Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-08-30T12:00:23Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_IntegracaoEstudosCromossomicos.pdf: 1817366 bytes, checksum: 3c1634ef74508886d0d4b52b6d5a125d (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2017-08-31T12:39:11Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_IntegracaoEstudosCromossomicos.pdf: 1817366 bytes, checksum: 3c1634ef74508886d0d4b52b6d5a125d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-31T12:39:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_IntegracaoEstudosCromossomicos.pdf: 1817366 bytes, checksum: 3c1634ef74508886d0d4b52b6d5a125d (MD5) Previous issue date: 2016-05-16 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / FAPESPA - Fundação Amazônia de Amparo a Estudos e Pesquisas / A Ordem Gymnotiformes é composta por 219 espécies válidas, que estão distribuídas em cinco famílias. Os gêneros mais investigados são Eigenmannia e Gymnotus. Nosso trabalho concentrou-se na família Rhamphichthyidae, gênero Rhamphichthys que, assim como os demais Gymnotiformes, apresentam maior abundância e diversidade na região Amazônica. Foram realizadas coletas nos municípios de Abaetetuba, Barcarena e Belém (Pará) e em Tefé, Reserva Ecológica de Mamirauá (Amazonas), com objetivo de melhor definir as espécies, através da integração de dados citogenéticos clássicos, citogenômicos (através das sondas de sequências repetitivas de DNA) e do DNA Barcoding e assim compreender a evolução deste gênero de peixes na Amazônia. Foram identificados um novo citótipo para o gênero R. rostratus com a presença de cromossomos B e fórmula cariotípica FC=48m/sm+2st/a+(5-10)B, um novo citótipo da região do Amazonas, Rhamphichthys sp. FC = 44m/sm +6st/a, e também de R. marmoratus, FC = 46+4st/a no estado do Pará. A análise das sequências repetitivas nos novos citótipos demonstrou que as sondas de 18S são coincidentes com as regiões de constrição secundárias que são marcadas com nitrato de prata na técnica de coloração clássica da NOR. As sondas de DNA 5S marcam sítios múltiplos, deixando evidente que a evolução da família de genes ribossomais ocorre de maneira independente, pelo menos no gênero Rhamphichthys. Os retroelementos REX1 e REX3 marcaram de forma dispersa pelo genoma, como já foi descrito na literatura para outros peixes. O elemento REX1 marca ainda a região de constrição secundária em R. rostratus, o que também já foi descrito em outras espécies de peixes que habitam ambientes poluídos, expostos a estresses ambientais e também em indivíduos híbridos. A análise de DNA barcoding permitiu a construção de uma árvore bayesiana, que está de acordo com os dados de citogenética. Assim, as populações de R. rostratus com e sem cromossomos B constituem taxa distintos. Por sua vez, a amostra de Mamirauá, aqui denominada Rhamphichthys sp. por não haver sido descrita formalmente, é mais similar tanto nos dados cariotípicos como na análise de barcoding a R. hanni do Sudeste brasileiro. Nossos dados apontam para um número subestimado de espécies em Rhamphichthys, o que reforça a necessidade de uma revisão taxonômica para o gênero. / The Order Gymnotiformes is composed by 219 valid species, which are distributed in five families. The most investigated genera are Eigenmannia and Gymnotus. Our work focused on family Rhamphichthyidae, genus Rhamphichthys that, like other Gymnotiformes, present greater abundance and diversity in the Amazon region. Sampling was carried out in the municipalities of Abaetetuba, Barcarena and Belém (Pará) and Tefé, Ecological Reserve Mamirauá (Amazonas), in order to better define the species, through the integration of classical cytogenetic data, cytogenomic analysis (probes for repetitive DNA sequences) and DNA Barcoding and thus understand the evolution of this fish in the Amazon. A new karyotype was identified for R. rostratus with the presence of B chromosomes and karyotype formula FC = 48m / sm + 2st / a + (5-10) B, as well as a new cytotype from the Amazon region, in Rhamphichthys sp. FC = 44m / sm + 6st / a, and also in R. marmoratus, FC = 46 + 4st / a in the state of Pará. The analysis of repetitive sequences in the new cytotypes demonstrated that probes 18S coincided with the regions of constriction secondary that are marked with silver nitrate in the classical NOR staining technique. The DNA probes 5S mark multiple sites, letting clear that the evolution of the ribosomal gene family is independent, at least in the genus Rhamphichthys. Retroelements REX1 and REX3 marked in a dispersed fashion throughout the genome, as already described in literature for other fishes. The REX1 element also marks the secondary constriction in R. rostratus, which has also been described in other species of fishes that inhabit polluted environments, exposed to environmental stresses and also in hybrid individuals. The barcoding DNA analysis allowed the construction of a Bayesian tree, which is in agreement with the cytogenetic data. Thus, populations of R. rostratus with and without B chromosomes are separate taxa. In turn, the sample from Mamirauá, herein called Rhamphichthys sp., since it was not been formally described, it is more similar in both karyotypic data as the barcoding analysis with R. hanni from southeastern Brazil. Our data let clear that the number of species in Rhamphichthys is underestimated, which reinforces the need for a taxonomic revision of the genus.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:42:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 897621 bytes, checksum: e2a579de88f1b70bef922be819992a6c (MD5) Previous issue date: 2013-03-19 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / The fluorescente in situ hybridization advent introducted the cytogenetics in molecular era, with methodological advances that enable the investigation of chromosome science at different levels. Among these advances, it stands out the unequivocally identification of homologous chromosomes pairs, the specific sequences location, the direct prospecting of chromosomal abnormalities, besides providing high-resolution information on the structure and organization of chromosomes. Within the strategies of molecular cytogenetics, microdissection and DOP-PCR techniques have been widely used in the chromosome-specific probes construction. However, the absence of well-established and reproducible protocols, besides the need for relatively large number of chromosomes for micromanipulation, this technique has been limited. The present study aimed to standard a methodology for chromosome-specific probes construction, involving micromanipulation and DOP-PCR techniques. Human lymphocyte cultures were carried out to obtain metaphases, both male and female origin. In situ amplification (PRINS) reaction was performed on a slide containing metaphase, applying 50 μL of reaction mix with Platinun® Taq DNA Polymerase High Fidelity 1 U, enzime reaction buffer, MgSO4 2 mM, dNTPs 200 μM and primer 4 μM. Then, ten X chromosomes fragments were microdissected using microneedles coupled to a phase contrast microscope and transferred to a tube containing 0.2 μL proteinase K, where deproteinizated at 37 °C for 24 hours. The material was amplified by DOP-PCR in 15 μL of reaction, and marked with Tetramethyl-rhodamine-5-dUTP. The probe was denatured for 10 minutes at 99 °C in 35 μL of hybridization mix containing: formamide 50 %, SSC 2X, Dextran Sulfate 10 %, 1 mg of Cot-1 and 200 ng of labeled probe. This mix was applied on the slide, which was denatured at 75 ºC for 8 minutes and then subjected to hybridization at 37 °C for 20 hours. After hybridization, stringency washes and counter-staining with DAPI were performed, and the material was analyzed with a fluorescence microscope coupled to an image capture system. A subcentromeric X chromosome specific probe was obtained, with an unique mark in male metaphase and two marks in female metaphases, with one or two fluorescent signals in interphase nuclei. / Com o advento da hibridização in situ fluorescente, a citogenética foi introduzida na era molecular, com avanços metodológicos que possibilitaram a investigação em vários níveis da ciência dos cromossomos. Destaca-se entre esses avanços a identificação de pares de cromossomos homólogos de forma inequívoca, a localização de sequências específicas, a prospecção direta de anormalidades cromossômicas, além de proporcionar informações de alta-resolução sobre a estrutura e organização dos cromossomos. Dentro das estratégias da citogenética molecular, as técnicas de microdissecção e de DOP-PCR têm sido muito utilizadas na construção de sondas cromossomo-específicas. Entretanto, a ausência de protocolos bem estabelecidos e reprodutíveis, além da necessidade de captura por micromanipulação de um número relativamente grande de cromossomos, essa técnica tem sido limitada quanto à sua aplicação mais ampla. O presente trabalho teve como objetivo padronizar uma metodologia para construção de sondas cromossomo-específicas, associando as técnicas de micromanipulação e DOP-PCR. Culturas de linfócitos humanos foram realizadas para a obtenção de lâminas contendo metáfases, tanto de origem masculina quanto feminina. A reação de amplificação in situ (PRINS) foi realizada sobre uma lâmina contendo metáfases, aplicando uma mistura de 50 μl de reação, contendo 1,0 U de Platinun® Taq DNA Polymerase High Fidelity, tampão de reação da enzima, 2 mM de MgSO4, 200 μM de dNTPs e 4 μM de primer. Em seguida, dez fragmentos de cromossomos X foram microdissectados utilizando microagulhas acopladas a um microscópio de contraste de fase e transferidos para um tubo de 0,2mL contendo proteinase K, de onde seguiu para a desproteinização a 37 ºC por 24 horas. O material foi amplificado por DOP-PCR em 15 μl de reação, e marcado com Tetramethyl-rhodamine-5-dUTP. A sonda foi desnaturada por 10 minutos a 99 ºC em 35 μL de uma mistura de hibridização contendo: 50 % Formamida, 2X SSC, 10 % Dextran Sulfato, 1 μg de Cot-1 e 200 ng da sonda marcada. Essa mistura foi aplicada na lâmina, que foi desnatura a 75 ºC por 8 minutos e depois foi submetida à hibridização a 37 ºC por 20 horas. Após a hibridização, foram realizadas as lavagens de estringência, contra-coloração com DAPI, e visualização do material em microscópio de fluorescência acoplado a um sistema de captura de imagens. Uma sonda específica para a região subcentromérica do cromossomo X foi obtida, apresentando uma marcação em metáfases de indivíduos masculinos e duas marcações em metáfases de indivíduos femininos, além de um ou dois sinais fluorescentes nos núcleos interfásicos.

Submitted by Angela Maria de Oliveira (amolivei@uepg.br) on 2017-10-19T19:03:18Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Lucas Rosolen de Almeida Mello.pdf: 2555328 bytes, checksum: 3d7ce3cf485cd835d38b843b7b692900 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-19T19:03:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Lucas Rosolen de Almeida Mello.pdf: 2555328 bytes, checksum: 3d7ce3cf485cd835d38b843b7b692900 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / A ordem Coleoptera é a mais diversificada entre todos os seres vivos, existindo ampla possibilidades de estudos no que diz respeito à diversidade cariotípica e aos mecanismos de diferenciação. As espécies da subtribo Oedionychina (Alticinae; Chrysomelidae) são interessantes para estudos evolutivos, pois possuem cromossomos sexuais gigantes e assinápticos durante a meiose, podendo ser considerados altamente derivados. Assim, o objetivo do presente estudo foi propor os mecanismos moleculares envolvidos no processo de diferenciação e evolução dos cromossomos sexuais em espécies do gênero Omophoita. A análise de mapeamento, utilizando sondas de DNA C0t-1 total (cinética de reassociação de DNA altamente e moderadamente repetitivo) mostrou marcações distribuídas em todos os cromossomos, especialmente nos cromossomos sexuais. A hibridação cruzada entre as espécies produziu um padrão de localização muito semelhante, evidenciando que a maior parte do genoma é compartilhada entre as espécies de Omophoita. Análise em conjunto dos resultados obtidos com bandas C, fluorocromos e C0t-1 mostram que a heterocromatina das espécies em grande parte é composta de DNA repetitivo distribuída ao longo dos cromossomos sexuais e autossomos. O mapeamento cromossômico com sondas de microssatélites (SSRs) mostrou marcações conservadas para os autossomos e diversificadas para os cromossomos sexuais, evidenciando uma diferença de composição de SSRs dos cromossomos sexuais entre as espécies. Os resultados de hibridação com clones de elementos de transposição mostraram alguns padrões semelhantes aos obtidos com SSRs, podendo indicar que ao longo do processo evolutivo das espécies esses elementos estiveram presentes no processo de diferenciação. Considerando todos os resultados, pode se propor uma diferença de constituição nos cromossomos sexuais das espécies e, desta forma, inferir que os DNAs repetitivos tiveram um papel evolutivo na diferenciação desses cromossomos na subtribo. / The order Coleoptera is the most diverse of all living beings, with a wide possibilities of studies with regards to the karyotype diversity and the mechanisms of differentiation. The species of the subtribe Oedionychina (Alticinae; Chrysomelidae) are interesting for evolutionary studies due to the giant sex chromosomes and asynaptic during meiosis, can be considered highly derivate. The objective of this study was to propose the molecular mechanisms involved in the differentiation process and evolution of sex chromosomes in the Omophoita genus. The Mapping analysis using DNA C0t-1 total (reassociation kinetics highly and moderately repetitive DNA) showed marks distributed in all chromosomes, especially in the sex chromosomes. The cross-hybridization among species produced a very similar location pattern, indicating that most of the genome is shared among species Omophoita. Analysis of the results obtained in conjunct with C-bands, fluorochromes and C0t-1 together show that the heterochromatin of the species is largely composed of repetitive DNA distributed throughout the autosomes and sex chromosomes. Chromosome mapping with microsatellite (SSRs) probes showed conserved patterns for autosomes, but diversified to sex chromosomes, showing difference in SSRs composition in the sex chromosomes, of the species. The results of hybridization with transposition element clones showed some similarities patterns to the SSRs markers, which may indicate that throughout the evolutive process of species these elements were present. Considering all results we can propose differences in the constitution of sex chromosomes of the species studied, thus, we can infer an evolutionary role of repetitive DNA in the differentiation of chromosomes in the subtribe.

A Síndrome de Martin-Bell é uma forma hereditária de retardo mental determinada pela perda da expressão do gene FMR1 que está associado com a expansão da repetição dos tri-nucleotídeos citosina-guanina¬-guanina (CGG). Os indivíduos com um alto grau dessa expansão apresentam o silenciamento da expressão desse gene, com conseqüente alteração no desenvolvimento do sistema nervoso do embrião, causando danos neurológicos irreparáveis. A citogenética é uma metodologia clássica que contribui para o diagnóstico da síndrome em casos sem esclarecimentos, porém sua sensibilidade isoladamente em muitos casos é insuficiente para um diagnóstico positivo mesmo diante de características clínicas evidentes. Na busca de uma alternativa para suprir esta necessidade de definir exatamente as alterações encontradas em cada caso propôs-se a otimização de uma PCR de alta fidelidade no diagnóstico diferencial da Síndrome e simultaneamente comparar com os dados da citogenética clássica. Para tanto, foram coletadas amostras de sangue periférico de 102 pacientes e avaliou-se 100 a 150 metáfases para cada indivíduo pela citogenética clássica e para a PCR duplex. Os resultados demonstram pelo teste de Kruskal-Wallis que a PCR com a citogenética não apresentou diferenças significativas (p>0,05). Porém quando avaliadados pelo índice de Kappa sugere-se que os dois critéiros de diagnósticos devem ser utilizados simultaneamente com caracteristicas clínicas do paciente. A PCR mostrou-se rápida e com custo relativamente menor, sendo portanto, aplicável no auxílio ao aconselhamento genético dos indivíduos e suas famílias, bem como para um acompanhamento psico-pedagógico adequado. / The Martin-Bell Syndrome is a heredity mental retard form determined by the loss of FMR1 gene expression which is associated with the tri-nucleotides cytosine-guanine-guanine (CGG) repetition expansion. The individuals showing a high degree of this expansion present the silencing of this gene expression, with a consequent alteration of the embryo nervous system evolution, causing irreparable neurological damage The cytogenetics is a classical methodology that contributes for diagnosing the syndrome in cases without clarification, thus its sensitivity isolated in many cases is insufficient for a positive diagnosis even in front of evident clinical characteristics. On searching for an alternative to fulfill this need to define the found alterations in each case, an optimization of a high fidelity PCR to Syndrome diagnosis and simultaneously to compare with classical cytogenetics. Peripheral blood samples were collected from 102 patients for evaluating 100 to 150 metaphases evaluation by classical cytogenetics for each sample and to duplex PCR. The results showed by the Kruskal-Wallis test that the PCR with the cytogenetics have not presented significant differences (p>0,05). However, when evaluated by the Kappa index it was suggested that the two diagnosis criteria should be used simultaneously with patient s clinical characteristics. The PCR showed itself quick and with a relatively lower cost , and in this way, applicable in helping genetically counseling individuals and their families, as well as sending them to a more adequate psycho-pedagogical treatment.

A Síndrome de Martin-Bell é uma forma hereditária de retardo mental determinada pela perda da expressão do gene FMR1 que está associado com a expansão da repetição dos tri-nucleotídeos citosina-guanina¬-guanina (CGG). Os indivíduos com um alto grau dessa expansão apresentam o silenciamento da expressão desse gene, com conseqüente alteração no desenvolvimento do sistema nervoso do embrião, causando danos neurológicos irreparáveis. A citogenética é uma metodologia clássica que contribui para o diagnóstico da síndrome em casos sem esclarecimentos, porém sua sensibilidade isoladamente em muitos casos é insuficiente para um diagnóstico positivo mesmo diante de características clínicas evidentes. Na busca de uma alternativa para suprir esta necessidade de definir exatamente as alterações encontradas em cada caso propôs-se a otimização de uma PCR de alta fidelidade no diagnóstico diferencial da Síndrome e simultaneamente comparar com os dados da citogenética clássica. Para tanto, foram coletadas amostras de sangue periférico de 102 pacientes e avaliou-se 100 a 150 metáfases para cada indivíduo pela citogenética clássica e para a PCR duplex. Os resultados demonstram pelo teste de Kruskal-Wallis que a PCR com a citogenética não apresentou diferenças significativas (p>0,05). Porém quando avaliadados pelo índice de Kappa sugere-se que os dois critéiros de diagnósticos devem ser utilizados simultaneamente com caracteristicas clínicas do paciente. A PCR mostrou-se rápida e com custo relativamente menor, sendo portanto, aplicável no auxílio ao aconselhamento genético dos indivíduos e suas famílias, bem como para um acompanhamento psico-pedagógico adequado. / The Martin-Bell Syndrome is a heredity mental retard form determined by the loss of FMR1 gene expression which is associated with the tri-nucleotides cytosine-guanine-guanine (CGG) repetition expansion. The individuals showing a high degree of this expansion present the silencing of this gene expression, with a consequent alteration of the embryo nervous system evolution, causing irreparable neurological damage The cytogenetics is a classical methodology that contributes for diagnosing the syndrome in cases without clarification, thus its sensitivity isolated in many cases is insufficient for a positive diagnosis even in front of evident clinical characteristics. On searching for an alternative to fulfill this need to define the found alterations in each case, an optimization of a high fidelity PCR to Syndrome diagnosis and simultaneously to compare with classical cytogenetics. Peripheral blood samples were collected from 102 patients for evaluating 100 to 150 metaphases evaluation by classical cytogenetics for each sample and to duplex PCR. The results showed by the Kruskal-Wallis test that the PCR with the cytogenetics have not presented significant differences (p>0,05). However, when evaluated by the Kappa index it was suggested that the two diagnosis criteria should be used simultaneously with patient s clinical characteristics. The PCR showed itself quick and with a relatively lower cost , and in this way, applicable in helping genetically counseling individuals and their families, as well as sending them to a more adequate psycho-pedagogical treatment.