A espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS) é uma das diferentes técnicas de análise por imagens de alta resolução espacial e temporal de biomoléculas em concentrações extremamente baixas. Ela se tornou uma técnica extremamente poderosa e sensível em áreas como bioquímica e biofísica. Como uma técnica bem estabelecida, ela é utilizada para medir concentrações locais de biomoléculas, através da marcação com moléculas fluorescentes. Coeficientes de difusão e constantes cinéticas também podem ser medidos através de FCS assim como detecção de molécula única. Ela também pode dar informação precisa sobre interações de antígeno-anticorpo, ácidos nucleicos e proteínas. Através de uma combinação de marcadores de alto rendimento quântico, fontes de luz estável (lasers), detecção ultrassensível e microscopia confocal, é possível realizar medidas de FCS em volumes de fentolitros (fL) e em concentrações de nanomolar (nM) em soluções aquosas ou em células vivas. Em contraste com outras técnicas de fluorescência, a sensibilidade da FCS aumenta com a diminuição da concentração do fluoróforo marcador, porque o parâmetro de interesse não é a intensidade de emissão de fluorescência, mas sim as flutuações espontâneas da fluorescência. Durante o tempo em que a partícula ou molécula atravessa o volume de medida pode ocorrer mudanças conformacionais e reações químicas e fotofísicas que alteram as características de emissão do fluoróforo e causam flutuações no sinal detectado. Estas flutuações são então monitoradas e transformadas em uma curva de autocorrelação, por intermédio de um software comercial que emprega um modelo físico apropriado para FCS. Em nosso estudo, utilizamos um marcador comercial (ALEXA 488®) para marcar proteínas. Primeiramente utilizamos a técnica de FCS para medir concentrações extremamente baixas de marcadores fluorescentes. Também realizamos um experimento testando a influência da viscosidade do meio na difusão livre do fluoróforo, assim como as melhores condições em que temos um melhor sinal de FCS. Por fim, estudamos a difusão de proteínas marcadas (PUC II e IV) em meio aquoso (PBS) e no interior de células. / Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is one of the many different modes of high-resolution spatial and temporal analysis of extremely low concentrated biomolecules. It has become a powerful and sensitive tool in fields like biochemistry and biophysics. As a well established technique, it is used to measure local concentrations of fluorescently labeled biomolecules, diffusion coefficients, kinetic constants and single molecule studies. Through a combination of high quantum yield fluorescent dyes, stable light sources (lasers), ultrasensitive detection and confocal microscopy is possible to perform FCS measurements in femtoliters volumes and nanomolar concentrations in aquous solution or in live cells. Unlike with other fluorescence technics, its sensibility increases with the decrease of dye concentrarion, because the main factor is not the emission intensity itself. Instead this, spontaneous statistical fluctuation of fluorescence becomes the main factor in FCS analisys. During the time that the conjugated-dye cross the volume detection can occur conformational changes, chemical reaction and photophysical processes that can change the emission properties of the dye and, then, change the detected sinal. This fluctuations are tracked and changed into a autocorrelation curve, by a specific software, appropriate to perform FCS analisys. In our study, we use comercial dye (Alexa 488) to label proteins. Firstly, we applied FCS to measure extremally diluted concentrations of dyes (~1 nM). We have performed experiments testing the influence of the viscosity medium in the free difusion of the dyes and the optical apparatus and conditions that result in the best FCS signal. We also have studied protein diffusion (PUC II e IV) in aquous medium (PBS) and toward the inner of the cells.

O presente estudo teve como objetivo avaliar, in vitro, a influência de diferentes protocolos de tratamento da dentina intrarradicular de raízes fragilizadas sobre a resistência de união (RU) de pinos fibrorreforçados fixados com diferentes cimentos resinosos. Quarenta e dois caninos superiores humanos tiveram suas raízes padronizadas em 17mm após eliminação das porções coronárias. O preparo biomecânico foi realizado por meio do sistema Reciproc, com instrumento R 50.05 e NaOCl 2,5%. As raízes foram fragilizadas por meio das brocas #4137 e #720G na profundidade de 12mm e obturadas pela técnica da condensação lateral com cimento AH Plus acrescido de Rhodamina B 0,1%. Decorrido 3 vezes o tempo de endurecimento a obturação foi removida e os pinos de fibra de vidro reembasados com resina composta. As raízes foram distribuídas em 3 grupos (n=14) conforme o tratamento da superfície dentinária: NaOCl 2,5%; NaOCl 2,5% + EDTA 17% e; NaOCl 2,5% + EDTA 17% + ultrassom. Em metade dos espécimes de cada grupo a cimentação do pino foi realizada com RelyX U200 e na outra, com Panavia F. Ambos cimentos foram acrescidos de fluoreceína 0,1%. As raízes foram seccionadas transversalmente obtendo-se dois slices de cada terço, um destinado ao teste de push-out e outro, à análise por meio do Confocal e mensuração da microdureza Knoop. Os dados foram submetidos ao teste ANOVA com parcela sub-dividida seguido do teste de Tukey (&alpha;=0,05). Os maiores valores de RU foram observados com o NaOCl + EDTA e NaOCl + EDTA + ultrassom (p>0,01) em relação ao NaOCl isolado (p<0,0001). A Panavia F apresentou maior RU que o RelyX U200 nos espécimes tratados com NaOCl + EDTA e NaOCl + EDTA + ultrassom (p<0,0001), nos três terços radiculares. Não houve diferença entre os materiais cimentantes nos espécimes tratados apenas com NaOCl (p>0,01). Os protocolos não influenciaram a RU do cimento RelyX U200. Em geral a maior incidência de falha foi do tipo adesiva (38,83%), seguido da mista (34,72%) e coesiva (26,45%). O tratamento da dentina com NaOCl + EDTA + ultrassom promoveu a maior redução da microdureza. Concluiu-se que o cimento resinoso Panavia F apresentou os maiores valores de RU nos três terços radiculares e que os protocolos não influenciaram a RU dos espécimes cimentados com RelyX U200 / The present study aimed to evaluate, in vitro, the influence of different treatment protocols of weakened root dentin on the bond strength (BS) of glass fiber reinforced post luted with different resin cements. Forty two upper human canines were sectioned and the root length was standardized on 17-mm after coronary portion was removed. Biomechanical preparation was performed via Reciproc system with R 50.05 instrument and 2.5% NaOCl. The roots were flared using diamond bur #4137 and #720G at a depth of 12mm and filled by the lateral condensation technique with AH Plus sealer modified with 0.1% Rhodamine B. After 3 times the time required to the setting reaction of the sealer the filling was removed and the glass fiber post was relined with composite resin. The roots were divided into 3 groups (n = 14) according to the treatment of dentin surface: 2.5%NaOCl; 2.5%NaOCl + 17% EDTAand 2.5% NaOCl+ 17% EDTA+ ultrasound. Half of the samples of each group had the post luted with RelyX U200 and the other half with Panavia F. Both cements were added with 0.1% fluorescein. The roots were transversely sectioned obtaining two slices of each third, one for the push-out test and the other for the confocal analysis and measurement of knoop hardness. Data were submitted to ANOVA test with sub-divided portion followed by Tukey test (&alpha;= 0.05). The highest BS values were observed for 2.5% NaOCl + 17% EDTA and 2.5%NaOCl + 17% EDTA + ultrasound (p> 0.01) compared to 2.5%NaOClalone (p <0.0001). Panavia F showed higher BS than RelyX U200 in specimens treated with 2.5%NaOCl + 17% EDTA and 2.5% NaOCl + 17% EDTA + ultrasound (p <0.0001) in the three root thirds. There was no difference between the luting materials in specimens treated only with 2.5% NaOCl(p> 0.01). The protocols did not affect the BS of RelyX U200. Overall the higher incidence of failure was adhesive (38.83%) followed by mixed (34.72%) and cohesive (26.45%) failure. Dentin treatment with 2.5%NaOCl+ 17% EDTA + ultrasound promoted the greatest reduction in microhardness. It was concluded that the Panavia F presented the highest BS in the three root thirds and the protocols did not influence the BS of the specimens filled with RelyX U200

Avaliou-se a adaptação da obturação às paredes do canal, a penetrabilidade dos cimentos nos túbulos dentinários, a qualidade da obturação e a capacidade seladora utilizando-se quatro cimentos obturadores a base de resina epóxi (AH Plus, AcroSeal, AdSeal e Sealer 26), quando submetidos a agitação ultrassônica no momento da inserção do cimento. Foram utilizados 84 caninos humanos recém extraídos, unirradiculados e que foram divididos em dois grupos A e B (n=40), sendo que cada grupo foi dividido em quatro subgrupos de 10 dentes cada, conforme o cimento empregado: A1 e B1 - AH Plus, A2 e B2 Acroseal, A3 e B3 Adseal e A4 e B4 Sealer 26. O preparo biomecânico foi efetuado utilizando-se de instrumentação rotatória com sistema ProTaper, determinando um batente apical com o instrumento F5 (50.05) no comprimento real de trabalho. Foi realizada, em todos os dentes, a padronização do forame até o instrumento Protaper F3. Em seguida, os cimentos foram corados com a Rodamina B. Os canais foram então obturados por meio da técnica da condensação lateral, sendo os canais do grupo A previamente preenchidos pelos cimentos obturadores e submetidos à agitação ultrassônica enquanto que os do grupo B foram considerados como controle e não foram submetidos a agitação. Os dentes então foram submetidos ao teste de infiltração de fluídos após 7 e 30 dias de realizada a obturação. Após esse período, foram realizadas três secções transversais a 2, 4 e 6 mm do ápice e as imagens das secções foram obtidas em estereomicroscópio e microscopia a laser confocal. Para análise entre grupos, no período de 7 e 30 dias em relação ao teste de infiltração apical, foi selecionado o teste não-paramétrico de Kruskall-Wallis e Dunn (p<0.05). Para as demais análises, foi utilizado o teste não-paramétrico Mann Whitney e Wilcoxon. Os resultados indicaram que a agitação ultrassônica aumentou a infiltração apical de forma significante para o cimento AH Plus no período de 7 dias. No que diz respeito à penetração de cimento na dentina, houve um aumento significante para os cimentos AHPus, Acrosela e Sealer 26 no terço médio, e para o AH Plus e Sealer no terço cervical. Com relação às fendas, a agitação ultrassônica favoreceu menor presença desta para o AH Plus na porção apical, e para todos os cimentos na região média e cervical. Concluiu-se que a agitação ultrassônica não proporcionou melhorias no selamento apical e favoreceu maior penetração de cimento na dentina e menor presença de fendas na região média e cervical. / The aim of this study was to evaluate the adaptation of the filling of the canal walls, the penetration of cements in the dentinal tubules, the quality of the filling and sealing capacity utilizing four different epóxic based sealers (AH Plus, Acroseal, AdSeal and Sealer 26), when submitted to ultrasonic agitation at the time of the obturation. Eighty four extracted uniradicular human canines were utilized, and they were divided into two experimental groups A and B (n = 40), and each group was divided into four groups of 10 teeth each, in accordance with the cement used: A1 and B1 - AH Plus, A2 and B2 - Acroseal, A3 and B3-Adseal and A4 and B4 - Sealer 26. The biomechanical preparation was performed utilizing rotary instrumentation with theProTaper system, determining an apical stop with a F5 instrument (50.05) in the real working length. The standardization of the foramen was performed on all teeth until the Protaper F3 instrument. The cements were stained with Rhodamine B. Next the canals were filled by the lateral condensation technique. The canals of group A were previously filled by the sealers and submitted to ultrasonic agitation while those in Group B were considered as the controls and were not subjected to agitation. The teeth were then submitted to testing for leakage of fluids 7 and 30 days after the obturation. After this period, three transverse cross sections were performed at 2, 4 and 6 mm from the apex and the images of the sections were obtained in a stereomicroscope and confocal laser microscopy. For the analysis between the groups, in the period of 7 and 30 days, in relation to the apical leakage test, was selected the nonparametric Kruskal-Wallis and Dunn tests (p <0.05). For the other analyzes, the nonparametric Mann Whitney and Wilcoxon tests was used. The results indicated that the ultrasonic agitation significantly increased apical leakage for the AH Plus in the period of 7 days. With regard to the penetration of the cement into the dentin, there was a significant increase for the AHPus, Acroseal and Sealer 26 cements in the middle third, and the AH Plus and Sealer 26 in the cervical third when the ultrasonic agitation was performed. Regarding the cracks, the ultrasonic agitation favored a smaller presence for the AH Plus in the apical portion, and for all cements in the middle region and cervical. It was concluded that the ultrasonic agitation did not improve the apical seal and favored greater penetration of cement into the dentin and less presence of cracks in the middle and cervical region.

Neste trabalho foi avaliado microscopicamente a interface de adaptação entre diferentes cimentos obturadores resinosos e dentina no interior do canal radicular de pré-molares humanos, identificando microscopicamente o nível de adaptação. Foram selecionadas 60 raízes de dentes uniradiculados, raízes retilíneas, com anatomia circular ou ovalada, ápices completos, obtidos por meio de doação feita por Cirurgião Dentistas e, consentidos seu emprego em pesquisas pelo paciente. Posteriormente as raízes foram divididas randomicamente em três grupos de acordo com o sistema de obturação empregado: Grupo 1 Guta-percha + cimento AHPlus; Grupo 2 Real Seal; Grupo 3 Sistema obturador smart-seal. Em seguida cada espécime recebeu cortes transversais em diferentes níveis, com 2mm de espessura, com disco diamantado, em máquina de corte de tecido duro (Isomet®) sob abundante irrigação. Após a realização dos cortes, as fatias a 2mm, 4mm, 6mm e 8mm foram analisadas em esteriomicroscópio, observando-se a área de adaptação cimento-dentina e em microscópio confocal para analisar a penetração do cimento em túbulos dentinários e a presença de fendas. As imagens obtidas foram analisadas pelo software de medida de área Image J®, em que as imagens foram devidamente calibradas. Os resultados apontaram uma superioridade do sistema Smart-seal na área de cimento no corte de 6mm (p<0,05), contudo uma inferioridade no que se tratou da penetração do cimento em túbulos dentinários nos cortes de 2mm, 6mm e 8mm (p<0,05). Em relação as fendas o smart-seal apresentou uma menor quantidade de fendas (p<0,05) apenas na medida de 8mm. Concluiu-se que apesar de sofrer expansão na tomada de presa, e melhor adaptação nas paredes do canal o sistema Smart Seal não apresentou penetrabilidade tubular satisfatória. / This study evaluated microscopically the interface adaptation between sealer and dentin within the root canal, identifying the level of sealing provided by different resin filling materials. 60 single rooted teeth were selected, roots straight with circular or oval anatomy, complete apexes, obtained through donation made by Surgeon Dentists and consented to its use in research by the patient. Subsequently the roots were randomly divided into three groups according to the system obturation: group 1 - Gutta-percha + cement AHPlus, Group 2 - Epiphany + Resilon, Group 3 - Smart Seal obturation system. Then each specimen received a transverse cut with 2 mm thick, with a diamond disc, cutting machine for hard tissue (Isomet ®) under abundant irrigation. After the cuts, slices to 2mm, 4mm, 6mm and 8mm were analyzed by esteriomicroscopy, observing the adaptation area between dentin and sealer, confocal microscopy was utilized to examine the penetration of cement into the dentinal tubules and the presence of gaps. The images were analyzed by software measurement area Image J ®, where the images have been properly calibrated. The results showed a superiority of Smart-seal in the area of cement in cutting 6mm (p <0.05), however inferiority in the penetration of the sealer into the dentinal tubules in sections of 2mm, 6mm and 8mm (p <0.05). Regarding the cracks Smart Seal had a smaller amount of cracks (p <0.05) only the extent of 8mm. It was concluded that although the Smart Seal system presentes expansion and better fit into the dentin walls of the canal, the system showed no satisfactory tubular penetration.

Todos os seres vivos compartilham uma característica comum na sua composição estrutural, a célula. No corpo humano, as células vasculares de músculo liso são fundamentais para o bom funcionamento dos vasos arteriais. A principal função dessas células é contrair e regular o calibre desses vasos, a pressão sanguínea e a distribuição do fluxo de sangue. Devido a isto, alterações mecânicas sofridas por estas células acarretam modificações estruturais nos vasos, podendo levar à hipertensão, vasoespasmo e arteriosclerose. O principal objetivo do nosso trabalho foi o de desenvolver uma nova plataforma de análise de imagens de células vasculares para caracterizar suas propriedades estruturais. Em nossa plataforma, analisamos parâmetros estruturais de células vasculares de músculo liso de diferentes leitos arteriais, com as fibras de actina evidenciadas com marcadores fluorescentes, obtidas por microscopia confocal. Estes parâmetros são: o Índice de Alinhamento das fibras de actina da imagem, a distribuição de comprimento dessas fibras e sua dimensão fractal. Mostramos que com esses parâmetros somos capazes de comparar células de leitos arteriais diferentes de forma quantitativa, assim como, correlacionar esses parâmetros com suas propriedades mecânicas. / All living organisms share a unique characteristic in their structural composition, the cell. In the human body, vascular smooth muscle cells are fundamental for the ideal functioning of the arterial vessels. The main function of these cells is to contract and regulate these vessels caliber, as well as the blood pressure and flow distribution of blood. Due to the exposed above, mechanical alterations suffered by these cells cause structural modifications in vessels, which may lead to hypertension, vasospasm and atherosclerosis. The main objective of our research was to develop a new framework of image analysis for vessel cells in order to characterize their structural properties. In our framework we analyzed structural parameters of vascular smooth muscle cells from different arterial sites, with actin fibers labeled with fluorescent markers, obtained by confocal microscopy. These parameters are: the actin fibers alignment index of the image, the length distribution of these fibers and their fractal dimension. We presented that with these parameters we are able to quantitatively compare cells in different arterial sites as well as correlate these parameters with their mechanical properties.

Imagens multiespectrais são utilizadas em diferentes aplicações, que vão desde sensoriamento remoto a processos médicos. No caso de imagens multiespectrais oriundas de microscopia confocal de varredura à laser (Confocal Laser Scanning Microscopy-CLSM), a extração da informação se inicia pela conversão das assinaturas espectrais, em uma imagem RGB. Esta imagem é a referência para a seleção da região de interesse, da qual se obtém a assinatura espectral média, originada do arquivo multiespectral (LSM). Mesmo utilizando um padrão muito bem estabelecido de conversão, alguns pontos devem ser considerados: i) o processo de conversão reduz a informação, a uma ordem de 10-145%; ii) a cor é uma experiência sensorial, subjetiva e pessoal, interferindo na seleção da região de interesse e; iii) a assinatura é obtida pela média espectral, da região de interesse, selecionada manualmente.Assim, esta tese de doutorado propõem um método de mapeamento e visualização das informações de imagens multiespectrais, combinando um algoritmo de agrupamento não supervisionado(kmeans) e um algoritmo que define uma paleta de cores coerentes com a informação espectral das regiões mapeadas. Aplicou-se o método em três casos de estudos de tecidos vegetais: i) no pré-tratamento de paredes celulares da cana-de-açúcar; ii) na plasticidade foliar do Jacaranda caroba e; iii) no uso de assinaturas espectrais na classificação de plantas do Cerrado. Os resultados demonstraram que o método é bastante robusto, permitindo de forma inovadora a: visualização, análise e comparação de imagens multiespectrais qualitativa e quantitativamente, e que seu uso é viável em qualquer área de pesquisa que utilize imagens multiespectrais. / Multispectral images are used in different applications, ranging from remote sensing images to medical images. In the case of multispectral images derived from confocal laser scanning microscopy (CLSM), the extraction of information begins with the conversion of spectral signatures in an RGB image. This is the reference for selecting the region of interest, from which it gets the average spectral signature, originated from multispectral file (LSM). Even using a very well established pattern of conversion, some points should be considered: i) the conversion process reduces the information on the order of 10-145%; ii) the color is a sensory experience, subjective and personal, interfering in the selection of the interest region and; the signature is obtained by the spectral average, from interest region which is selected manually. Thus, this doctoral thesis proposes a method of mapping and visualization of multispectral imaging information, combining an unsupervised clustering algorithm (kmeans) and an algorithm that defines a consistent color palette with the spectral information of mapped regions. The proposed method was applied in three cases plant tissue studies: i) in the pre-treating the cell walls of sugarcane; ii) in the leaf plasticity of Jacaranda caroba; iii) in the use of spectral signatures in the Cerrado plant classification. The results showed that the proposed method is quite robust. It presents innovation to the visualization and analysis of multispectral images and makes possible a qualitative and quantitative comparison of a group of multispectral images. Besides that, its use is feasible in any area of research, which are using multispectral images.

Todos os seres vivos compartilham uma característica comum na sua composição estrutural, a célula. No corpo humano, as células vasculares de músculo liso são fundamentais para o bom funcionamento dos vasos arteriais. A principal função dessas células é contrair e regular o calibre desses vasos, a pressão sanguínea e a distribuição do fluxo de sangue. Devido a isto, alterações mecânicas sofridas por estas células acarretam modificações estruturais nos vasos, podendo levar à hipertensão, vasoespasmo e arteriosclerose. O principal objetivo do nosso trabalho foi o de desenvolver uma nova plataforma de análise de imagens de células vasculares para caracterizar suas propriedades estruturais. Em nossa plataforma, analisamos parâmetros estruturais de células vasculares de músculo liso de diferentes leitos arteriais, com as fibras de actina evidenciadas com marcadores fluorescentes, obtidas por microscopia confocal. Estes parâmetros são: o Índice de Alinhamento das fibras de actina da imagem, a distribuição de comprimento dessas fibras e sua dimensão fractal. Mostramos que com esses parâmetros somos capazes de comparar células de leitos arteriais diferentes de forma quantitativa, assim como, correlacionar esses parâmetros com suas propriedades mecânicas. / All living organisms share a unique characteristic in their structural composition, the cell. In the human body, vascular smooth muscle cells are fundamental for the ideal functioning of the arterial vessels. The main function of these cells is to contract and regulate these vessels caliber, as well as the blood pressure and flow distribution of blood. Due to the exposed above, mechanical alterations suffered by these cells cause structural modifications in vessels, which may lead to hypertension, vasospasm and atherosclerosis. The main objective of our research was to develop a new framework of image analysis for vessel cells in order to characterize their structural properties. In our framework we analyzed structural parameters of vascular smooth muscle cells from different arterial sites, with actin fibers labeled with fluorescent markers, obtained by confocal microscopy. These parameters are: the actin fibers alignment index of the image, the length distribution of these fibers and their fractal dimension. We presented that with these parameters we are able to quantitatively compare cells in different arterial sites as well as correlate these parameters with their mechanical properties.

<p>Confocal microscopy has been used as a tool for studying adsorption of biomolecules to individual chromatographic adsorbent particles. By coupling a fluorescent dye to protein molecules, their penetration into single adsorbent particles could be observed visually at different times during batch uptake. By relating the relative fluorescence intensity obtained at different times to the value at equilibrium, the degree of saturation versus time could be constructed. The use of two different fluorescent dyes for protein labeling and two independent detectors, allowed direct observation of a two-component adsorption process. The confocal technique was also applied for visualization of nucleic acids. Plasmid DNA and RNA were visualized with fluorescent probes that binds to double stranded DNA and RNA respectively. Confocal measurements following single component adsorption to ion exchange particles, revealed an interesting phenomenon. Under certain experimental conditions, development of "inner radial concentration rings" (i.e. adsorbed phase concentrations that are higher at certain radial positions within the particle) were observed. Some examples are given that show how such concentration rings are formed within a particle.</p><p>Methods were also developed for measurement of the spatial distribution of immobilized functional groups. Confocal microscopy was used to investigate the immobilization of trypsin on porous glycidyl methacrylate beads. Artefacts relating to optical length differences could be reduced by use of "contrast matching". Confocal microscopy and confocal micro-Raman spectroscopy, were used to analyze the spatial distribution of IgG antibodies immobilized on BrCN-activated agarose beads. Both these measurement methods indicate an even ligand distribution. Finally, confocal Raman and fluorescence spectroscopy was applied for measurement of the spatial distribution of iminodiacetic- and sulphopropyl groups, using Nd3+ ions as fluorescent probes. Comparison of different microscope objectives showed that an immersion objective should be used for measurement of wet adsorbent particles.</p><p><i>Direct experimental information from the interior of individual adsorbent particles will increase the scientific understanding of intraparticle mass transport and adsorption mechanisms, and is an essential step towards the ultimate understanding of the behaviour of chromatographic adsorbents.</i></p>

Confocal microscopy has been used as a tool for studying adsorption of biomolecules to individual chromatographic adsorbent particles. By coupling a fluorescent dye to protein molecules, their penetration into single adsorbent particles could be observed visually at different times during batch uptake. By relating the relative fluorescence intensity obtained at different times to the value at equilibrium, the degree of saturation versus time could be constructed. The use of two different fluorescent dyes for protein labeling and two independent detectors, allowed direct observation of a two-component adsorption process. The confocal technique was also applied for visualization of nucleic acids. Plasmid DNA and RNA were visualized with fluorescent probes that binds to double stranded DNA and RNA respectively. Confocal measurements following single component adsorption to ion exchange particles, revealed an interesting phenomenon. Under certain experimental conditions, development of "inner radial concentration rings" (i.e. adsorbed phase concentrations that are higher at certain radial positions within the particle) were observed. Some examples are given that show how such concentration rings are formed within a particle. Methods were also developed for measurement of the spatial distribution of immobilized functional groups. Confocal microscopy was used to investigate the immobilization of trypsin on porous glycidyl methacrylate beads. Artefacts relating to optical length differences could be reduced by use of "contrast matching". Confocal microscopy and confocal micro-Raman spectroscopy, were used to analyze the spatial distribution of IgG antibodies immobilized on BrCN-activated agarose beads. Both these measurement methods indicate an even ligand distribution. Finally, confocal Raman and fluorescence spectroscopy was applied for measurement of the spatial distribution of iminodiacetic- and sulphopropyl groups, using Nd3+ ions as fluorescent probes. Comparison of different microscope objectives showed that an immersion objective should be used for measurement of wet adsorbent particles. Direct experimental information from the interior of individual adsorbent particles will increase the scientific understanding of intraparticle mass transport and adsorption mechanisms, and is an essential step towards the ultimate understanding of the behaviour of chromatographic adsorbents.

In this thesis the effects of single photon and multi-photon excitation on protoplasts from Arabidopsis thaliana are compared. Time-lapsed micro-spectroscopy at high spatial resolution is employed to study the response of chloroplasts within the protoplasts from Arabidopsis thaliana. We have found that the fluorescence spectra of chloroplasts exhibits dramatic changes and the protoplasts are rapidly damaged under multi-photon excitation as a result of pulsed laser illumination. In contrast, single photon excitation of chloroplasts with cw laser is relatively inert to the vitality of the protoplasts. In addition to, we have built an ultrafast laser excited cryogenic micro-spectroscopy setup to study the photoluminescence of PPV thin film. We found that the spectrum of PPV¡¦s photoluminescence should shift toward longer wavelength and the non-radiative transition should be suppressed as a result of longer electron coherence length at low temperature.