Au cours du développement des végétaux, de l’établissement de l’identité cellulaire des premiers organes au guidage du tube pollinique, la communication cellule à cellule est d’une importance capitale. En réponse, les voies de signalisation moléculaires sont élaborées pour la perception d’un signal extérieur et la transduction en une réponse génique via une cascade intracellulaire. Les récepteurs kinases font partie des protéines perceptrices des stimuli et constituent chez les plantes une catégorie de protéines avec une occurrence considérable, mais dont très peu d’informations détaillées sont disponibles à ce jour. Une famille de récepteurs kinases chez Arabidopsis thaliana, AtORK11 (Arabidopsis thaliana Ovule Receptor Kinase 11), a été identifiée par orthologie à un récepteur spécifique aux ovaires chez une solanacéee sauvage, Solanum chacoense. La fonction présumée de cette famille de récepteurs kinases de type leucine-rich repeat, suggérée par son patron d’expression, implique les événements relatifs au développement des gamétophytes et à la reproduction. Afin de caractériser la fonction des quatre gènes de la famille (AtORK11a, AtORK11b, AtORK11c et AtORK11d) une stratégie d’analyse de mutants d’insertion de l’ADN-T et d’évaluation du mode d’action par complémentation bimoléculaire par fluorescence (BiFC) a été entreprise. Aucune fonction précise n’a pu être attribuée aux doubles mutants d’insertion, par contre la surexpression d’une construction dominante négative indique un rôle dans le développement gamétophytique. Il a aussi été démontré que les quatre récepteurs peuvent interagir par homodimérisation aussi bien que par hétérodimérisation. Une hypothèse de redondance fonctionnelle est ainsi mise à jour parmi la famille des gènes AtORK11. / Cell to cell communication is paramount during plant developmental processes, from cellular identity in early organogenesis to pollen tube guidance. In response to this requirement, molecular cell signalling is used to perceive an external signal and transduce the response by an intracellular signalling cascade leading to specific gene activation. The sensing protein is typically a receptor kinase, which will transduce the stimulus by phosphorylation of a cytoplasmic interaction partner. Although plant receptor kinases represent the largest protein kinase family, only handfuls are well characterized. By sequence identity (orthology), a family of leucine-rich repeat receptor kinases from Arabidopsis thaliana was identified as AtORK11 (Arabidopsis thaliana Ovule Receptor Kinase 11). Based upon previous results from its ortholog in Solanum chacoense, the ovary- specific ScORK11 receptor kinase, we hypothesized that members of the AtORK11 receptors would be involved in gametophyte development and reproduction. In order to characterize the role of the four family members (AtORK11a, AtORK11b, AtORK11c and AtORK11d), a T-DNA insertional mutant strategy was undertaken, as well as bimolecular fluorescence complementation assays (BiFC). No precise function could be assigned to the double mutants although a dominant negative strategy revealed an involvement in gametophytic development. It was also shown that all of the receptors could form homodimers as well as heterodimers in a heterologous system, suggesting high functional redundancy for the AtORK11 family.

PCNA est une protéine essentielle qui intervient dans de nombreux mécanismes cellulaires et qui possède de nombreuses modifications post-traductionnelles (MPTs) dont les fonctions de certaines, restent encore inconnues. Afin d’étudier la fonction de ces MPTs, nous avons développé un nouvel outil génétique permettant in cellulo, de substituer la protéine endogène PCNA par une version mutée de la protéine appelée version de complémentation. La technique consiste à cotransfecter des cellules en culture avec deux types de plasmides. Un premier plasmide permet l’invalidation du gène de PCNA endogène dans les cellules transfectées par le système CRISPR-Cas9. Le deuxième plasmide dit de complémentation permet l’expression d’une forme mutée de PCNA. Sur l’ensemble d’une banque de mutants testés, deux mutants de PCNA se sont avérés être létaux (D122A et E124A). Nous avons démontré que ces deux sites sont impliqués dans l’initiation d’une voie de dégradation ubiquitine dépendante CRL4Cdt2 essentielle pour la mise en place de la protéolyse d’un cocktail de protéines (cdt1, p21, set8) durant la phase S. Nous avons démontré que les cellules mutantes pour PCNA (D122A et E124A) accumulent la protéine p21. Ce défaut de dégradation de p21 provoque alors des évènements de re-réplication menant à terme à la mort des cellules mutantes. / PCNA is an essential protein that is involved in many cellular mechanisms and has many post-translational modifications (PTMs). The functions of some PTMs, still remain unknown. In order to study the function of these PTMs, we have developed a new genetic tool allowing, in cellulo, the substitution of endogenous PCNA protein with a mutated version of the protein named complementation version. The technique involves cotransfection of the cells in culture with two types of plasmids. A first plasmid allows invalidation of the endogenous PCNA gene in transfected cells by the CRISPR-Cas9 system. The second plasmid, named complementation plasmid allows the expression of a mutated form of PCNA. In the whole bank of tested mutants, two PCNA mutants were found to be lethal (D122A and E124A). We have demonstrated that these two sites are involved in the initiation of an ubiquitin-dependent protein degradation CRL4Cdt2 pathway essential for the proteolysis of a protein cocktail (cdt1, p21, set8) during the S phase. We demonstrated that PCNA mutant cells (D122A and E124A) accumulate p21 protein. This lack of degradation of p21 then causes re-replication events leading ultimately to the mutant cells death.

Cyclic nucleotide-gated channels (CNGCs) are non-selective cation channels that were first identified in vertebrate photosensory and olfactory neurons. Although the physiological roles and biophysical properties of animal CNGCs have been well studied, much less is known about these channels in plants. The Arabidopsis genome encodes twenty putative CNGC subunits that are postulated to form channel complexes that mediate various physiological processes involving abiotic and biotic stress responses, ion homeostasis and development. The identification of Arabidopsis autoimmune CNGC mutants, such as defense no death class (dnd1 and dnd2), and the constitutive expressor of pathogenesis related genes 22 (cpr22) implicate AtCNGC2, 4, 11 and 12 in plant immunity. Here, I present a comprehensive study of the molecular mechanisms involved in CNGC-mediated signaling pathways with emphasis on pathogen defense. Previously, a forward genetics approach aimed to identify suppressor mutants of the rare gain-of-function autoimmune mutant, cpr22, identified key residues that are important for CNGC subunit interactions and channel function. First, I present a structure-function analysis of one of these suppressor mutants (S58) that revealed a key residue in the cyclic nucleotide binding domain involved in the stable regulation of CNGCs. Second, I present a new suppressor screen using AtCNGC2 T-DNA knockout mutants that specifically aimed to identify novel downstream components of CNGC-mediated pathogen defense signaling. In this screen, I successfully isolated and characterized the novel Arabidopsis mutant, repressor of defense no death 1 (rdd1), and expanded this study to demonstrate its involvement in AtCNGC2 and AtCNGC4-mediated signal transduction. Additionally, I demonstrated for the first time, the physical interaction of AtCNGC2 and AtCNGC4 subunits in planta. The findings presented in this thesis broaden our current knowledge of CNGCs in plants, and provide a new foundation for future elucidation of the structure-function relationships and signal transduction mediated by these channels.

Cyclic nucleotide-gated channels (CNGCs) are non-selective cation channels that were first identified in vertebrate photosensory and olfactory neurons. Although the physiological roles and biophysical properties of animal CNGCs have been well studied, much less is known about these channels in plants. The Arabidopsis genome encodes twenty putative CNGC subunits that are postulated to form channel complexes that mediate various physiological processes involving abiotic and biotic stress responses, ion homeostasis and development. The identification of Arabidopsis autoimmune CNGC mutants, such as defense no death class (dnd1 and dnd2), and the constitutive expressor of pathogenesis related genes 22 (cpr22) implicate AtCNGC2, 4, 11 and 12 in plant immunity. Here, I present a comprehensive study of the molecular mechanisms involved in CNGC-mediated signaling pathways with emphasis on pathogen defense. Previously, a forward genetics approach aimed to identify suppressor mutants of the rare gain-of-function autoimmune mutant, cpr22, identified key residues that are important for CNGC subunit interactions and channel function. First, I present a structure-function analysis of one of these suppressor mutants (S58) that revealed a key residue in the cyclic nucleotide binding domain involved in the stable regulation of CNGCs. Second, I present a new suppressor screen using AtCNGC2 T-DNA knockout mutants that specifically aimed to identify novel downstream components of CNGC-mediated pathogen defense signaling. In this screen, I successfully isolated and characterized the novel Arabidopsis mutant, repressor of defense no death 1 (rdd1), and expanded this study to demonstrate its involvement in AtCNGC2 and AtCNGC4-mediated signal transduction. Additionally, I demonstrated for the first time, the physical interaction of AtCNGC2 and AtCNGC4 subunits in planta. The findings presented in this thesis broaden our current knowledge of CNGCs in plants, and provide a new foundation for future elucidation of the structure-function relationships and signal transduction mediated by these channels.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) constituent la plus grande classe de récepteurs membranaires impliqués dans la transmission des signaux extracellulaires. Traditionnellement, la transmission de la signalisation par les RCPGs implique l’activation d’une protéine G hétéro-trimérique qui pourra à son tour moduler l’activité de divers effecteurs intracellulaires. Ce schéma classique de signalisation s’est complexifié au fils des années et l’on sait maintenant qu’en plus d’interagir avec les protéines G, les RCPGs s’associent avec une panoplie d’autres protéines afin de transmettre adéquatement les signaux extracellulaires. En particulier, la découverte d’une famille de protéines transmembranaires modulant la fonction des RCPGs, baptisées protéines modifiant l’activité des récepteurs (« receptor activity-modifying proteins » ; RAMPs), a changé la façon de concevoir la signalisation par certains RCPGs. Dans le cas du récepteur similaire au récepteur de la calcitonine (« calcitonin-like receptor » ; CLR), l’association avec les RAMPs permet l’acheminement à la surface cellulaire du récepteur tout en modulant ses propriétés pharmacologiques. Lorsqu’il est associé avec RAMP1, le CLR fonctionne comme un récepteur du peptide relié au gène de la calcitonine (« calcitonin gene-related peptide » ; CGRP), alors qu’il devient un récepteur de l’adrénomedulline lorsqu’il interagit avec RAMP2 ou RAMP3. D’autre part, en plus d’interagir avec des protéines accessoires transmembranaires telles les RAMPs, les RCPGs peuvent aussi s’associer entre eux pour former des oligomères de récepteurs. Dans cette thèse, nous nous sommes penchés sur les interactions entre les RCPGs et les RAMPs, et plus particulièrement sur l’interrelation entre ce type d’association RCPG/RAMP et l’assemblage en oligomères de récepteurs, en utilisant le récepteur du CGRP comme modèle d’étude. Une première étude nous a tout d’abord permis de confirmer l’interaction entre le récepteur CLR et RAMP1, dans un contexte de cellules vivantes. Nous avons démontré que ce complexe CLR/RAMP1 active la protéine G et recrute la protéine de signalisation -arrestine suite à une stimulation par le CGRP. Ensuite, nous avons déterminé que même s’il doit obligatoirement former un hétéro-oligomère avec les RAMPs pour être actif, le CLR conserve malgré tout sa capacité à interagir avec d’autres RCPGs. En plus d’observer la présence d’homo-oligomère de CLR, nous avons constaté que tout comme les RCPGs, les RAMPs peuvent eux-aussi s’associer entre eux pour former des complexes oligomériques pouvant comprendre différents sous-types (RAMP1/RAMP2 et RAMP1/RAMP3). Cette observation de la présence d’homo-oligomères de CLR et de RAMP1, nous a amené à nous questionner sur la stœchiométrie d’interaction du complexe CLR/RAMP1. Dans une deuxième étude ayant pour but d’établir la composition moléculaire du récepteur CGRP1 in vivo, nous avons développé une nouvelle approche permettant l’étude de l’interaction entre trois protéines dans un contexte de cellules vivantes. Cette technique baptisée BRET/BiFC, est basée sur le transfert d’énergie de résonance de bioluminescence entre un donneur luminescent, la Renilla luciférase, et un accepteur fluorescent, la protéine fluorescente jaune (YFP), reconstituée suite au ré-assemblage de ces deux fragments. En utilisant cette approche, nous avons pu déterminer que le récepteur CGRP1 est constitué d’un homo-oligomère de CLR interagissant avec un monomère de RAMP1. En démontrant un assemblage oligomérique asymétrique pour le récepteur CGRP1 à partir d’une nouvelle approche biophysique, nous croyons que les travaux présentés dans cette thèse ont contribué à élargir nos connaissances sur le fonctionnement de la grande famille des RCPGs, et seront utile à la poursuite des recherches sur les complexes protéiques impliqués dans la signalisation. / G protein coupled receptors (GPCRs) constitute the largest family of membrane receptors involved in signal transduction. Traditionally, signal transduction by GPCRs involves the activation of a hetero-trimeric G protein which will then modulate the activity of several intracellular effectors. We can now appreciate the fact that in addition to their interaction with G proteins, GPCRs also associate with several other proteins, in order to allow proper signal transduction. In particular, the discovery of a family of proteins called receptor activity-modifying proteins (RAMPs) has challenged the traditional views of signal transduction by some GPCRs. In the case of the calcitonin-like receptor (CLR), the association with RAMPs allows the proper cell surface targeting of the receptor in addition to modulate it’s pharmacological properties. Co-expression of CLR with RAMP1 leads to a calcitonin gene-related peptide (CGRP) receptor, whereas CLR association with RAMP2 or RAMP3 promotes the formation of an adrenomedullin receptor. In addition to their interaction with transmembrane accessory proteins such as RAMPs, GPCRs can also interact with other receptors to form receptors oligomers. In this thesis, we were interested in the interactions between GPCRs and RAMPs, and particularly, in the link between these GPCR/RAMP interactions and the assembly of receptor oligomers, using CGRP1 receptor as a model. We first confirmed the interaction between CLR and RAMP1 in living cells. We showed that this CLR/RAMP1 complex activates G proteins and recruits the signalling protein -arrestin upon CGRP stimulation. Next, we demonstrated that even if the CLR requires hetero-oligomeric assembly with RAMPs in order to be active, this receptor can still interact with other GPCRs. In addition to CLR homo-oligomers, we observed that RAMPs can also self-associate to form oligomeric complexes which can involve different subtypes (RAMP1/RAMP2 and RAMP1/RAMP3). This observation of the presence of CLR and RAMP1 homo-oligomers raised the question of the stoiechiometry of interaction of the CLR/RAMP1 complex. In order to establish the molecular composition of the CGRP1 receptor in vivo, we developed a novel approach allowing the detection of the interaction between three proteins in living cells. This method called BRET/BiFC is based on the bioluminescence resonance energy transfer between a luminescent energy donor, Renilla luciferase, and a fluorescent energy acceptor, the yellow fluorescent protein (YFP), reconstituted after the re-association of its two fragments. Using this approach, we showed that the CGRP1 receptor consist of a homo-oligomer of CLR interacting with a monomer of RAMP1. By demonstrating the asymmetrical organization of the CGRP1 receptor complex using a novel biophysical approach, we believe that the results presented herein have contributed to increase our knowledge of the mechanisms of function of the large family of GPCRs and will be useful for the pursuit of research on protein complexes involved in signalling pathways.

Au cours du développement des végétaux, de l’établissement de l’identité cellulaire des premiers organes au guidage du tube pollinique, la communication cellule à cellule est d’une importance capitale. En réponse, les voies de signalisation moléculaires sont élaborées pour la perception d’un signal extérieur et la transduction en une réponse génique via une cascade intracellulaire. Les récepteurs kinases font partie des protéines perceptrices des stimuli et constituent chez les plantes une catégorie de protéines avec une occurrence considérable, mais dont très peu d’informations détaillées sont disponibles à ce jour. Une famille de récepteurs kinases chez Arabidopsis thaliana, AtORK11 (Arabidopsis thaliana Ovule Receptor Kinase 11), a été identifiée par orthologie à un récepteur spécifique aux ovaires chez une solanacéee sauvage, Solanum chacoense. La fonction présumée de cette famille de récepteurs kinases de type leucine-rich repeat, suggérée par son patron d’expression, implique les événements relatifs au développement des gamétophytes et à la reproduction. Afin de caractériser la fonction des quatre gènes de la famille (AtORK11a, AtORK11b, AtORK11c et AtORK11d) une stratégie d’analyse de mutants d’insertion de l’ADN-T et d’évaluation du mode d’action par complémentation bimoléculaire par fluorescence (BiFC) a été entreprise. Aucune fonction précise n’a pu être attribuée aux doubles mutants d’insertion, par contre la surexpression d’une construction dominante négative indique un rôle dans le développement gamétophytique. Il a aussi été démontré que les quatre récepteurs peuvent interagir par homodimérisation aussi bien que par hétérodimérisation. Une hypothèse de redondance fonctionnelle est ainsi mise à jour parmi la famille des gènes AtORK11. / Cell to cell communication is paramount during plant developmental processes, from cellular identity in early organogenesis to pollen tube guidance. In response to this requirement, molecular cell signalling is used to perceive an external signal and transduce the response by an intracellular signalling cascade leading to specific gene activation. The sensing protein is typically a receptor kinase, which will transduce the stimulus by phosphorylation of a cytoplasmic interaction partner. Although plant receptor kinases represent the largest protein kinase family, only handfuls are well characterized. By sequence identity (orthology), a family of leucine-rich repeat receptor kinases from Arabidopsis thaliana was identified as AtORK11 (Arabidopsis thaliana Ovule Receptor Kinase 11). Based upon previous results from its ortholog in Solanum chacoense, the ovary- specific ScORK11 receptor kinase, we hypothesized that members of the AtORK11 receptors would be involved in gametophyte development and reproduction. In order to characterize the role of the four family members (AtORK11a, AtORK11b, AtORK11c and AtORK11d), a T-DNA insertional mutant strategy was undertaken, as well as bimolecular fluorescence complementation assays (BiFC). No precise function could be assigned to the double mutants although a dominant negative strategy revealed an involvement in gametophytic development. It was also shown that all of the receptors could form homodimers as well as heterodimers in a heterologous system, suggesting high functional redundancy for the AtORK11 family.

Apyrasen (NTPDasen) sind Nukleosidtri- und diphosphat spaltende Enzyme. Bisher konnten Apyrasen in allen untersuchten Pro- und Eukaryonten nachgewiesen werden. Im Gegensatz zu tierischen Organismen, in denen Apyrasen gut untersucht sind und eine Rolle in der Nukleotid-vermittelten Signaltransduktion spielen, ist in Pflanzen weit weniger bekannt. In dem Modellorganismus A. thaliana wurden bisher zwei Apyrasen – AtAPY1 und AtAPY2 – als funktionell beschrieben. Durch Knockoutstudien konnte gezeigt werden, dass beide Apyrasen redundant sind. Der Doppelknockout der AtAPY1 und AtAPY2 ist im Gegensatz zum Einzelknockout einer Apyrase letal. Auf Grund von Vorarbeiten wurde die AtAPY1 extrazellulär im Apoplasten vermutet, wo sie eine Rolle im ATP-Signalweg spielen könnte. In der vorliegenden Arbeit sollte die Apyrase 1 (AtAPY1) biochemisch charakterisiert und subzellulär lokalisiert werden. Die Aufklärung der biochemischen Eigenschaften und der subzellullären Lokalisation der AtAPY1 würde entscheidend mithelfen, die Funktion der Apyrasen in Pflanzen aufzuklären. Für die biochemische Charakterisierung wie der Bestimmung des pH-Optimums und des Substratspektrums der AtAPY1 war die Reinigung einer aktiven AtAPY1 notwendig. Da eine Überexpression einer aktiven AtAPY1 in E. coli nicht möglich war, wurde zur biochemischen Charakterisierung die AtAPY1 mit verschiedenen Systemen in vitro translatiert. Bei Verwendung von Retikulozytenextrakten konnte die AtAPY1 in vitro translatiert werden, zeigte aber in den Aktivitätstests keine Aktivität. Auf Grund ihrer enzymatischen Aktivität und Struktur scheint die AtAPY1 inhibierend auf verschiedene Expressionssysteme zu wirken, was die Gewinnung von aktiver AtAPY1 stark limitiert. In einem weiteren Ansatz wurde die AtAPY1-GFP nativ aus transgenen A. thaliana mittels anti-GFP markierter Matrix gereinigen. Die Reinigung der AtAPY1-GFP aus dem Gesamtproteinextrakt war erfolgreich und die immobilisierte AtAPY1-GFP zeigte eine Apyraseaktivität. Eine anschließende Elution des Proteins von der Matrix war allerdings zu stringent und führte zum vollständigen Aktivitätsverlust. Für die subzelluläre Lokalisation wurden Apyraseeinzelknockouts in Vorarbeiten mit zwei unabhängigen Konstrukten transformiert: zum einen wurde die Atapy1 C-terminal mit dem SNAP-Tag fusioniert und unter ihrem nativen Promotorbereich exprimiert, zum anderen erfolgte eine Überexpression der AtAPY1-GFP unter dem konstitutiven CaMV 35S-Promotor. Die komplementierten Pflanzen zeigten keine phänotypischen Unterschiede im Vergleich zum Wildtyp. Durch Immunfluoreszenz und in vivo Mikroskopie konnte die AtAPY1 in vesikelartigen Strukturen, jedoch nicht in der Plasmamembran oder extrazellulären Matrix nachgewiesen werden. Um die detektierten Strukturen einem Organell zuzuordnen, wurden Co-Lokalisationsstudien durchgeführt. Für Co-Lokalisation wurden die AtAPY1-GFP Pflanzen mit Markerproteinen transformiert oder mit den entsprechenden transgenen Pflanzen gekreuzt. Zum Nachweis der AtAPY1-GFP im sekretorischen Weg oder endozytotischen Vesikeln wurden transgene AtAPY1-GFP Pflanzen mit RabE1d-YFP transformiert, was jedoch keine Co-Lokalisation zeigte. Anschließend erfolgten Kreuzungen mit transgenen Pflanzen, die die Golgi-Markerproteine Membrin 12, Syntaxin of plants 32 oder Golgi transport protein 1-Homolog exprimierten. Mit allen drei Kreuzungen konnte eine Co-Lokalisation der AtAPY1-GFP mit dem entsprechenden Markerprotein im Golgi gezeigt werden. Durch eine zusätzliche Behandlung der AtAPY1-GFP Pflanzen mit dem Membranfarbstoff FM4-64, welcher das trans-Golgi-Netzwerk aber nicht den Golgi-Apparat anfärbt und dem fungiziden Toxin Brefeldin A, welches zur Bildung von BFA-Kompartimenten durch die Fusion des trans-Golgi-Netzwerks mit Endosomen und Teilen des trans-Golgi-Apparates führt, konnte die AtAPY1-GFP dem Golgi-Apparat zugewiesen werden. Weiterhin wurde untersucht, ob die AtAPY1 löslich oder membrangebunden im Golgi-Apparat vorliegt. Um zwischen löslichen, peripheren und integralen Membranproteinen zu unterscheiden, wurde das mikrosomale Pellet mit verschiedenen Detergenzien und Salzen behandelt. Hohe Salz- (2 M NaCl) und alkalische Bedingungen (0,2 M Na2CO3) führten zur Ablösung peripherer Proteine von der Membran. Harnstoff (4 M) und das anionische Detergenz SDS (0,2 %) führten zur Denaturierung von Proteinen und zum Nachweis integraler Proteine. Es konnte gezeigt werden, dass die AtAPY1-GFP ein integrales Membranprotein ist, da sie ausschließlich in den mit SDS und Harnstoff behandelten Fraktionen im Überstand mittels Western Blot nachgewiesen werden konnte. Die genaue Funktion der AtAPY1 im Golgi-Apparat ist noch ungeklärt, da der Fokus der bisherigen Apyraseforschung von einer Lokalisation der AtAPY1 in der Plasmamembran ausging und frühere Ergebnisse in neuem Kontext diskutiert werden müssen.

Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / Desde a redemocratização do país em 1985 o MRE já vinha se posicionando à favor do diálogo com os mais diversos grupos e entidades sociais. Neste sentido, observou-se ao longo dos últimos anos um aprofundamento da interação com parlamentares, governos estaduais e municipais, empresários, sindicalistas, ONGs e imprensa. A construção de vínculos entre as organizações da sociedade civil críticas das negociações comerciais ao longo da década de 1990 permite falar na criação de um novo campo de ação coletiva transnacional, definido como um espaço de ação política formado por indivíduos e organizações da sociedade civil que participam do processo de elaboração de um conjunto comum de práticas, objetivos e crenças. O que se pode concluir é que diante de um contexto mais competitivo e globalizado, após processo de abertura comercial e intensificação da participação brasileira nas negociações internacionais, a representação dos interesses da classe empresarial teve que se adaptar criando uma nova forma de organização. Desse modo, o presente trabalho visa analisar a crescente interferência de grupos de interesse no processo de tomada de decisão, no que tange aos assuntos de política externa comercial brasileira, tais como as negociações comerciais internacionais por se tratar de um ambiente cujos interesses da classe empresarial mais podem ser afetados. As negociações comerciais internacionais é o ambiente em que a atuação empresarial mais pode ser percebida. As negociações do Mercosul e da ALCA possibilitam observar a participação ativa destes novos atores. Sendo assim, o trabalho apresenta a nova dinâmica de relacionamento entre Estado e grupos da sociedade civil (classe empresarial) para temas ligados a comércio exterior. / Since the democratization of the country in 1985 the Ministry of Foreign Affairs was already positioning itself to promote a dialogue with the various groups and charities. In this sense, it was observed over the past year a further interaction with lawmakers, state and local governments, businessmen, trade unionists, NGOs and media. The building of links between civil society organizations critical of trade negotiations throughout the 1990s allows us to speak on creating a new field of transnational collective action, defined as a space for political action made up of individuals and civil society organizations that participate the process of developing a common set of practices, beliefs and goals. What can be concluded is that before a more competitive and globalized, after opening up of trade and intensification of the Brazilian participation in international negotiations, representing the interests of the business class had to adapt by creating a new form of organization. Thus, this study aims to examine the growing interference of interest groups in decision-making process, with respect to matters of Brazilian foreign trade policy, such as international trade negotiations because it is an environment whose interests the business class more may be affected. International trade negotiations are the environment in which business activity can be more noticeable. Negotiations of the Mercosur and the FTAA allow you to observe the active participation of new actors. Thus, the paper presents a new dynamic relationship between state and civil society groups (business class) for issues related to foreign trade.

Aspergillus westerdijkiaem qui est récemment démembré d'A. ochraceus est un producteur principal de plusieurs composés de type polycétone d'importance économique. Ces composés incluent l’ochratoxin A, mellein, l'acide penicillique, asperlactone et l’isoasperlactone et quelques intermédiaires comme l'acide 6- methylsalicylique et l’acide orsellinique. La biosynthèse de ces métabolites est catalysée par un groupe d'enzymes connues comme la polycétone synthases (PKSs). Ce travail a été visé pour cloner et a caractérisé fonctionnellement les différentes genes des PKS i.e. aoks1, aolc35-12 et aomsas, et de genes de polyketide synthases-non ribosomal peptide synthase (PKS-NRPS) i.e. aolc35-6, chez A. westerdijkiae. Ces gènes ont été inactivés par l'insertion du gène d’hygromycine B phosphotransferase d’Escherichia coli dans le génome d'A. westerdijkiae, pour obtenir les mutantes ao?ks1, ao?lc35-12, ao?msas et ao?lc35-6. Les mutants ao?ks1 et ao?lc35-12 ont été trouvés déficients dans la biosynthèse d’ochratoxin A, mais produisaient encore mellein. À notre connaissance, c’est la première fois que nous avons caractérisé les gènes impliquées dans la biosynthèse d’OTA, sachant que mellein, qui était proposé dans la littérature comme un intermédiaire, joue a cune role dans la biosynthesis de l'OTA. Ensuite le mutant ao?msas n'a pas seulement perdu la capacité de produire isoasperlactone et asperlactone, mais aussi il ne produit pas l’intermédiaire acide 6-methylsalicylique. Basé sur les expériences de la caractérisation génétique et de complémentation chimiques, nous avons proposé un shéma hypothétique de la biosynthèse d’asperlactone et isoasperlactone dans lequel l'acide 6-methylsalicylique, diepoxide et aspyrone jouent le rôle d’intermédiaires. La techniques de gène knock-out et de la reverse transcription PCR (RT-PCR) ont montré que seulle gène de type PKS-NRPS « aolc35-6 » identifié chez A. westerdijkiae codant pour un intermédiaire inconnu(s) qui pourrait inciter l'expression de gène aomsas et un gène impliqué dans la biosynthèse d'acide orsellinique et d'acide penicillique. / Aspergillus westerdijkiaem which is recently dismembered from A. ochraceusm is the principal producer of several economically important polyketide metabolites. These metabolites include ochratoxin A, mellein, penicillic acid, asperlactone and isoasperlactone and some intermediates like orsellinic acid and 6-methylsalicylic acid. The biosynthesis of these metabolites is catalyzed by a group of enzymes known as polyketide synthases (PKSs). This work was aimed to clone and functionally characterized various PKS i.e. aoks1, aolc35-12 and aomsas, and polyketide synthasesnon ribosomal peptide synthase (PKS-NRPS) genes i.e. aolc35-6, in A. westerdijkiae. These genes were inactivated by the insertion of Escherichia coli hygromycin B phosphotransferase gene in the genome of A. westerdijkiae to obtain ao?ks1, ao?lc35-12, ao?msas and ao?lc35-6 mutants. ao?ks1, ao?lc35-12 mutants were found deficient in ochratoxin A biosynthesis but are still producing mellein. To our knowledge, we for the first time characterized a gene involved in OTA biosynthesis, with the information about mellein which was proposed in the literature to be an intermediate OTA. Further ao?msas mutant not only lost the capacity to produce isoasperlactone and asperlactone but also the intermediate nature product 6-methylsalicylic acid. Based on the genetic characterization and chemical complementation experiments, we have proposed a hypothetical pathway mentioning that 6-methylsalicylic acid, diepoxid and aspyrone are intermediates of isoasperlactone and asperlactone. Gene knockout technique and reverse transcription PCR (RT-PCR) shown that the only PKS-NRPS gene aolc35-6 so far identified in A. westerdijkiae encoding certain unknown intermediate(s) which induces the expression of aomsas gene and a gene involved in the biosynthesis of orsellinic acid and penicillic acid.

Para que el proceso infeccioso de un virus de plantas tenga éxito la progenie viral tiene que propagarse desde las primeras células infectadas al resto de la planta; inicialmente se moverá célula a célula a través de los plasmodesmos (PDs) hasta alcanzar el sistema vascular, lo cual le permitirá invadir las partes distales de la planta. En este proceso, las proteínas de movimiento (MPs), junto con la colaboración de otros actores secundarios, desempeñan un papel relevante. El conocimiento de la posible asociación de las MPs con estructuras u orgánulos celulares así como de la interacción con factores del huésped es de vital importancia para poder desarrollar estrategias antivirales que permitan una mejora en la producción de los cultivos. Además, este tipo de estudios no sólo han posibilitado un mayor conocimiento de las respuestas al estrés en plantas sino que han sido pioneros en desentrañar los mecanismos de translocación intercelular de factores celulares implicados en los procesos de desarrollo de las plantas. Las MPs virales se clasifican en familias/grupos en función de su grado de similitud. Los virus, cuyas MPs pertenecen a la Superfamilia 30K, expresan una única MP encargada de orquestar el movimiento intra- e intercelular de genoma viral. En el Capítulo 1 de la presente Tesis se ha caracterizado la asociación de la MP del Virus del mosaico del tabaco (TMV), miembro tipo de la familia 30K, al sistema de endomembranas. Mediante el uso de aproximaciones in vivo se ha estudiado la eficiencia de inserción de sus regiones hidrofóbicas (HRs) en la membrana del retículo endoplasmático (ER). Nuestros resultados demuestran que ninguna de las dos HRs de la MP es capaz de atravesar las membranas biológicas y que la alteración de la hidrofobicidad de la primera HR es suficiente para modificar su asociación a la membrana. En base a los resultados obtenidos, proponemos un modelo topológico en el cual la MP del TMV se encontraría fuertemente asociada a la cara citosólica de la membrana del ER, sin llegar a atravesarla. La observación de que i), el modelo propuesto es compatible con otros motivos, previamente caracterizados, de la MP de TMV y ii), concuerda con la topología descrita para otras MPs de la familia 30K, permite cuestionar el modelo establecido desde el año 2000 para la MP de TMV así como predecir, en base a la conservada estructura secundaria de las MPs de esta familia, una topología similar para todos sus componentes. Para el transporte intercelular de los virus de plantas se han descrito tres modelos en base a la capacidad de transportar complejos ribonucloeprotéicos, a través de PD modificados, formados por el RNA viral y la MP (ej. MP de TMV) más la proteína de cubierta (ej. MP del virus del mosaico del pepino, CMV) o la capacidad de transportar viriones a través estructuras tubulares formadas por la MP (ej. MP del Virus del mosaico del caupí, CPMV). A pesar de las diferencias observadas entre los tres modelos, las MPs representativas de cada uno de ellos pertenecen a la misma familia 30K y son funcionalmente intercambiables (MPs de TMV, CMV, CPMV, Virus del mosaico del Bromo -BMV- o Virus de los anillos necróticos de los prunus -PNRSV-) por la MP del Virus del mosaico de la alfalfa (AMV), para el transporte a corta distancia. Con el objeto de comprender la versatilidad que presentan las MPs en cuanto al movimiento viral, hemos analizado la capacidad de estas MPs heterólogas de transportar sistémicamente el genoma quimérico del AMV. El estudio ha revelado que todas las MPs analizadas permiten el transporte del genoma quimera a las partes distales de la planta, independientemente del modelo descrito para el transporte a corta distancia, aunque requieren la extensión de los 44 aminoácidos C-terminales de la MP del AMV. Además, para todas las ellas, excepto para la MP del TMV, se ha establecido una relación entre la capacidad de movimiento local y la presencia del virus en las hojas no inoculadas de la planta, indicando la existencia de un umbral de transporte célula a célula, por debajo del cual, el virus es incapaz de invadir sistémicamente la planta. Durante el proceso de infección viral, las MPs interaccionan tanto con otras proteínas de origen viral como de la planta huésped. La interacción entre las MPs y dichos factores de la planta afectan a la patogénesis viral, facilitando u obstaculizando el movimiento intra- o intercelular del virus. En el Capítulo 3 del presente trabajo hemos demostrado la interacción entre la MP del AMV y dos miembros de la familia de Patellinas de arabidopsis, Patellin 3 (atPATL3) y Patellin 6 (atPATL6), mediante el sistema de los dos híbridos de levadura y ensayos de reconstitución bimolecular de la fluorescencia. Nuestros resultados, en general, demuestran que la interacción entre la MP-PATLs obstaculizaría un correcto direccionamiento de la MP al PD, dando lugar a un movimiento intracelular menos eficiente de los complejos virales, que forma la MP, y disminuyendo el movimiento célula a célula del virus. Podríamos estar hablando de un posible mecanismo de defensa de la planta, dirigido a evitar la invasión sistémica del huésped. En este sentido, las MPs virales pueden ser buenos candidatos para el desarrollo de estrategias antivirales dado que cualquier respuesta de defensa de la planta que, a priori, reduzca el transporte célula a célula del virus, puede representar la diferencia entre una infección local o sistémica, como hemos observado en el Capítulo 2 del presente trabajo. Los virus, a su vez, también son capaces de evolucionar hacia variantes más eficaces, que permitan superar las diferentes barreras defensivas de la planta huésped. En este contexto hemos identificado a la MP del Virus del bronceado del tomate (TSWV) como determinante de avirulencia en la resistencia mediada por el gen Sw-5. Del mismo modo, comprobamos que el cambio de 1-2 residuos de amino ácidos de la MP de TSWV fue suficiente para superar la resistencia pero que a la vez, y posiblemente debido a las altas restricciones que conlleva el reducido genoma de un virus, afectaron a la eficiencia de la MP. / Peiró Morell, A. (2014). Proteínas de movimiento de la familia 30K:interacción con membranas biológicas y factores proteicos y su implicación en el transporte viral [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/48471 / TESIS