inhibiteur de BCL2 oblimersen a présenté un effet radiosensibilisant sur des modèles de CBP-PC, in vitro et in vivo. Dans la seconde étude, l’association de l’inhibiteur de mTOR everolimus et de l’inhibiteur de RAF/VEGFR RAF265 a présenté un effet synergique sur des lignées cellulaires de cancers présentant la double mutation de KRAS et de PIK3CA, in vitro et in vivo. Dans la troisième étude, l’injection orthotopique d’une lignée bioluminescente de CBP-NPC chez des souris nude a permis d’établir des tumeurs intra pulmonaires évoluant vers une extension métastatique ganglionnaire et hématogène, et de détecter la présence de cellules tumorales circulantes. Conclusion. L’association d’un inhibiteur de BCL2 à la radiothérapie est une stratégie intéressante dans le CBP-PC, l’association d’un inhibiteur de mTOR et d’un inhibiteur de RAF/VEGFR est une stratégie intéressante dans le CBP-NPC présentant une double mutation KRAS-PIK3CA, mais ces données doivent être confirmées sur des modèles orthotopiques afin de gagner en pertinence avant d’envisager un transfert en clinique. / Non-small cell lung cancer (NSCLC) is the leading cause of cancer-related mortality worldwide. Activation of phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K)-AKT and Kirsten rat sarcoma viral oncogene homologue (KRAS) can induce cellular immortalization, proliferation, and resistance to anticancer therapeutics such as epidermal growth factor receptor inhibitors or chemotherapy. This study assessed the conséquences of inhibiting these two pathways in tumor cells with activation of KRAS, PI3K-AKT, or both. We investigated whether the combination of a novel RAF/vascular endothelial growth factor receptor inhibitor, RAF265, with a mammalian target of rapamycin (mTOR) inhibitor, RAD001 (everolimus), could lead to enhanced antitumoral effects in vitro and in vivo. To address this question, we used cell lines with different status regarding KRAS, PIK3CA, and BRAF mutations, using immunoblotting to evaluate the inhibitors, and MTT and clonogenic assays for effects on cell viability and proliferation. Subcutaneous xenografts were used to assess the activity of the combination in vivo. RAD001 inhibited mTOR downstream signaling in all cell lines, whereas RAF265 inhibited RAF downstream signaling only in BRAF mutant cells. In vitro, addition of RAF265 to RAD001 led to decreased AKT, S6, and Eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1 phosphorylation in HCT116 cells. In vitro and in vivo, RAD001 addition enhanced the antitumoral effect of RAF265 in HCT116 and H460 cells (both KRAS mut, PIK3CA mut); in contrast, the combination of RAF265 and RAD001 yielded no additional activity in A549 and MDAMB231 cells. The combination of RAF and mTOR inhibitors is effective for enhancing antitumoral effects in cells with deregulation of both RAS-RAF and PI3K, possibly through the cross-inhibition of 4E binding protein 1 and S6 protein. We then focus on animal models. Preclinical models of NSCLC require better clinical relevance to study disease mechanisms and innovative therapeutics. We sought to compare and refine bioluminescent orthotopic mouse models of human localized NSCLC. Athymic nude mice underwent subcutaneous injection (group 1-SC, n = 15, control), percutaneous orthotopic injection (group 2-POI, n = 30), surgical orthotopic implantation of subcutaneously grown tumours (group 3-SOI, n = 25), or transpleural orthotopic injection (group 4-TOI, n = 30) of A549-luciferase cells. Bioluminescent in vivo imaging was then performed weekly. Circulating tumour cells (CTCs) were searched using Cellsearch® system in SC and TOI models Group 2-POI was associated with unexpected direct pleural spreading of the cellular solution in 53% of the cases, forbidding further evaluation of any localized lung tumour. Group 3-SOI was characterized by high perioperative mortality, initially localized lung tumours, and local evolution. Group 4-TOI was associated with low perioperative mortality, initially localized lung tumours, loco regional extension, and distant metastasis. CTCs were detected in 83% of nude mice bearing subcutaneous or orthotopic NSCLC tumours. Transpleural orthotopic injection of A549-luc cells in nude mouse lung induces localized tumour, followed by lymphatic extension and specific mortality, and allowed the first time identification of CTCs in a NSCLC mice model.

Nous avons abordé dans l’ensemble de nos travaux deux paramètres importants pour l’immunomonitoring des patients atteints d’un cancer : les cellules tumorales circulantes (CTC) comme un indicateur de la « charge antigénique tumorale » et la réponse immune lymphocytaire T spécifique d’antigènes associés aux tumeurs (AAT). Nous avons évalué d’abord la valeur diagnostique et pronostique des CTC dans les cancers des voies aérodigestives supérieures (« HNSCC » en anglais) par une revue systématique et meta-analyse de la littérature. Les preuves actuelles identifient le test de détection de CTC comme un test extrêmement spécifique, mais de faible sensibilité dans les HNSCC. En outre, la présence de CTC indique une DFS (« disease free survival ») inférieure. Nous rapportons également pour la première fois un cas rare d’énumération extrêmement élevée de CTC détectées par le système CellSearch® chez un patient présentant un carcinome épidermoïde de la cavité buccale en utilisant. Le nombre absolu de CTC pourrait donc prédire une phase particulière de développement du cancer ainsi qu'une mauvaise survie, contribuant potentiellement à une prise en charge médicale personnalisée. De plus, nous décrivons une adaptation de la méthode CellSearch® qui nous avons développée pour détecter les cellules tumorales dans le liquide céphalo-rachidien de patients atteints de méningites carcinomateuses. Cette nouvelle approche permet une sensibilité nettement améliorée en comparaison avec la cytologie conventionnelle. La technologie CellSearch®, appliquée à des volumes limités des échantillons et permettant une augmentation du temps pré-analytique, pourrait ainsi avoir un grand intérêt dans le diagnostic de métastases leptoméningées chez les patients atteints d’un cancer d’origine épithéliale. Par une évaluation concomitante des CTC et des réponses lymphocytaires spécifiques aux AAT chez 24 patients avec HNSCC, nous avons trouvé que les CTC pourraient être un indicateur indépendant de la charge tumorale immunogène. L'absence de CTC, la présence de lymphocytes T spécifiques aux AAT, ou la combinaison de ceux-ci, étaient tous des paramètres montrant une tendance pour une meilleure survie globale ou une survie sans maladie. L’amplitude et les signatures fonctionnelles des lymphocytes T spécifiques aux AAT chez les patients atteints de HNSCC étaient associées à la présence de CTC. Ces résultats suggèrent qu’une évaluation concomitante de ces deux paramètres pourrait être plus informative sur le pronostic et potentiellement sur l’impact des traitements (notamment dans la perspective d’un traitement par des « immune checkpoints ») / We have evaluated herein two important parameters in the immunomonitoring of cancer patients: circulating tumor cells (CTC) as an indicator of “tumoral antigenic load” and tumor-associated antigens (TAA) specific T-cells. We firstly evaluated the diagnostic and prognostic value of CTC in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC) by a systematic review and meta-analysis. We came to the conclusion that current evidence identifies the CTC detection test as an extremely specific but low sensitive test in HNSCC. In addition, the presence of CTC indicates a worse disease-free disease (DFS). Also, we report for the first time a rare case of extremely high enumeration of circulating tumor cells detected in a patient with squamous cell carcinoma of the oral cavity using the CellSearch® system. The absolute number of CTC could therefore predict a particular phase of cancer development as well as a poor survival, potentially contributing to personalized health. In addition, we describe an adaptation of the CellSearch® method that we have developed for detecting tumor cells in the cerebrospinal fluid of patients with carcinomatous meningitis. This new approach reaches a significantly improved sensitivity compared to conventional cytology. CellSearch® technology, applied to limited sample volumes and allowing an increased pre-analytical time, may be of great interest in the diagnosis of leptomeningeal metastases in patients with epithelial cancer. By a concomitant evaluation of CTC and TAA-specific lymphocyte responses in 24 HNSCC patients, we describe that CTC could be an independent indicator of immunogenic tumor burden. The absence of CTC, the presence of TAA-specific T-cells, or the combination of these, were all parameters showing a trend for a better overall survival or DFS. The amplitude and functional signatures of TAA-specific T-lymphocytes in patients with HNSCC were associated with the presence of CTC. These results suggest that a concomitant evaluation of these two parameters may be more pertinent for prognosis assessment as well as for treatment impact, especially in “checkpoint-inhibitors” new immunotherapies

Les phénomènes cicatriciels et de carcinogenèse partagent des points communs et peuvent être définis comme des processus complexes et adaptatif régulés par les interactions entre l'hôte et le microenvironnement tissulaire. Après la chirurgie, la radiothérapie est la seconde modalité la plus efficace dans le traitement du cancer et une approche thérapeutique multimodale impliquant chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie est aujourd’hui classiquement utilisée. Des résultats récents suggèrent que, en plus des effets létaux sur les cellules tumorales, la radiothérapie modifie le microenvironnement tissulaire. Ces modifications affectent le phénotype cellulaire, le métabolisme des tissus, et les événements de signalisation entre les cellules.Les interactions complexes entre les cellules stromales et les cellules cancéreuses suscitent beaucoup d’intérêt et dans la première partie de ma thèse, j’ai exploré les interactions entre stroma et cellules de carcinome en réponse à la radiothérapie par modulation génétique du stroma après irradiation. J’ai constaté que les fibroblastes, indépendamment de leur statut RhoB, ne modulaient pas la radiosensibilité intrinsèque des TC- 1, mais produisaient des facteurs diffusibles capables de modifier le devenir des cellules tumorales. Ensuite, j’ai constaté que fibroblastes sauvages et RhoB déficients stimulaient la migration des TC-1 par des mécanismes distincts, impliquant respectivement TGF- β1 et MMP. J’ai également constaté que la co-irradiation, des fibroblastes et des TC- 1, abrogait le phénotype pro-migratoire des TC-1 par répression de la sécrétion du TGF- β et des MMP. Alors que le protocole de co-irradiation utilisé mime la situation clinique, mes résultats sont en désaccord avec les publications récentes et suggèrent que le stroma irradié ne renforce pas la migration des cellules tumorales mais au contraire pourrait être manipulé pour promouvoir une réponse immunitaire anti-tumorale.Deuxièmement, mes expériences in vivo, semblent confirmer les données obtenues in vitro et montrent que l’irradiation préalable du lit tumoral ne stimule ni croissance de la tumeur et ni sa dissemination. Nos résultats semblent montrer que l’irradiation du stroma ne favorise pas la migration des cellules de carcinome et ceci indépendamment de leur génotype. La Troisième Partie De Mon Projet, a été consacrée à l’étude des cellules tumorale circulantes (CTC) après la radiothérapie. En accord avec les résultats rapportés après la chirurgie, le nombre de CTC augmente dans la circulation sanguine après radiothérapie probablement à cause des lésions vasculaires radio-induites ou/et par induction d’EMT dans les cellules tumorales. Néanmoins ces CTC semblent être piégées dans la cavité cardiaque. La signification de la présence de ces CTC pour le développement métastatique n’est pas élucidée mais on peut suspecter un effet promoteur de métastase. Ainsi le microenvironnement pourrait avoir des effets antagonistes promoteurs ou inhibiteurs de malignité. / Wound healing and carcinogenesis are defined as complex, adaptive processes which are controlled by intricate communications between the host and the tissue microenvironment. A number of phenotypic similarities are shared by wounds and cancers in cellular signaling and gene expression. Radiotherapy is the second most effective modality of cancer treatment after surgery and can be used, either alone or in combination with chemotherapy. Recent findings suggest that radiotherapy apart from tumor cell death also rapidly and persistently modifies the tissue microenvironment. These modifications affect cell phenotype, tissue metabolism, bidirectional exchanges and signaling events between cells. The complex interactions between stromal cells and cancer cells are of immense interest and in The First Part of My Thesis, I tried to explore the crosstalk between stromal and carcinoma cells in response to radiotherapy by genetic modulation of the stroma and irradiation. We found that fibroblasts, irrespective of their RhoB status, do not modulate intrinsic radiosensitivity of TC-1 but produce diffusible factors able to modify tumor cell fate. Then we found that Wt and RhoB deficient fibroblasts stimulated TC-1 migration through distinct mechanisms respectively, TGF-β1 and MMP-mediated. We also found that co-irradiation of fibroblasts and TC-1 abrogated the pro-migratory phenotype by repression of TGF-β and MMP secretion. This result is highly relevant to the clinical situation and suggests that conversely to, the current view; irradiated stroma would not enhance carcinoma migration and could be manipulated to promote anti-tumor immune response. Secondly, our in vivo experiments, tends to confirm the in vitro data showing that irradiated tumor bed does not stimulate tumor growth and escape. Our results also challenges the view that irradiated stroma would promote migration of carcinoma cells as we show that independently from their genotype co-irradiation of fibroblasts and carcinoma cells repressed carcinoma cell migration and confirmations studies are currently performed in vivo. The Third Part of My Project, was dedicated to investigate the effect on CTC release after radiotherapy. Consistently with the results reported after surgery , the number of CTC increases in the blood stream after radiotherapy probably due to radiation-induced vascular injury induced or/and by EMT induction in tumor cells but these cells seemed to be entrapped into the cardiac cavity. The significance of these CTC to metastatic development is still under investigation but there is evidence for a metastasis-promoting effect of RT from animal studies.Thus the microenvironment can exert antagonist stimulatory or inhibitory effects on malignant cells.

Introdução: O diagnóstico precoce de câncer de próstata (CaP) é essencial para aumentar a sobrevida dos pacientes, mas os marcadores e métodos atuais não possuem sensibilidade e especificidade suficientes, tornando o diagnóstico ainda muito impreciso. Recentemente, as células tumorais circulantes (CTCs) têm surgido não como método de rastreio do CaP, mas sim como marcadores de prognóstico utilizando um arsenal de diversos alvos para a captura dessas células. Contudo, a busca por um método ou marcadores comuns para o rastreio, diagnóstico, prognóstico e monitoramento da doença ainda se apresenta com um dos principais objetivos técnico-científicos a ser alcançado. Objetivo: apresentar um novo marcador, o aptâmero A4 selecionado previamente por 3DCell SELEX na linhagem PC3, e avaliar sua capacidade de detectar CTCs por citometria de fluxo no sangue de pacientes com CaP virgens de tratamento e sob diferentes regimes terapêuticos. Material e métodos: o estudo avaliou 34 homens com CaP e 16 homens sem alterações prostáticas. Foi coletado o sangue em tubo com EDTA, e após proceder a lise de hemácias, as células nucleadas de cada paciente foram incubadas com o aptâmero A4 conjugado à biotina, e em seguida lavadas e incubadas com estreptoavidina-FITC para posterior análise em citometria de fluxo. Os percentuais de CTCs foram comparados entre os dois grupos de pacientes e correlacionados com idade, níveis de PSA, estadiamento e procedimentos terapêuticos adotados (bloqueio hormonal, radioterapia e cirurgia). O limite de detecção acima de 1% de CTCs foi considerado positivo, utilizando como base o percentual observado em todos os 16 controles negativos. Resultados: todos os pacientes foram diagnosticados como positivos independentemente do tempo de terapia ou do estadiamento, exceto um paciente sob bloqueio hormonal que não apresentou CTCs. O percentual de CTCs apresentou alta correlação com idade (R=0,75) e com os níveis de PSA (R=0,80) de forma exponencial, embora seis pacientes com altos índices de células circulantes apresentaram PSA<0,02ng/mL, considerados como falha bioquímica. Conclusão: nossos resultados preliminares indicam uma acurácia elevada de 98% e demonstra um grande potencial de aplicação dessa nova tecnologia diagnóstica tanto no rastreamento, quanto no monitoramento do tratamento do CaP, o qual deverá ser melhor investigado em população de risco. / Introduction: prostate cancer (PCa) early diagnosis is essential to boost patients’ life expectance. Although, current biomarkers and diagnosis methods do not present reliable sensibility and specificity, making the diagnosis rather imprecise. Recent methodologies have been using circulating tumor cells (CTCs), not for screening of PCa, but as prognosis indicators, employing a vast array of techniques to capture those cells. However, the search for a new biomarkers or diagnosis methods able to screen, diagnosis, assist in prognosis and in the disease monitoring still one of the major technical and scientific objectives to be achieved. Objective: To present a new biomarker for PCa, the aptamer A4, previous screened in the prostate cancer cell line PC3, using 3DCell SELEX. And to able to detect, by flow cytometry, CTCs in blood samples of PCa patients undergoing various treatment regimen. Material and methods: the study evaluated 34 PCa patients and 16 health controls. Blood samples were collected in EDTA tubes, and after erythrocytes lysis, nucleated cells were incubated with A4 aptamer conjugated with biotin, them the cells were washed and incubated with streptavidin-FITC for later flow cytometer analysis. Percentage of CTCs were compared between patient’s groups and correlated against age, PSA levels, staging and treatment regimen (hormonal blockade, radiotherapy and surgery). Detection limit above 1% of CTCs was considered positive, based on the percentage observed on all of the 16 negative controls. Results: all patients were positively diagnosed independently of therapy time or staging, except for one patient undergoing hormonal blockade therapy, which does not present detectable CTCs. CTCs percentage presented high correlation against age (R=0.75) and with PSA levels (R=0.80) with exponential behavior, although, six patients with high CTCs count presented PSA levels <0.02 ng/mL, and were considered was biochemical errors. Conclusion: Our preliminary results indicated high accuracy (98%) and demonstrate a potential application of this technology for diagnosis and screening, as well as in the monitoring of PCa evolution, which should be better investigated in the risk population. / Dissertação (Mestrado)

Introduction: Simultaneous detection of disseminated tumor cells (DTCs) and circulating tumor cells (CTCs) was shown to be associated with an especially poor prognosis and increased incidence of disease-related deaths in non-metastatic breast cancer patients. We analyzed the occurance of DTCs in bone marrow and CTCs in peripheral blood in patients with primary breast cancer, we evaluated the correlation of their presence with other prognostic markers and we investigated the changes in DTCs/CTCs number at different time points during treatment. Materials and methods: Blood of 50 patients with primary breast cancer were used for immunomagnetic separation and detection of circulating tumor cells using the commercial available system the AdnaTest Breast Cancer™ (AdnaGen GmbH, Langenhagen, Germany). Bone marrow aspirates from 50 patients were analyzed for DTCs by immunocytochemistry using the pancytokeratin antibody conjugated with FITC (Monoclonal Anti-Cytokeratin antibody F3418, Sigma Aldrich, USA). Results: DTCs were identified in 30% (15/50) and CTCs in 22% (11/50) of patients. We found that DTC positivity could point to a significantly high risk of larger primary tumor size (p- value 0.011) and significantly higher risk of lymph node involvement (p- value 0.002). For CTC positivity, no such...

La diffusion dans le sang des cellules tumorales circulantes (CTC) à partir de la tumeur primitive est un signe précoce d’invasivité tumorale et du risque de développer des métastases. Par conséquent, la capacité à les détecter de façon très sensible et spécifique est censée constituer un test cliniquement important pour le pronostic du cancer, le suivi des patients et la personnalisation de la thérapie. Les CTC sont des cellules rares, et plusieurs méthodes ont été proposées pour leur détection. La technique ISET (Isolation by Size of Epithelial/Tumor cells) se base sur la différence de taille des CTC par rapport aux cellules leucocytaires et a montré une très grande sensibilité d’isolement et spécificité d’identification des CTC. Elle permet l’analyse cytopathologique, immunologique et moléculaire des cellules isolées.Le cancer du rein représente 3% des cancers de l’adulte, dans 75% des cas il s’agit d’un carcinome rénal à cellules claires (RCC). Sur le plan génétique, il est un des rarissimes cancers solides caractérisé par des variations de l’ADN, il s’agit de mutations au niveau du gène VHL.Ce projet de recherche vise l’analyse comparative, moléculaire et cytopathologique, des CTC isolées à partir des patients avec RCC dans le but d’évaluer, par une approche moléculaire, les critères cytopathologiques diagnostiques des CTC. Notre étude a porté sur 29 patients ayant bénéficié de l’isolement des CTC par ISET avant toute intervention chirurgicale.L’analyse cytopathologique a été réalisée utilisant les critères décrits par l’équipe de P. Hofman pour définir les CTC (CNHC-MF) et les Cellules Atypiques Circulantes « CAC » (CNHC-UMF). L’analyse génétique par séquençage du gène VHL a été réalisée avec succès sur l’ADN de 205 cellules individuelles, sur l’ADN issu du tissu tumoral et sur l’ADN génomique de chaque patient.Sur les 29 tumeurs étudiées, 25 étaient caractérisées par des mutations du gène VHL. Cent soixante et une cellules, CTC et CAC, isolées à partir du sang de ces 25 patients, ont présenté des variations génétiques du gène VHL identiques à l’ADN issu du tissu tumoral. Il s’agit de 18 mutations différentes affectant les 3 exons de ce gène. Nous avons trouvé des CTC/CAC dans 29/30 des patients avec CCRC analysés. Des mutations VHL ont été trouvées dans 25 des 29 tumeurs CCRC correspondantes. Nous avons obtenu des résultats spécifiques VHL dans 205 des 327 CTC/CAC microdisséquées, comprenant 64 CTC et 141 CAC, selon l’analyse cytopathologique. Les mutations VHL ont été détectées en aveugle dans 57/64 CTC et dans 125/141 CAC. Cependant, nous avons observé que les 8 et 16 CTC et CAC restantes, respectivement, avaient été isolées de patients sans mutations VHL détectables dans le tissu tumoral.Conclusion : Ceci est la première étude comparative de diagnostic génétique et cytopathologique des CTC/CAC chez des patients avec un cancer solide, le CRCC. Nos résultats suggèrent que des critères cytopathologiques élargis pourraient être appliqués au diagnostic des CTC chez les patients avec CCRC. Bien que des études complémentaires et plus élargies soient maintenant nécessaires, cette méthode ouvre la voie à une approche génétique pour le diagnostic des Cellules Tumorales Circulantes / Dissemination in the circulating tumor cells (CTC) from the primary tumor is an early sign of tumor invasion and risk of metastases. Therefore, the ability to detect CTC through a very sensitive and specific test is expected to be clinically important for cancer prognosis, patient monitoring and customization of therapy. CTCs are rare cells, and several methods have been proposed for their detection. The ISET technique (Isolation by Size of Epithelial /Tumor cells) is based on the difference in size of CTC as compared to leucocytes and provides high sensitivity of CTC isolation and high specificity of CTC identification. This methods also allows cytopathological, immunological and molecular analyses of the isolated cellsKidney cancer accounts for 3% of adult cancers and is a clear cell renal cell carcinoma (RCC) in 75% of cases. RCC is one of very rare cancers characterized by a DNA mutations. IRCC tumor cells are in fact characterized by by mutations in the VHL gene. This research project aims at a comparative molecular and cytopathological analysis of, CTCs isolated from patients with RCC in order to evaluate, through a molecular approach, the diagnostic criteria used for cytopathological identification of CTC. Our study included 29 patients tested by the ISET technique before surgery.The cytopathological analysis was performed using the criteria described by the group of P. Hofman to define CTC (CNHC-MF) and Circulating Atypical Cells "CAC" (UMF-CNHC). Genetic analysis of the VHL gene was successfully performed by sequencing on DNA from 205 individual cells isolated by ISET, on DNA from tumor tissue and on genomic DNA from each patient. Of the 29 tumors studied, 25 were characterized by mutations in the VHL gene. One hundred and sixty-one cells, CTC and CAC, isolated from the blood of the 25 patients, with the tumor having VHL mutation, showed genetic variations in the VHL gene identical to those found in the DNA from the tumor tissue. We found 18 different mutations affecting the three exons of this gene.We found CTC/CAC in 29/30 analyzed patients with CCRC. VHL mutations were found in the tumor of 25 out of the corresponding 29 CCRC tumors. Among 327 microdissected CTC/CAC, we obtained VHL-specific results in 205 including 64 CTC and 141 CAC, according to the cytopathological analysis. VHL mutations were blindly detected in 57/64 CTC and in 125/141 CAC. However, we then observed that the 8 and 16 residual CTC and CAC, respectively, had been isolated from patients without detectable VHL mutations in the tumor tissue. Conclusion: This is the first study comparing genetic and cytopathological diagnosis of CTC/CAC in patients with a solid cancer, CRCC. Our results suggest that broaden cytopathological criteria could be applied to the diagnosis of CTC in patients with CCRC. Although further and larger studies are now needed, this approach opens the way to a genetic approach for the accurate diagnosis of Circulating Tumor Cells.

Objective: We aimed to assess the prognostic value of circulating tumor cells (CTC) in patients with advanced gastric and gastroesophageal adenocarcinomas. Methods: The presence of CTC was evaluated in 62 patients with advanced gastric and gastroesophageal adenocarcinomas before systemic therapy and at follow-up through immunomagnetic enrichment for mucin 1- and epithelial cell adhesion molecule (EpCAM)-positive cells, followed by real-time RT-PCR of the tumor-associated genes KRT19 , MUC1 , EPCAM , CEACAM5 and BIRC5 . Results: The patients were stratified into groups according to CTC detection (CTC negative: with all marker genes negative; CTC positive: with at least 1 of the marker genes positive). Patients who were CTC positive at baseline had a significantly shorter median progression-free survival (PFS; 3.5 months, 95% CI: 2.9–4.2) and overall survival (OS; 5.8 months, 95% CI: 4.5–7.0) than patients lacking CTC (PFS 10.7 months, 95% CI: 6.9–14.4, p < 0.001; OS 13.3 months, 95% CI: 8.0–18.6, p = 0.003). Alterations in the marker profile during the course of chemotherapy were not predictive of clinical outcome or response to therapy. Yet, a favorable clinical response depended significantly on CTC negativity (p = 0.03). Conclusion: Our data suggest that the presence of CTC is a major predictor of outcome in patients with gastric and gastroesophageal malignancies.

Introduction: The presence of circulating tumor cells (CTC) in the peripheral blood has been associated with worse prognosis and early relapse in breast cancer patients. CTC determination in the peripheral blood has been considered as a liquid biopsy. The aim of this project was to analyze the presence of CTC followed by their molecular characterization with the potential use not only as a new biomarker for real-time monitoring of therapy efficacy but also as a suitable tool for patient's stratification and individualization of treatment for breast cancer. Methods: A total of 54 patients with diagnosed early breast cancer were enrolled into a prospective study. Ten millilitres of peripheral blood were sequentially collected to test for the presence and characterization of CTC during the follow-up of patients. CTC isolation and detection was performed by AdnaTest BreastCancer™ (AdnaGen AG, Germany), which is based on the detection of EpCAM, HER2 and MUC1 specific transcripts in enriched CTC- lysates. cDNA from isolated CTC has been further used for newly optimized qPCR assays for breast tumor and therapy resistance associated genes: TOP1, TOP2A, CSTD, ST6GAL, KRT19 and reference gene actin. qPCR results have been analyzed by Genex software (MultiD Analysis). Results: 195 blood samples have been...