Phosducin-like protein (PhLP), a G protein beta gamma subunit dimer binder and G protein signaling regulator, was suggested to regulate the activity of cytosolic chaperonin CCT by their high affinity interaction. In the present study, the three-dimensional structure of PhLP:CCT complex has been solved by cryoelectron microscopy. PhLP was found to bind only one of the chaperonin rings with both N- and C-terminal domains. It spans the central folding cavity of CCT and interacts with two opposite sides of the top apical region, inducing the constraining of the entry of the folding cavity. These findings support a putative role of PhLP as a co-chaperone similar to prefoldin. Docking studies with the atomic model of PhLP generated from several known structures of the homologous phosducin (Pdc) together with the immuno-EM studies have provided more details of the complex structure and predicted some regions of PhLP and the subunits of CCT involved in the interaction. Taking advantage of the fact that Pdc is highly homologous to PhLP but lack of binding to CCT, the regions of PhLP involved in the interaction with CCT were determined by testing various PhLP/Pdc chimeric proteins in the CCT binding assay. In the other part of this dissertation, the physiological role of PhLP in G protein signaling was investigated. Cellular expression of PhLP was blocked using RNA interference targeting PhLP. Together with overexpression of PhLP variants and kinetic studies of G protein beta gamma dimer formation, PhLP was determined to be a positive mediator of G protein signaling and essential for G protein beta gamma dimer expression and dimer formation. Phosphorylation of PhLP at serines 18—20 by protein kinase CK2 was required for G protein beta gamma dimer formation, while a high-affinity interaction of PhLP with CCT appeared unnecessary. Interestingly, G protein beta subunit was found to interact with CCT by co-immunoprecipitation and PhLP over-expression increased the binding of G protein beta subunit to CCT. These results suggest that PhLP and CCT act as co-chaperones in the folding and assembly of the G protein beta gamma subunit dimer by forming a ternary PhLP-Gbeta-CCT complex that is a necessary intermediate in the assembly process.

L’adaptation des cellules à leur environnement externe repose sur la transduction adéquate de signaux régulés par une pléthore d'événements moléculaires. Parmi ces événements moléculaires, les modifications post-traductionnelles (MPT) de protéines aident à intégrer, à traduire et à organiser de façon spatiotemporelle ces signaux pour que les cellules puissent réagir aux stimuli externes. Parmi les modifications post-traductionnelles, les petites protéines de la famille de l’Ubiquitine (Ublps, Ubiquitin-like proteins) jouent un rôle majeur dans presque toutes les voies de signalisation. Cette thèse rapporte des études fonctionnelles et structurales des interactions covalentes et non covalentes entre SUMO (Small Ubiquitin related MOdifier), un membre de la famille des Ublps, et trois protéines d'échafaudage, TIF1beta, le corépresseur universel des protéines KRAB-multidoigt de zinc, PIAS1, une ligase E3 pour SUMO et PML, un suppresseur de tumeur. La première étude rapporte l'identification et la caractérisation biochimique des sites de SUMOylation de TIF1beta. Nous avons déterminé que la modification covalente de six résidus lysine par SUMO est essentielle à l’activité de répression de la transcription induit par TIF1beta. En outre, nous présentons des évidences indiquant que la SUMOylation de TIF1 exige non seulement sa capacité à homo-oligomériser, mais est aussi positivement régulée par son interaction avec le domaine KRAB des protéines à doigts de zinc. Partant de ce constat, nous postulons que les protéines KRAB-multidoigt de zinc recrutent leur corépresseur TIF1betaà des gènes cibles, mais aussi accentuent son activité répressive grâce à l'augmentation de sa SUMOylation. Notre seconde étude révèle qu’en plus de réprimer la transcription en tant que MPT covalente, SUMO joue aussi un rôle important dans la répression en tant que partenaire non covalent d’interactions protéine-protéine. Nous avons montré que SUMO interagit simultanément avec deux enzymes de la machinerie de SUMOylation, l’unique enzyme de conjugaison E2, UBC9, et la ligase E3 PIAS1 au sein d’un complexe ternaire répresseur. En outre, nous révélons que la formation du complexe ternaire PIAS1:SUMO:UBC9 est modulée par le niveau de phosphorylation de résidus sérine juxtaposés à un motif d’interaction avec SUMO (SIM) dans PIAS1. Ainsi, SUMO agit comme un adaptateur spécifique qui stabilise les interactions UBC9 E2: E3 PIAS1. Partant de ce constat, nous proposons que les enzymes E2 et E3 des autres systèmes Ublps exploitent des mécanismes similaires dans le cadre de leur fonction Enfin, notre troisième étude explore la régulation des interactions non covalentes de SUMO par la phosphorylation. En utilisant une combinaison d'études in vivo et in vitro, nous démontrons que l'interaction entre SUMO1 et PML est régi par la phosphorylation dépendant de CK2 sur quatre résidus sérine de PML. Les structures cristallographiques des complexes PML-SIM:SUMO1 révèlent que les phospho-sérines de PML contactent des résidus de la région basique de SUMO1. Sachant que la kinase CK2 peut être induite par des kinases activables par le stress, ces résultats suggèrent que les interactions non-covalentes avec SUMO sont modulées par le stress cellulaire. Sur la base de cette constatation, nous postulons que des événements analogues affectent des protéines contenant des séquences SIM ciblées par CK2. En résumé, cette étude révèle qu’en plus de son rôle de MPT, SUMO peut fonctionner comme un adaptateur permettant des interactions spécifiques entre protéines tel que pour les enzymes E3 et E2. / Cell adaption to the external environment relies on proper signal transduction that is orchestrated by a plethora of molecular events. Among these molecular events, post-translational modifications (PTMs) of proteins help to spatiotemporally integrate, translate and dispatch signals so cells can respond to external stimuli. Among these post-translational modifications, the Ubiquitin-like proteins (Ublps) play a major role in almost all signaling pathways. This thesis reports functional and structural studies of the covalent and non-covalent interactions between the Small Ubiquitin-related MOdifier (SUMO), a member of the Ublps family, and three scaffold proteins, TIF1beta, the corepressor of KRAB-Multifinger proteins, PIAS1, a SUMO E3 ligase and the Promyleocytic leukemia (PML) tumor suppressor protein. The first study reports the identification and the biochemical characterization of TIF1betaSUMOylation sites. We mapped six SUMOylation sites in TIF1beta and determined that the covalent modification of these sites by SUMO is essential for its transcriptional repression activity. In addition, we present evidence indicating that SUMOylation of TIF1beta requires not only its ability to homo-oligomerize, but is positively regulated through its interaction with KRAB domains found in zinc-finger proteins. Based on this finding, we postulate that these KRAB domain containing multifinger proteins not only recruit TIF1beta co-repressor to target genes but also increase its repressive activity through enhancement of its SUMOylation. The work in the second study reveals that in addition to suppressing transcription as a covalent PTM, SUMO plays an important role in repression as a non-covalent protein-protein interaction partner. We determine that SUMO can form a repressive complex by simultaneously forming non-covalent interactions with UBC9 and PIAS1, the E2 and E3 enzymes in the SUMOylation system. In addition, we report that the formation of the PIAS1:SUMO:UBC9 ternary complex is modulated by the phosphorylation of serine residues juxtaposed to a SUMO-Interacting Motif (SIM) found in PIAS1. Thus SUMO acts as a specific adaptor that stabilizes UBC9 E2: PIAS1 E3 interactions. Based on this finding, we propose that the E2 and E3 enzymes from other Ublps systems exploit similar mechanisms as part of their function Finally, our third study explores the regulation of SUMO non-covalent interactions by phosphorylation. Using a combination of in vivo and in vitro studies we demonstrate that the interaction between SUMO1 and PML is governed by CK2-dependent phosphorylation of four serine residues in PML. Crystal structures of PML-SIM:SUMO1 complexes reveal that these PML phospho-serine specifically contact SUMO1 basic patch residues. Since CK2 kinase is induced by stress activated kinases pathways, this indicates that SUMO non-covalent interactions are regulated by cellular stress. Based on this finding, we postulated that analogous events influence other CK2-targeted SIM-containing proteins. In summary, this study reveals that in addition to its well described function as PTM, SUMO can function as an adaptor enabling specific proteins interactions such as functional E3:E2 enzymes pairs.

La protéine kinase caséine kinase 2 (CK2) est une sérine/thréonine kinase hautement pléiotrope dont la liste des substrats est supérieure à 500 protéines, lesquelles sont impliquées dans un large éventail de fonctions cellulaires. Les sous-unités catalytiques de CK2 (alpha et/ou alpha') sont constitutivement actives soit seules soit en combinaison avec les sous-unités régulatrices béta pour former une protéine hétérotétramérique (holoenzyme). Une troisième isoforme de la sous-unité catalytique, désignée CK2α'', a été découverte plus récemment et peu d'informations sont actuellement disponibles. L'activité hautement constitutive de CK2 est suspectée de contribuer au phénomène de néoplasie. Une stratégie de conception d'inhibiteurs tétracycliques ciblant le site ATP de la CK2 a permis l'élaboration de trois séries de composés comportant le motif indéno[1,2-b]indole. Un procédé multi-étapes de synthèse a permis de fonctionnaliser précisément le cycle D du noyau indéno[1,2-b]indole et de générer une première chimiothèque de molécules originales. Toutes les molécules finales ont été testées sur la protéine kinase humaine CK2 (Muenster) et certaines ont présentées des CI50 de l'ordre du submicromolaire. L'analyse des Relations Structure-Activité (SAR) et la construction d'un modèle 3D-QSAR (Duesseldorf) a contribué à affiner le choix des substituants introduits sur le châssis moléculaire développé. Les indéno[1,2-b]indoles fonctionnalisés les plus prometteurs ont été également testés sur d'autres cibles biologiques comme la phosphatase CDC25A (Metz) et la kinase DYRK1B (Saarbruecken). Des études de modélisation moléculaire (Duesseldorf) utilisant les données cristallographiques disponibles de l'enzyme ont permis d'analyser les interactions ligand-protéine. Les inhibiteurs les plus puissants in vitro ont été testés sur quatre lignées cellulaires normales afin d'établir leur profil cytotoxique (Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon) / Synthesis and evaluation of indéno[1,2-b]indole derivatives as potential inhibitors of human protein kinase CK2 Protein kinase casein kinase 2 (CK2) is a serine/threonine kinase highly pleiotropic listed substrates it is greater than 500 proteins, which are involved in a wide range of cellular functions. The catalytic subunits of CK2 (α and/or α') are constitutively active either alone or in combination with the regulatory subunits to form a hetero- beta protein holoenzyme). A third isoform of the catalytic subunit, designated CK2 α', was discovered more recently and little information is currently available. The high constitutive activity of CK2 is suspected of contributing to the phenomenal of neoplasia. A design strategy tetracyclic inhibitors targeting the ATP site of CK2 resulted in the development of three series of compounds containing the motif indeno[1,2-b]indole. A multi-step synthesis process has specifically functionalize the D ring of the core indeno[1,2-b]indole and generate a first combinatorial library of original molecules. All final compounds were tested on human protein kinase CK2 (Muenster), and some have reported IC50 of the order of sub-micromolar. Analysis of Structure-Activity Relationships (SAR) and the construction of a 3D-QSAR model (Duesseldorf) helped to refine the choice of substituents introduced into the moleculair frame developed. The indeno[1,2-b]indole the most promising functionalized indoles were also tested on other biological targets such as phosphatase CDC25 A (Metz) and kinase DYRK1B (Saarbruecken). Of molecular modeling studies (Duesseldorf) using the crystallographic data of the enzyme were used to analyze protein-ligand interactions. The most potent in vitro inhibitor were tested on four normal cell lines to determine their cytotoxic profile (Cancer Research Center of Lyon)

L’eczéma allergique de contact (EAC) est une réaction inflammatoire aiguë médiée par les lymphocytes T (LT), survenant suite à l’exposition répétée de la peau avec une molécule allergisante présente dans l’environnement quotidien ou professionnel. Les molécules allergisantes sont des composés de faible poids moléculaire, appelés haptènes, qui activent les cellules dendritiques (DC). Les DC jouent un rôle essentiel dans la mise en place d’un EAC : elles acquièrent un phénotype mature, contrôlé par la voie des MAPK et la voie NF-B, leur permettant de présenter l’haptène aux LT afin d’initier ainsi une réponse immunitaire spécifique.Nous avons identifié au sein de la DC une nouvelle kinase, la protéine kinase CK2, indispensable à l’acquisition d’un phénotype mature et à la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires clés dans l’orientation d’une réponse immunitaire. L’activité de la CK2 dans la DC est nécessaire à la génération d’une réponse Th1 en contrôlant la sécrétion d’IFN par les LT, et maintient une réponse Th17 préexistante. De plus, la CK2 permet à la DC de contrôler l’induction d’une réponse Th2 spontanée. Par ailleurs, la CK2 contrôle l’expression des gènes cibles de Nrf2, un facteur de transcription majeur dans la lutte contre le stress chimique induit par les haptènes. L’activation de Nrf2 met en jeu de nombreuses voies de signalisation, et nous avons mis en évidence c-Jun, facteur de transcription activé par les molécules allergisantes, comme un potentiel partenaire transcriptionnel de Nrf2. / Allergic contact dermatitis represents a severe health problem with increasing worldwide prevalence. It is a T cell-mediated inflammatory skin disease caused by chemicals present in daily or professional environment. Contact sensitizers are low molecular weight compounds termed haptens. These molecules are known to induce an up-regulation of phenotypic markers and cytokine secretion in dendritic cells (DCs), professional antigen-presenting cells, leading to the generation of effector T lymphocytes (LT).We identified a new kinase, termed CK2 (formerly casein kinase 2), as a key kinase in DCs in the acquisition of a mature phenotype and in the production of pro-inflammatory cytokines, involved in T cell polarization in response to contact sensitizers. CK2 activity in DC is necessary to induce a Th1 polarization by controlling the secretion of IFN- by LT, and maintains a pre-existing Th17 response. Moreover, CK2 in DC negatively controls a spontaneous Th2 response.Finally, CK2 controls the expression of Nrf2 target genes mRNA. Nrf2 is a protective transcription factor playing a major role in detoxification, oxidative stress and allergic inflammation generated by contact sensitizers. Nrf2 activation involves different kinases and we highlight that c-Jun could be bound to Nrf2 to generate an active transcriptional complex in response to chemicals.

蛋白激酶 CK2 是一種具有多種功能的絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶，CK2 作用的受質眾多且廣泛表現在哺乳類動物細胞中，對於細胞週期的發展、轉錄作用以及抗細胞凋亡等機制扮演非常重要的角色。在神經系統中，CK2 已知可以保護神經細胞以抵抗外來的傷害，但是其分子層面的機制目前尚未釐清。本篇論文的研究重點在於探討 CK2 保護作用可能參與的細胞分子機制。血清反應因子 SRF 是一種哺乳類動物細胞的轉錄因子，調控基因的轉錄作用來促進細胞的存活。Mcl-1 是抗細胞凋亡家族 Bcl-xL 家族蛋白成員之一，可以促進細胞的存活能力。先前研究指出，SRF 會受到 CK2 的磷酸化作用而增加本身的 DNA 結合能力。在其他研究也指出，Mcl-1 會受到 SRF 的調控。在本篇論文的第一部份，著重於 Mcl-1 的表現是否會受到 CK2 調控 SRF 的路徑所影響，實驗結果顯示，轉染野生型 CK2α 質體 DNA 可以增加海馬迴 CA1 腦區的 SRF 磷酸化，而轉染不活化的突變型 CK2αΑ156 質體 DNA 則會減少 SRF 的磷酸化。更進一步，轉染野生型 CK2α 會增加 Mcl-1 的 mRNA 及蛋白質表現，轉染突變型 CK2αΑ156 則減少 Mcl-1 的表現。此外，轉染突變型 SRF99A 也會減少 Mcl-1 的 mRNA 及蛋白質表現；而且在共同轉染實驗中，SRF99A 會拮抗野生型 CK2α 對促進的 Mcl-1 蛋白質表現的作用。 另一方面，DARPP-32 是一個在新紋狀體神經細胞中具有調控多巴胺訊息效力的訊息傳遞分子。先前研究指出，DARPP-32 具有抗細胞凋亡的功能，且發現在 DARPP-32 Ser102 氨基酸會受 CK2 的磷酸化作用。因此，本篇論文的第二部份主要是探討 CK2 的抗細胞凋亡能力是否是透過磷酸化 DARPP-32 來調控。實驗結果顯示，轉染野生型 CK2α 可以增加紋狀體 DARPP-32 的磷酸化，而轉染不活化的突變型 CK2αΑ156 則會減少 DARPP-32 的磷酸化。此外，轉染 CK2α 的小干擾 RNA (siRNA) 可以抑制內生性的 CK2 表現，同時也會減少 DARPP-32 的磷酸化以及抗細胞凋亡蛋白, Bcl-xL 的表現。綜合這些實驗結果，CK2α可以分別透過 SRF 或 DARPP-32 調控的訊息傳遞來促進 Mcl-1 或 Bcl-xL 的表現進而調控神經系統的抗細胞凋亡機制。 / Protein kinase CK2 is a multifunctional serine/threonine protein kinase with many protein substrares and is ubiquitously expressed in mammalian cells to play an important role in cell cycle progression, transcription, and anti-apoptosis. In the nervous system, CK2 is shown to protect neurons against injury, but the cellular mechanisms are not well studies. In the present studies, we investigate which cellular mechanism might involve in the CK2 protection effects. The serum response factor (SRF) is a mammalian transcription factor which mediates some gene transcriptions relevent to promote the cell survival. The Myeloid cell leukemin 1 (Mcl-1) is one of the anti-apoptotic Bcl-2 family members and is involved in promoting cell viability. Previous studied have revealed that the SRF phosphorylation by CK2 can enhance its DNA-binding activity. The regulation of Mcl-1 by SRF has also been reported in other studies. In the first part of the present studies, we investigate whether the Mcl-1 expression is regulated by CK2 through SRF mediated pathway. The results from wildtype CK2α plasmid DNA transfection revealed that the phosphorylated SRF were increased in hippocampus CA1 region, whereas transfection of the catalytically inactive CK2αA156 mutant plasmid DNA decreased phosphorylated SRF. Further, wildtype CK2α increased, whereas CK2αA156 mutant decreased the mRNA and protein levels of Mcl-1. Moreover, transfection of the mutant SRF99A also decreased the mRNA and protein levels of Mcl-1. Furthermore, the mutant SRF99A antagonized the upregulatory effects of wildtype CK2α on Mcl-1 protein level in the co-transfection experiments. In the other side, DARPP-32 (dopamine- and cAMP-regulated phosphoprotein of Mr 32 kDa) is a signal transduction molecule that regulates the efficacy of dopamine signaling in neostriatal neurons. Previous studies have revealed that DARPP-32 might involve in the anti-apoptosis and its Ser102 residue is phosphorylated by CK2. Therefore, in the second part of this study, we investigate whether one of the anti-apoptotic effects of CK2 is through DARPP-32 phosphorylation by CK2 in the present study. The results revealed that the phosphorylated DARPP-32 is increased in stratum by wildtype CK2α transfection and decreased by catalytically inactive CK2αA156 mutant transfection. Further, transfection of CK2α siRNA can inhibit endogenous CK2 expression and also decrease phosphorylation of DARPP-32 as well as the anti-apoptotic protein, Bcl-xL. These results together suggest that CK2α-mediated anti-apoptotic effects are partially through SRF mediated or DARPP-32 mediated signaling to regulate Mcl-1 or Bcl-xL expression, respectively.

漢厚朴酚是從木蘭科植物中萃取之天然化合物，已知具有抗氧化、抗發炎及神經保護之生理活性功能。先前的研究證明漢厚朴酚可以保護多巴胺神經元對抗6-OHDA所引起的細胞傷害，並且可以減緩6-OHDA 動物模式由apomorphine所誘發的旋轉行為，但漢厚朴酚對於神經保護之分子機制的相關研究尚未釐清。蛋白激酶CK2是具有多功能的絲氨酸/蘇氨酸激酶，高度表現在大腦紋狀體中，先前的研究證實蛋白激酶CK2參與調節神經系統功能和具有神經保護之作用。先前研究也指出轉錄因子Nrf1（Nuclear factor E2-related factor 1）是蛋白激酶CK2下游磷酸化受質，會調控小鼠胚胎纖維細胞中蛋白酶體基因的表現。抗細胞凋亡蛋白Mcl-1 (myeloid cell leukemia 1) 屬於Bcl-2蛋白家族的成員之一，在細胞凋亡的過程中，其蛋白含量減少與細胞凋亡有密切關聯性，抑制Mcl-1蛋白的降解可以延遲細胞死亡。因此本論文主要探討漢厚朴酚的神經細胞保護機制是否透過CK2-Nrf1細胞訊息路徑調控蛋白酶體活性，進而減少Mcl-1的降解速率。實驗結果顯示，轉染CK2α-EGFP DNA質體會增加Nrf1磷酸化並抑制蛋白酶體活性，泛素化之Mcl-1蛋白含量亦伴隨增加；轉染CK2α siRNA則會降低Nrf1磷酸化並促進蛋白酶體活性，導致naive Mcl-1蛋白質含量減少24小時的漢厚朴酚後處理（post-treatment）可以部份恢復因轉染CK2α siRNA所造成之CK2蛋白、Phosphoserine蛋白和Mcl-1蛋白質含量減少，在設計縮短間隔5小時漢厚朴酚後處理（post-treatment）的實驗結果雖然仍無法有效恢復CK2蛋白含量，但對於Phosphoserine和Mcl-1蛋白含量以及蛋白酶體活性則具有部份恢復的功效。利用過氧化氫造成細胞氧化壓力環境下，實驗發現間隔3小時的漢厚朴酚後處理才能有效恢復細胞存活率，間隔5小時的漢厚朴酚後處理則無法恢復細胞存活率。在大白鼠紋狀體腦區給予漢厚朴酚微量注射則對pTH、TH和GAD蛋白質含量皆有促進增加的作用，乙醯化的Histone H3蛋白含量也有顯著增加。綜合以上結果，推測漢厚朴酚對細胞保護作用的其中一個機制是參與調控CK2-Nrf1路徑而抑制蛋白酶體活性，減少Mcl-1蛋白質降解速率和提升氧化壓力下之細胞存活能力；此外，從活體動物的實驗結果顯示漢厚朴酚亦可能參與調控多巴胺和γ-氨基丁酸神經細胞功能的機制之中。 / Honokiol is a natural compound, extracted from the Magnolia officinalis, and is known as its anti-oxidative, anti-inflammatory and neuroprotective effects. The previous study has been demonstrated that the honokiol can protect striatal dopamine neuron against 6-OHDA induced damage and reverse the apomorphine-induced rotational behavior in Parkinson’s disease model of rats. However, the cellular mechanisms for its neuroprotective effects are not fully investigated. Protein kinase Casine kinase 2 (CK2) is a serine/threonine kinase has a highly abundant expression in the striatum compared with other brain areas. Further, CK2 is shown to regulate many neuronal functions including neuroprotection. The nuclear factor E2-related factor 1 (Nrf1) has been identified as one of the substrate proteins for CK2 and is indicated to involve in the induction of proteasome subunits gene expressions in mouse embryonic fibroblasts. The anti-apoptotic protein myeloid cell leukemia 1 (Mcl-1) is shown to play a critical initiation role during the apoptosis process due to its synthesis blockage and proteasome degradation. The present study is aimed to investigate whether one of protective effects of honokiol is through CK2-mediated Nrf1 signaling pathway to regulate the proteasome activity in the mouse N2a neuroblastoma cell line. In the current results, transfection of the CK2α-EGFP plasmid DNA increased Nrf1 phosphorylation accompanied with the decrease in the proteasome activity but increased the ubiquitinated Mcl-1 protein. Whereas, transfection of CK2α siRNA decreased Nrf1 phosphorylation leading to the increase in proteasome activity and Mcl-1 protein degradation. The 24 hr duration of honokiol post-treatment only slightly reversed the knock-down effect of CK2α siRNA on CK2α and Mcl-1 protein levels. However, 5 hr duration of honokiol post-treatment could partially reverse the Mcl-1 protein level and proteasome activity but no effect on CK2α protein levels. In the H2O2-induced oxidative stress condition, only 3 hr duration of honokiol post-treatment could protect cells against H2O2-induced cell death. In the experiments of in vivo rat animal model, local administration of honokiol was found to increase phospho-TH, naive TH, GAD as well as acetylated Histone H3 protein levels. These above results suggest one of the protective mechanisms of honokiol might be through CK2-mediated Nrf1 signaling to inhibit the proteasome activity. and to promote cell survival under oxidative stress. Beside these functions, honokiol might also involve in the regulation of nurophysiological functions of dopamine and GABA neurons.

L’adaptation des cellules à leur environnement externe repose sur la transduction adéquate de signaux régulés par une pléthore d'événements moléculaires. Parmi ces événements moléculaires, les modifications post-traductionnelles (MPT) de protéines aident à intégrer, à traduire et à organiser de façon spatiotemporelle ces signaux pour que les cellules puissent réagir aux stimuli externes. Parmi les modifications post-traductionnelles, les petites protéines de la famille de l’Ubiquitine (Ublps, Ubiquitin-like proteins) jouent un rôle majeur dans presque toutes les voies de signalisation. Cette thèse rapporte des études fonctionnelles et structurales des interactions covalentes et non covalentes entre SUMO (Small Ubiquitin related MOdifier), un membre de la famille des Ublps, et trois protéines d'échafaudage, TIF1beta, le corépresseur universel des protéines KRAB-multidoigt de zinc, PIAS1, une ligase E3 pour SUMO et PML, un suppresseur de tumeur. La première étude rapporte l'identification et la caractérisation biochimique des sites de SUMOylation de TIF1beta. Nous avons déterminé que la modification covalente de six résidus lysine par SUMO est essentielle à l’activité de répression de la transcription induit par TIF1beta. En outre, nous présentons des évidences indiquant que la SUMOylation de TIF1 exige non seulement sa capacité à homo-oligomériser, mais est aussi positivement régulée par son interaction avec le domaine KRAB des protéines à doigts de zinc. Partant de ce constat, nous postulons que les protéines KRAB-multidoigt de zinc recrutent leur corépresseur TIF1betaà des gènes cibles, mais aussi accentuent son activité répressive grâce à l'augmentation de sa SUMOylation. Notre seconde étude révèle qu’en plus de réprimer la transcription en tant que MPT covalente, SUMO joue aussi un rôle important dans la répression en tant que partenaire non covalent d’interactions protéine-protéine. Nous avons montré que SUMO interagit simultanément avec deux enzymes de la machinerie de SUMOylation, l’unique enzyme de conjugaison E2, UBC9, et la ligase E3 PIAS1 au sein d’un complexe ternaire répresseur. En outre, nous révélons que la formation du complexe ternaire PIAS1:SUMO:UBC9 est modulée par le niveau de phosphorylation de résidus sérine juxtaposés à un motif d’interaction avec SUMO (SIM) dans PIAS1. Ainsi, SUMO agit comme un adaptateur spécifique qui stabilise les interactions UBC9 E2: E3 PIAS1. Partant de ce constat, nous proposons que les enzymes E2 et E3 des autres systèmes Ublps exploitent des mécanismes similaires dans le cadre de leur fonction Enfin, notre troisième étude explore la régulation des interactions non covalentes de SUMO par la phosphorylation. En utilisant une combinaison d'études in vivo et in vitro, nous démontrons que l'interaction entre SUMO1 et PML est régi par la phosphorylation dépendant de CK2 sur quatre résidus sérine de PML. Les structures cristallographiques des complexes PML-SIM:SUMO1 révèlent que les phospho-sérines de PML contactent des résidus de la région basique de SUMO1. Sachant que la kinase CK2 peut être induite par des kinases activables par le stress, ces résultats suggèrent que les interactions non-covalentes avec SUMO sont modulées par le stress cellulaire. Sur la base de cette constatation, nous postulons que des événements analogues affectent des protéines contenant des séquences SIM ciblées par CK2. En résumé, cette étude révèle qu’en plus de son rôle de MPT, SUMO peut fonctionner comme un adaptateur permettant des interactions spécifiques entre protéines tel que pour les enzymes E3 et E2. / Cell adaption to the external environment relies on proper signal transduction that is orchestrated by a plethora of molecular events. Among these molecular events, post-translational modifications (PTMs) of proteins help to spatiotemporally integrate, translate and dispatch signals so cells can respond to external stimuli. Among these post-translational modifications, the Ubiquitin-like proteins (Ublps) play a major role in almost all signaling pathways. This thesis reports functional and structural studies of the covalent and non-covalent interactions between the Small Ubiquitin-related MOdifier (SUMO), a member of the Ublps family, and three scaffold proteins, TIF1beta, the corepressor of KRAB-Multifinger proteins, PIAS1, a SUMO E3 ligase and the Promyleocytic leukemia (PML) tumor suppressor protein. The first study reports the identification and the biochemical characterization of TIF1betaSUMOylation sites. We mapped six SUMOylation sites in TIF1beta and determined that the covalent modification of these sites by SUMO is essential for its transcriptional repression activity. In addition, we present evidence indicating that SUMOylation of TIF1beta requires not only its ability to homo-oligomerize, but is positively regulated through its interaction with KRAB domains found in zinc-finger proteins. Based on this finding, we postulate that these KRAB domain containing multifinger proteins not only recruit TIF1beta co-repressor to target genes but also increase its repressive activity through enhancement of its SUMOylation. The work in the second study reveals that in addition to suppressing transcription as a covalent PTM, SUMO plays an important role in repression as a non-covalent protein-protein interaction partner. We determine that SUMO can form a repressive complex by simultaneously forming non-covalent interactions with UBC9 and PIAS1, the E2 and E3 enzymes in the SUMOylation system. In addition, we report that the formation of the PIAS1:SUMO:UBC9 ternary complex is modulated by the phosphorylation of serine residues juxtaposed to a SUMO-Interacting Motif (SIM) found in PIAS1. Thus SUMO acts as a specific adaptor that stabilizes UBC9 E2: PIAS1 E3 interactions. Based on this finding, we propose that the E2 and E3 enzymes from other Ublps systems exploit similar mechanisms as part of their function Finally, our third study explores the regulation of SUMO non-covalent interactions by phosphorylation. Using a combination of in vivo and in vitro studies we demonstrate that the interaction between SUMO1 and PML is governed by CK2-dependent phosphorylation of four serine residues in PML. Crystal structures of PML-SIM:SUMO1 complexes reveal that these PML phospho-serine specifically contact SUMO1 basic patch residues. Since CK2 kinase is induced by stress activated kinases pathways, this indicates that SUMO non-covalent interactions are regulated by cellular stress. Based on this finding, we postulated that analogous events influence other CK2-targeted SIM-containing proteins. In summary, this study reveals that in addition to its well described function as PTM, SUMO can function as an adaptor enabling specific proteins interactions such as functional E3:E2 enzymes pairs.

Phosducin-like Protein existiert in zwei Splicevarianten: PhLPLONG (PhLPL) und PhLPSHORT (PhLPS). Sie unterscheiden sich in der Länge ihres N-Terminus und in ihrem Expressionsmusters: Die lange Form (PhLPL) wird ubiquitär exprimiert und bindet G-Protein-betagamma-Untereinheiten (Gbetagama), was zur Hemmung von Gbetagamma-abhängigen Funktionen führt. Der um 83 Aminosäuren verlängerte N-Terminus besitzt ein hoch konserviertes Motiv, welches für die Gbetagamma-Bindung und Regulation von entscheidender Bedeutung ist. Im Gegensatz hierzu besitzt die kurzen Spliceform PhLPS, deren Expression in verschiedenen Gewebetypen deutlich geringer ist, diese hoch konservierte Region nicht. In der vorliegenden Arbeit wurde nun erstmals die Rolle von PhLPL und PhLPS bei der Gbetagamma-Regulation in intakten Zellen untersucht. Hierbei konnte überraschenderweise gefunden werden, dass PhLPS der potentere und effizientere Regulator für Gbetagamma-abhängige Signale war. PhLPL hingegen schien in seiner Gbetagamma-regulierenden Fähigkeit limitiert zu werden. Die Ursache dieser Limitierung von PhLPL in intakten Zellen wurde auf eine konstitutive Phosphorylierung seines verlängerten N-Terminus durch die ubiquitäre Casein Kinase 2 (CK2) zurückgeführt. Die verantwortlichen Phosphorylierungsstellen (S18, T19, S20) wurde identifiziert und die Mutation der CK2-Phosphorylierungsstellen (PhLPLA18-20) führte zu einer Verbesserung der hemmenden Funktion von PhLPL in Zellen. In vitro-Assays zur Bindungsfähigkeit von rekombinantem PhLPL (vor und nach CK2-Phosphorylierung) zeigten allerdings: die Phosphorylierung beeinflusste die Affinität nicht. Eine genaue Analyse der N-terminalen Strukuren von PhLPL zeigte indes, dass die Regulationsfähigkeit von PhLPL in intakten Zellen vor allem in dem konservierten Gbetagamma-Bindungsmotiv zu suchen war. Die Mutation einer einzigen Aminosäure (W66V) war ausreichend, um sowohl die Gbetagamma-Bindungsfähigkeit, als auch die Fähigkeit zur funktionellen Hemmung in intakten Zellen zu verlieren. Was war also der Mechanismus der Hemmung von Gbetagamma durch PhLPS und die phophorylierungsdefiziente Mutante von PhLPL? Ein erster Hinweis hierauf kam von der Beobachtung, dass die Gbeta- und Ggamma-Untereinheiten in Anwesenheit von PhLPS in ihrem Proteingehalt deutlich reduziert vorlagen (wie in Western Blots gezeigt). Dieser Mechanismus schien von proteasomalen Abbauwegen abzuhängen (gezeigt durch Effekte des spezifischen Proteasominhibitors Lactazystin). Allerdings schien eine Stabilisierung der Gbeta- und Ggamma-Untereinheiten (durch N-terminale Fusion mit einem Protein zur vitalen Proteinfärbung) nicht die Funktionsfähigkeit von Gbetagamma in Anwesenheit von PhLPS bewahren zu können. Ganz im Gegenteil, es wurde gezeigt, dass Gbeta und Ggamma hierbei nicht mehr zu einem funktionellen Dimer assoziierten. Dies war ein Hinweis darauf, dass möglicherweise Proteinfaltungsmechanismen bei der Regulation essentiell sein könnten. Eine postulierte Rolle bei der Faltung von WD40-Repeatproteinen wie der Gbeta-Untereinheit wurde dem Chaperonin-Komplex CCT (chaperonin containing TCP) zugedacht. Folgerichtig konnte PhLPS mit seinen funktionell aktiven Domänen an endogenes TCP-1alpha (einer Untereinheit von CCT) binden. Ferner konnte gezeigt werden, dass die Hemmung des CCT-Komplexes durch RNA-Interferenz mit TCP-1alpha ebenso wie PhLPS zur spezifischen Reduktion von Gbetagamma führte. In dieser Arbeit wurde also ein neuartiger Mechanismus der G-Protein-Regulation durch Hemmung der Proteinfaltung von Gbetagamma beschrieben. Ein Schaltmechanismus zwischen direkter Gbetagamma-Bindung (induziert durch CK2-Phosphorylierung von PhLPL) und Hemmung der Proteinfaltung von Gbetagamma (induziert durch alternatives Splicen oder durch Dephosphorylierung von PhLP) wird postuliert. / Phosducin-like protein (PhLP) exists in two splice variants PhLPLONG (PhLPL) and PhLPSHORT (PhLPS): They differ in the length of their N-termini and their expression pattern: The long form (PhLPL) is a ubiquitously expressed protein and binds G-protein betagamma-subunits (Gbetagamma) and thereby inhibits Gbetagamma-mediated function. The extended N-terminus of PhLPL (83 amino acids) contains a highly conserved Gbetagamma-binding motif which plays the crucial role in binding and regulating Gbetagamma-subunits. In contrast, the short splice variant PhLPS, which has a more restricted expression, lacks this motif and did not seem to exert a major Gbetagamma-inhibition, when tested with purified proteins. In the present work, for the first time, we investigated the Gbetagamma-inhibiting properties of PhLPL and PhLPS in intact cells. Surprisingly, PhLPS was the more potent and effective Gbetagamma inhibitor, while PhLPL was limited in this respect. The reason for the limited ability to inhibit Gbetagamma in intact cells was found in a constitutive phosphorylation by the ubiquitious kinase casein kinase 2 (CK2). The responsible phosphorylation sites could be identified (S18, T19, S20) and mutation of those sites into alanines could ameliorate the function of PhLPL. We therefore hypothesised that CK2 dependent phosphorylation of PhLPL should reduce binding affinity towards Gbetagamma subunits. But instead, direct phosphorylation of recombinant PhLPL by CK2 did not reduce its binding affinites. A thorough analysis of the N terminus of PhLPL revealed that a single mutation of the conserved N terminal binding motif (W66V) was sufficient to ablate Gbetagamma binding and Gbetagamma inhibition in intact cells. A first hint to an alternative mechanism came from the observation that - in the presence of PhLPS - the protein content of Gbeta and Ggamma subunits was dramatically reduced (as determined by Western blotting). This phenomenon seemed to be dependent on a proteasomal pathway (which was shown by effects of the specific proteasome inhibitor lactacystine). But a stabilization of the Gbeta and Ggamma subunits through N terminal fusion of a dye-labeling protein could not restore the function of Gbetagamma in the presence of PhLPS. Instead, it could be demonstrated that under these conditions Gbeta and Ggamma did not form functional dimers any more. This finding led to the conclusion that a protein folding mechanism was possibly involved. A postulated role in the folding of WD40 repeat proteins (like the Gbeta subunit) was assumed for the cytosolic chaperonin complex CCT in the literature. PhLPS was able to bind to TCP-1alpha, a subunit of CCT, as were the functionally active domains of PhLPS. We further demonstrated that the inhibition of CCT by RNA interference with TCP-1alpha also led to down-regulation of Gbeta and Ggamma subunits. So, in this thesis, a novel mechanism of G-protein regulation through inhibition of Gbetagamma protein folding was described. Further, a switch mechanism between direct Gbetagamm binding (induced by phosphorylation of PhLPL) and inhibition of Gbetagamm folding (induced by alternative splicing or dephosphorylation of PhLP) is postulated.

Dans le but de réaliser la synthèse de nouveaux N-hydroxyimides polyaromatiques, nous avons développé de nouvelles méthodologies d'accès aux 1,3-diarylisobenzofuranes. Ces derniers sont obtenus par l'addition chimiosélective d'un nucléophile (aryl magnésien ou acide aryl boronique) sur la fonction aldéhyde d'un o-aroylbenzaldéhyde. Celui-ci est obtenu via une réaction de Kotali polyvalente. Les réactions mises au point ont permis l'accès à une large gamme de 1,3-diarylisobenzofuranes diversement fonctionnalisés. L'aspect innovant du travail réside dans la compatibilité fonctionnelle élevée de la voie d'accès aux 1,3-diarylisobenzofuranes. Par cette méthode, nous avons obtenu 17 nouveaux N-hydroxyimides qui ont été engagés avec succès dans des réactions de diversification sans protection de la fonction hydroxyimide. Les propriétés biologiques mais aussi catalytiques des analogues obtenus ont été évaluées. Les tests réalisés nous ont permis de confirmer l'activité de cette nouvelle famille d'inhibiteur de la protéine kinase CK2. Nos composés ont également montré des propriétés catalytiques intéressantes avec des activités supérieures à celle du NHPI et, dans un cas particulier, proches de celle du NHTTPI.

Phosducin-like protein (PhLP) binds G-protein beta gamma subunits and is thought to assist in assembly of the G-protein beta gamma dimer. Phosphorylation of PhLP at serine residues 18-20 by the casein kinase 2 (CK2) appears to play an essential role in this process. PhLP has also been shown to interact with the chaperonin containing TCP-1 (CCT) atop its apical domain, not entering the substrate folding cavity. However, the physiological role of the PhLP-CCT interaction in G-protein beta gamma dimer formation remains unclear. This study addresses the mechanism of G-protein beta gamma assembly by exploring the specific roles of CCT and CK2 phosphorylation of PhLP in the assembly process. Both overexpressed and endogenous Gbeta were shown to co-immunoprecipitate with CCT to a similar extent as PhLP, indicating that CCT may be involved in the folding of Gbeta. In addition, Ggamma overexpression enhanced the binding of PhLP to CCT, suggesting the formation of a ternary PhLP-Gbeta-CCT complex. In contrast, overexpression of PhLP caused the release of G-beta from CCT. This release was blocked by a PhLP S18-20A variant that lacks the S18-20 CK2 phosphorylation site. PhLP S18-20A has been previously shown to negatively affect the G-protein beta gamma dimer formation, suggesting a correlation between PhLP-mediated release of Gbeta from CCT and G protein beta gamma assembly. Experiments investigating the role of Ggamma in this process show that Ggamma does not interact with CCT nor is it the essential factor in the release of Gbeta from CCT. A new model is therefore proposed for the G-protein beta gamma subunits' assembly involving the formation of a PhLP-Gbeta-CCT ternary complex followed by the release of a phosphorylated PhLP-Gbeta complex from CCT. In the PhLP-Gbeta complex, the Ggamma binding face of Gbeta is exposed, allowing for the formation of the G-protein beta gamma dimer.