<p> A revision of the Neotropical darkling beetle genus <i>Phrenapates</i> Gray 1832 (Tenebrionidae: Phrenapatinae) was conducted. Using over 300 specimens of Phrenapates, the genus is redescribed with its taxonomic history and classification summarized. Lectotypes are designated for <i>Phrenapates bennettii</i> Gray 1832, <i>P. ohausi</i> Gebien 1910, <i>P. dux</i> Gebien 1910, and <i>P. educator</i> Gebien 1910 to stabilize species concepts. Two new species are described: <i>Phrenapates gilloglyi</i> Rincon & Smith <b>sp. nov.</b> and <i>Phrenapates fortunaensis</i> Rincon & Smith <b>sp. nov.</b> A total of eight species are now recognized (<i>P. bennettii</i>, <i>P. ohausi</i>, <i>P. dux</i>, <i>P. mandibularis</i>, <i>P. educator</i>, <i>P. latreillei</i>, <i>P. gilloglyi</i>, and <i>P. fortunaensis</i>). Distribution maps and a key to <i>Phrenapates</i> species are provided.</p> In order to assess the status and relationships of the tribes in the subfamily Phrenapatinae, a molecular dataset was constructed for phlogenetic analyses. Nine gene regions were used: nuclear wingless (wg), mitochondrial cytochrome b (cytb), mitochondrial cytochrome oxidase I (COI), nuclear Arginine Kinase (ArgK), ribosomal RNA (12S, 16S, & 18S), nuclear ribosomal 28S, and carbamoyl-phosphate synthetase domain of rudimentary (CAD). Taxa were selected based on the availability of nucleotide sequences from the GenBank and BOLD databases, as well as previously unpublished sequences provided by the Smith lab. Phylogenetic analyses revealed that: (1) the subfamily Phrenapatinae is likely monophyletic; (2) <i>Archaeoglenes</i> is sister to the other phrenapatines in all analyses which, alongside morphological evidence, supports the concept of the tribe Archaeoglenini; (3) the relationship between Phrenapatini and Penetini varied between analyses, though morphological characters used to separate the two tribes appear stable; (4) Penetini, the most species rich tribe within the subfamily, may not be monophyletic.

Habitat loss and fragmentation due to agricultural practices are causing worrying declines in insect diversity and biomass. Agricultural intensification, among other things, have led to a decline in semi-natural grasslands. Forest in the surrounding landscape can have a positive effect on species abundance in grasslands. Clear-cut forest have been identified as a supporting habitat for grassland species as they contain important resources. Clear-cuts can also support a wide variety of insects, both grassland species and forest species. In this study, I examined how different land covers in the surrounding landscape affected species abundance on clear-cuts in southeastern Sweden. Using data of insects collected in three previous studies, I tested the hypothesis that insects on clear-cuts benefit from other clear-cuts in the surrounding landscape. I also tested at which spatial scales the surrounding landscape mainly exerted its influence. The results were not in line with the hypothesis and showed that forest in the surrounding landscape had a positive effect on species abundance on clear-cuts, whereas clear-cuts had a negative effect. There were no clear patterns over different scales, although the smallest scale of a 250 m radius produced the highest number of significant results. A lot of insects recorded on the clear-cuts were generalists associated with both forest and agricultural landscape. The reason for the negative effect of clear-cuts needs further investigation.

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Los coleópteros saproxílicos son aquellos que, al menos en una parte de su ciclo vital, dependen directamente o indirectamente de la madera muerta o moribunda y de otros organismos saproxílicos, como hongos habitantes de la madera. La madera muerta o moribunda posee una gran diversidad de formas y orígenes (árboles muertos, caídos o en pie, árboles moribundos, ramas muertas, caídas o no, oquedades o heridas en árboles sanos o no, o restos de troncos como tocones y cortezas), por lo que los organismos saproxílicos, son de gran importancia en los ecosistemas, sobre todo en los forestales. Sin embargo, y a pesar de ello están gravemente amenazados por cambios en sus hábitats y microhábitats, principalmente causados por el ser humano. Aunque tradicionalmente la biodiversidad de los ecosistemas ha sido medida a través de la identidad y abundancia de especies, en las últimas décadas se ha desarrollado otro modo medir la biodiversidad basándose en los rasgos funcionales de las especies, que ha sido conocido como diversidad funcional. El objetivo general de esta tesis es profundizar en el conocimiento de las comunidades de escarabajos saproxílicos en áreas protegidas y bien conservadas de la Península Ibérica a través del estudio de su diversidad taxonómica y funcional, con el fin de comprender qué variables y mecanismos pueden estar detrás de su biodiversidad. Con el fin de lograr este objetivo se realizó un muestreo sistemático de las comunidades de escarabajos saproxílicos en tres áreas protegidas de España (parque nacional de Cabañeros, parque natural de Font Roja y parque natural de Sierra Espadán) usando para ello tres tipos de trampas (trampas de intersección en vuelo o trampas de ventana, trampas de emergencia en oquedades, y trampas de emergencia en troncos en suelo). La incorporación funcional al estudio de estas comunidades ha permitido aseverar que el número de especies o la abundancia de estas no provee suficiente información sobre dichas comunidades, por lo que ambos aspectos de la biodiversidad deberían tenerse en cuenta a la hora de proponer estrategias de conservación, tanto a nivel temporal como espacial. Asimismo, la presente tesis ha demostrado que aunque dependen de variables distintas, tanto la diversidad taxonómica como la diversidad funcional de escarabajos saproxílicos son altamente dependientes del área de muestreo, por lo que en cada área protegida se deberían poner en marcha medidas de conservación y manejo adaptadas a sus características.

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Os estudos da função intestinal foram particularmente estimulados após a conscientização de que o tubo digestivo é uma enorme interface relativamente pouco protegida entre o inseto e o meio ambiente e pode ser usado como alvo para controle de pragas. Neste contexto, nosso trabalho envolve a purificação e caracterização de uma &#945;-manosidase solúvel e a detecção de uma &#945;-manosidase de membrana. As &#945;-manosidases pertencem a uma família de exoglicosidases as quais hidrolisam resíduos de &#945;-D-manosil a partir de terminais não redutores de oligossacarídeos. Estas enzimas são implicadas no catabolismo de carboidratos e na via de N-glicosilação protéica em insetos, mas pouco se sabe sobre a bioquímica destas glicosidases. O Tenebrio molitor é um Coleoptera bastante estudado pelo nosso laboratório devido a sua relevância como praga agrícola e o seu posicionamento em um ponto estratégico da árvore filogenética de insetos. O estudo de distribuição desta enzima mostrou que a &#945;-manosidase encontra-se, principalmente, como uma enzima solúvel no conteúdo anterior e médio do intestino médio, mas também existe uma atividade significante na fração de membrana. Para confirmar a existência desta enzima de membrana, microvilosidades foram purificadas por precipitação diferencial com cálcio. A enzima aminopeptidase foi utilizada como marcadora, uma vez que sabe-se que esta enzima é uma típica de membrana microvilar. Como a &#945;-manosidase solúvel é majoritária demos início a sua purificação e posterior caracterização. A sua purificação foi realizada utilizando uma combinação de quatro passos de cromatografia: Uma de troca iônica em Hitrap Q XL (Amersham/Bioscience), duas filtrações em gel, uma em Superdex 75 e outra em Superdex 200 (Amersham/Bioscience) usando o sistema AKTA, e o último passo é uma hidrofóbica em Phenyl Superose. Nós observamos a presença de dois picos de atividade nomeados de Man 1 e Man 2, sugerindo a existência de duas &#945;- manosidases solúveis, que se diferem quanto a hidrofobicidade. O pH ótimo das &#945;-manosidases é de 5,6 e sua massa molecular, determinada por cromatografia de 8 filtração em gel, é de 123 kDa, e no SDS-PAGE observamos uma única banda de 70 KDa, indicando a existência de duas subunidades. Em um gel nativo revelado com o substrato fluorescente (metilumbelliferil-&#945;-D-manopiranosídeo) nota-se somente uma banda de atividade. A Man 2 possui pI de 3,38. &#945;-manosidases de T. molitor seguem a cinética de Michaelis-Menten com Km para o substrato p-nitrofenil-&#945;-D-manopiranosídeo de 0,84 mM para Man 1 e 0,62 mM para Man 2. Também foram feitos ensaios de inibição com dois inibidores que sabidamente inibem carboidrases, um é o deoximanojirimicina e o outro é a swainsonina. O Ki encontrado para o primeiro inibidor foi de 0,12 mM para Man 1 e 0,15 mM para Man 2 e o Ki para o segundo inibidor foi de 67,8 nM para Man 1 e 63 nM para Man 2, sendo ambos inibidores competitivos. O fato destas enzimas serem inibidas apenas por Swainsonina em concentrações razoáveis, permite a sua classificação como tipo II. Isso sugere que elas são derivadas da forma lisossômica, embora apresente pH ótimo alterado. / Studies of intestinal function were prompted after noticing that the gut is a huge and relatively unprotected interface between the insect and the environment and can thus be used as a target for pest control. In this context, our work involves the purification and characterization of an soluble alpha-mannosidase and detection of a membrane &#945;-mannosidase. &#945;-Mannosidases are a family of exoglycosidases which hydrolyse &#945;-D-mannosyl residues from terminal non-reducing end of oligossacharides. These enzymes are implicated in the catabolism of carbohydrates and N-linked protein glycosylations in insects, but little is known on this biochemistry. T.molitor is a Coleoptera studied in our laboratory because of its relevance as agricultural pest and its position at a strategic point in the phylogenetic tree of insects. &#945;-Mannosidase is more active in the anterior and middle midgut content of T.molitor larvae, although there is a significant activity in the membrane fraction. To confirm the existence of this membrane enzyme, microvilli were purified by differential precipitation with calcium. Aminopeptidase was used as a marker, since it is known that it is a typical microvilar membrane enzyme. Most &#945;-mannosidase activity is soluble. This led us to purify this enzyme for further characterization. The purification of T. molitor &#945;-mannosidase was attained by using a combination of four chromatographic steps: an anion-exchange chromatography in Hitrap Q XL (Amersham/Bioscience), two gel filtration chromatographies, one in Superdex 200 and another in Superdex 75 (Amersham/Bioscience) using an AKTA system, and the last step is a Hydrophobic cromatography in Phenyl Superose. Two peaks of activity were resolved: Man 1 and Man 2, suggesting the existence of two soluble &#945;-mannosidases, differing only in hydrophobicity. The optimum pH of the &#945;- mannosidases is 5.6 and the molecular mass is 123 KDa determined by gel filtration and 70 KDa in the case of SDS PAGE. This suggests that the holoenzyme has two subunits. In a native gel revealed with the fluorescent substrate (methylumbelliferyl-&#945;-D-mannopyranoside) only one band of activity is seen. Man 2 has pI 3.38. T. molitor &#945;-mannosidases followed Michaelis-Menten kinetics with a Km value of 0.84 mM for Man 1 and 0.62 mM for Man 2 using p-nitrophenyl-&#945;-D-mannopyranoside as substrate. Inhibition tests were made with typical inhibitors of &#945;-mannosidases: one is the 1-deoxymannojirimycin and the other is the Swainsonine. The Ki for the first was of 0.12 mM for Man 1 and 0.15 mM for Man 2 and for the second was 67.8 nM for Man 1 and 63 nM for Man 2. Both were competitive inhibitors. The fact that the enzymes are inhibited only by swainsonine in reasonable concentrations, allows us to classify them as type II. This suggests that they are derived from the lysosomal form, although they have an altered optimum pH.

Devido aos problemas, ambientais e à população humana, causados pelos inseticidas químicos, novas investigações para o controle de insetos tornaram-se necessárias. Para isto, um maior conhecimento sobre a fisiologia digestiva dos insetos torna-se essencial, visto que o intestino é uma interface, grande e relativamente desprotegida, entre o inseto e o seu ambiente. Neste contexto, nosso trabalho envolve a purificação e caracterização de uma dipeptidase e de uma carboxipeptidase digestivas de T. molitor. Estas enzimas, compreendem as classes de enzimas digestivas de insetos menos estudadas. O estudo de distribuição das atividades de dipeptidase e carboxipeptidase nas diferentes regiões do intestino médio de larvas de T. molitor mostrou que essas enzimas encontram-se majoritariamente no conteúdo luminal. Para a purificação da dipeptidase e carboxipeptidase foram utilizadas cromatografias de troca iônica e filtração em gel. A carboxipeptidase purificada era muito instável para estudos mais detalhados. O estudo dos parâmetros cinéticos mostrou que a dipeptidase digestiva de T. molitor possui massa molecular de 38,6 kDa, pH ótimo 7,4, baixa solubilidade a fenantrolina e parece preferir dipeptídeos com cadeia lateral volumosa na posição P1. Devido a essas propriedades, mesmo sendo solúvel, assemelha-se a dipeptidase de membrana (EC 3.4.13.19). / Because of adverse effects caused by insecticides in environment and in animals and humans, new methods for insect control are necessary. Knowledge on insect digestive physiology may be instrumental in this direction, as the gut is the major interface between insect and its environment. Our work involves the purification and characterization of a digestive carboxypeptidase and a digestive dipeptidase from Tenebrio molitor. Those enzymes comprise the class of insect digestive enzymes less studied. Distribution studies showed that T. molitor dipeptidase and carboxypeptidase are more active in the midgut content. The purification of T. molitor dipeptidase and carboxypeptidase was attained using a combination of anion-exchange chromatographies and gel filtration. The optimum pH of dipeptidase is 7.6 and the carboxypeptidase is 7.4. The kinetic parameters showed that the T. molitor digestive dipeptidase prefers as substrates dipeptides having a large lateral chain in P1 position.

Os estudos da função intestinal foram particularmente estimulados após a conscientização de que o tubo digestivo é uma enorme interface relativamente pouco protegida entre o inseto e o meio ambiente e pode ser usado como alvo para controle de pragas. Neste contexto, nosso trabalho envolve a purificação e caracterização de uma &#945;-manosidase solúvel e a detecção de uma &#945;-manosidase de membrana. As &#945;-manosidases pertencem a uma família de exoglicosidases as quais hidrolisam resíduos de &#945;-D-manosil a partir de terminais não redutores de oligossacarídeos. Estas enzimas são implicadas no catabolismo de carboidratos e na via de N-glicosilação protéica em insetos, mas pouco se sabe sobre a bioquímica destas glicosidases. O Tenebrio molitor é um Coleoptera bastante estudado pelo nosso laboratório devido a sua relevância como praga agrícola e o seu posicionamento em um ponto estratégico da árvore filogenética de insetos. O estudo de distribuição desta enzima mostrou que a &#945;-manosidase encontra-se, principalmente, como uma enzima solúvel no conteúdo anterior e médio do intestino médio, mas também existe uma atividade significante na fração de membrana. Para confirmar a existência desta enzima de membrana, microvilosidades foram purificadas por precipitação diferencial com cálcio. A enzima aminopeptidase foi utilizada como marcadora, uma vez que sabe-se que esta enzima é uma típica de membrana microvilar. Como a &#945;-manosidase solúvel é majoritária demos início a sua purificação e posterior caracterização. A sua purificação foi realizada utilizando uma combinação de quatro passos de cromatografia: Uma de troca iônica em Hitrap Q XL (Amersham/Bioscience), duas filtrações em gel, uma em Superdex 75 e outra em Superdex 200 (Amersham/Bioscience) usando o sistema AKTA, e o último passo é uma hidrofóbica em Phenyl Superose. Nós observamos a presença de dois picos de atividade nomeados de Man 1 e Man 2, sugerindo a existência de duas &#945;- manosidases solúveis, que se diferem quanto a hidrofobicidade. O pH ótimo das &#945;-manosidases é de 5,6 e sua massa molecular, determinada por cromatografia de 8 filtração em gel, é de 123 kDa, e no SDS-PAGE observamos uma única banda de 70 KDa, indicando a existência de duas subunidades. Em um gel nativo revelado com o substrato fluorescente (metilumbelliferil-&#945;-D-manopiranosídeo) nota-se somente uma banda de atividade. A Man 2 possui pI de 3,38. &#945;-manosidases de T. molitor seguem a cinética de Michaelis-Menten com Km para o substrato p-nitrofenil-&#945;-D-manopiranosídeo de 0,84 mM para Man 1 e 0,62 mM para Man 2. Também foram feitos ensaios de inibição com dois inibidores que sabidamente inibem carboidrases, um é o deoximanojirimicina e o outro é a swainsonina. O Ki encontrado para o primeiro inibidor foi de 0,12 mM para Man 1 e 0,15 mM para Man 2 e o Ki para o segundo inibidor foi de 67,8 nM para Man 1 e 63 nM para Man 2, sendo ambos inibidores competitivos. O fato destas enzimas serem inibidas apenas por Swainsonina em concentrações razoáveis, permite a sua classificação como tipo II. Isso sugere que elas são derivadas da forma lisossômica, embora apresente pH ótimo alterado. / Studies of intestinal function were prompted after noticing that the gut is a huge and relatively unprotected interface between the insect and the environment and can thus be used as a target for pest control. In this context, our work involves the purification and characterization of an soluble alpha-mannosidase and detection of a membrane &#945;-mannosidase. &#945;-Mannosidases are a family of exoglycosidases which hydrolyse &#945;-D-mannosyl residues from terminal non-reducing end of oligossacharides. These enzymes are implicated in the catabolism of carbohydrates and N-linked protein glycosylations in insects, but little is known on this biochemistry. T.molitor is a Coleoptera studied in our laboratory because of its relevance as agricultural pest and its position at a strategic point in the phylogenetic tree of insects. &#945;-Mannosidase is more active in the anterior and middle midgut content of T.molitor larvae, although there is a significant activity in the membrane fraction. To confirm the existence of this membrane enzyme, microvilli were purified by differential precipitation with calcium. Aminopeptidase was used as a marker, since it is known that it is a typical microvilar membrane enzyme. Most &#945;-mannosidase activity is soluble. This led us to purify this enzyme for further characterization. The purification of T. molitor &#945;-mannosidase was attained by using a combination of four chromatographic steps: an anion-exchange chromatography in Hitrap Q XL (Amersham/Bioscience), two gel filtration chromatographies, one in Superdex 200 and another in Superdex 75 (Amersham/Bioscience) using an AKTA system, and the last step is a Hydrophobic cromatography in Phenyl Superose. Two peaks of activity were resolved: Man 1 and Man 2, suggesting the existence of two soluble &#945;-mannosidases, differing only in hydrophobicity. The optimum pH of the &#945;- mannosidases is 5.6 and the molecular mass is 123 KDa determined by gel filtration and 70 KDa in the case of SDS PAGE. This suggests that the holoenzyme has two subunits. In a native gel revealed with the fluorescent substrate (methylumbelliferyl-&#945;-D-mannopyranoside) only one band of activity is seen. Man 2 has pI 3.38. T. molitor &#945;-mannosidases followed Michaelis-Menten kinetics with a Km value of 0.84 mM for Man 1 and 0.62 mM for Man 2 using p-nitrophenyl-&#945;-D-mannopyranoside as substrate. Inhibition tests were made with typical inhibitors of &#945;-mannosidases: one is the 1-deoxymannojirimycin and the other is the Swainsonine. The Ki for the first was of 0.12 mM for Man 1 and 0.15 mM for Man 2 and for the second was 67.8 nM for Man 1 and 63 nM for Man 2. Both were competitive inhibitors. The fact that the enzymes are inhibited only by swainsonine in reasonable concentrations, allows us to classify them as type II. This suggests that they are derived from the lysosomal form, although they have an altered optimum pH.

Devido aos problemas, ambientais e à população humana, causados pelos inseticidas químicos, novas investigações para o controle de insetos tornaram-se necessárias. Para isto, um maior conhecimento sobre a fisiologia digestiva dos insetos torna-se essencial, visto que o intestino é uma interface, grande e relativamente desprotegida, entre o inseto e o seu ambiente. Neste contexto, nosso trabalho envolve a purificação e caracterização de uma dipeptidase e de uma carboxipeptidase digestivas de T. molitor. Estas enzimas, compreendem as classes de enzimas digestivas de insetos menos estudadas. O estudo de distribuição das atividades de dipeptidase e carboxipeptidase nas diferentes regiões do intestino médio de larvas de T. molitor mostrou que essas enzimas encontram-se majoritariamente no conteúdo luminal. Para a purificação da dipeptidase e carboxipeptidase foram utilizadas cromatografias de troca iônica e filtração em gel. A carboxipeptidase purificada era muito instável para estudos mais detalhados. O estudo dos parâmetros cinéticos mostrou que a dipeptidase digestiva de T. molitor possui massa molecular de 38,6 kDa, pH ótimo 7,4, baixa solubilidade a fenantrolina e parece preferir dipeptídeos com cadeia lateral volumosa na posição P1. Devido a essas propriedades, mesmo sendo solúvel, assemelha-se a dipeptidase de membrana (EC 3.4.13.19). / Because of adverse effects caused by insecticides in environment and in animals and humans, new methods for insect control are necessary. Knowledge on insect digestive physiology may be instrumental in this direction, as the gut is the major interface between insect and its environment. Our work involves the purification and characterization of a digestive carboxypeptidase and a digestive dipeptidase from Tenebrio molitor. Those enzymes comprise the class of insect digestive enzymes less studied. Distribution studies showed that T. molitor dipeptidase and carboxypeptidase are more active in the midgut content. The purification of T. molitor dipeptidase and carboxypeptidase was attained using a combination of anion-exchange chromatographies and gel filtration. The optimum pH of dipeptidase is 7.6 and the carboxypeptidase is 7.4. The kinetic parameters showed that the T. molitor digestive dipeptidase prefers as substrates dipeptides having a large lateral chain in P1 position.

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