Adenoviruses are non-enveloped, dsDNA tumor viruses responsible for a breadth of pathogenesis including acute respiratory disease and viral myocarditis. Gap junctions, which are formed by connexin proteins, directly couple the cytoplasms of apposed cells enabling immunological, metabolic, and electrical intercellular communication. The gap junction protein connexin43 (Cx43; gene name – GJA1) is the most widely expressed human connexin protein and is the predominant connexin in the working myocardium. Given the immunological role for Cx43 gap junctions, we hypothesized that gap junctions would be targeted during adenoviral infection. We find reduced Cx43 protein due to suppression of GJA1 transcription dependent upon β-catenin during adenoviral infection, with viral protein E4orf1 sufficient to induce β-catenin phosphorylation. Loss of gap junction function occurs prior to reduced Cx43 protein levels with Ad5 infection rapidly inducing Cx43 phosphorylation at residues previously demonstrated to alter gap junction conductance. Direct Cx43 interaction with ZO-1 plays a critical role in gap junction regulation. We find loss of Cx43/ZO-1 complexing during Ad5 infection by co-immunoprecipitation, with complementary studies in human induced pluripotent stem cell derived-cardiomyocytes revealing Cx43 gap junction remodeling concomitant with reduced ZO-1 complexing. These findings demonstrate specific targeting of gap junction function by Ad5 leading to disruptions in intercellular communication which would contribute to dangerous pathological states including arrhythmias in infected hearts. Intercellular junction proteins belonging to classically defined unique junctions exhibit extensive cross-talk and interdependency for expression and localization. We find reduced connexin43 (Cx43) phosphorylation at a known internalization motif, leading us to hypothesize that gap junctions are maintained during adenoviral infection in order to stabilize intercellular junctions and adenoviral receptors therein. Utilizing immunofluorescence confocal microscopy, we demonstrate that Cx43 reductions are primarily cytosolic with Cx43 preservation at the plasma membrane. Click-IT chemistry, a non-radioactive pulse-chase technique, reveals that Cx43 ½ life is extended during adenoviral infection. In order to test if remaining Cx43 exists in de facto gap junctions (i.e. not undocked or cytosolic connexons) we utilized 1 % Triton X-100 solubility fractionation and find Cx43 is indeed primarily junctional during adenoviral infection. Having demonstrated increases in junctional Cx43, we next asked how tightly coupled cells were during adenoviral infection and by ECIS measurements of electrical resistance we demonstrate a transient increase in mechanical coupling during infection. Our future aims are to uncover changes in Coxsackievirus and adenovirus receptor (CAR) protein localization to determine if adenoviral-induced changes to subcellular architecture predisposes neighboring cells to infection and enhances viral spread. These findings will add to the existing model of adenoviral infection and more broadly, contribute to the therapeutic design of adenoviral vectors for cancer and gene therapy. / Doctor of Philosophy / The human heart will beat more than 3 billion times during the average lifetime. This is accomplished by billions of individual heart muscle cells, called cardiomyocytes, contracting in synchrony. Cardiomyocytes require direct cell to cell communication in order to receive the proper cues and work in concert. Outside of the heart, including the lining of the lungs which acts as a first line of defense against invading pathogens, direct cell to cell communication is important for mounting proper immune responses. A primary means by which cells communicate directly with neighboring cells is through gap junctions which are formed of proteins called connexins. Six connexin proteins form a channel in the cell surface that binds to a similar channel on an apposing cell to create a continuous gap junction channel, coupling the cell interiors directly. The most widely expressed human connexin, and the most abundant connexin in the heart, is connexin43 (Cx43; gene name – GJA1). Adenoviruses are pathogens commonly associated with respiratory illnesses in addition to more serious diseases including viral myocarditis, or infection of the heart. Given that Cx43 gap junctions enable direct intercellular communication important in initiating immune responses, we hypothesized that adenovirus would target Cx43 and gap junctions during infection. We find reduced Cx43 protein in cells infected with human adenovirus, and revel that the expression of the GJA1 gene is suppressed. We next focused on potential signaling pathways that are changed during adenoviral infection. β-catenin is a factor with several cellular roles including regulating expression of specific genes including GJA1 (Cx43). We demonstrate β-catenin is activated during adenoviral infection and that this is necessary for reducing Cx43 transcripts. A pathway that activates β-catenin in this manner is the PI3K/Akt signaling axis, which has previously been shown to be turned on during adenovirus infection by a viral protein called E4orf1. We find the adenoviral protein E4orf1 is sufficient to induce β-catenin activation revealing a potential therapeutic target for future studies. We next determined that direct cell to cell communication through gap junctions is reduced before loss of the gap junction protein Cx43 during infection. Gap junctions are modified by the cell to change their ability to couple cells independently of protein levels alone and we find gap junction modifications consistent with altered communication ability. Furthermore, the gap junction protein Cx43 interacts with the cellular skeleton protein Zonula Occludens-1 (ZO-1) during movement into and out of gap junction clusters. We determined alterations in Cx43/ZO-1 interactions consistent with gap junction remodeling. In complimentary studies we find the same gap junction remodeling in cardiomyocytes revealing arrhythmogenic potential during acute adenoviral infection in human heart cells. Localized with gap junctions are several other junction proteins including the Coxsackievirus and adenovirus receptor (CAR) which is critical in cardiac development and also the primary receptor for species C adenoviruses (used in our studies). CAR expression has been demonstrated to alter Cx43 levels and indeed, many junctional proteins influence the expression and/or localization of other junctional proteins. Interestingly, despite reduced Cx43 levels and reduced gap junction function (cell to cell communication), we detected decreases in a gap junction modification that is associated with gap junction degradation, suggesting that new gap junction protein Cx43 is not being made but already synthesized Cx43 is degraded more slowly. We hypothesized Cx43 is maintained during adenoviral infection in order to recruit other junctional components, principally CAR, on uninfected neighbor cells to predispose them to infection. We observed using microscopy that Cx43 reductions are primarily inside the cell but Cx43 is preserved on the cell surface and at junctions between cells. We next asked if the protein is being degraded more slowly and find Cx43 exists for longer in infected cells signifying that it is being degraded more slowly. Utilizing a fractionation technique to separate gap junction connexin from connexon that is non-junctional or inside the cell, we detect an increase in junctional Cx43, revealing maintenance of Cx43 gap junction structures. Having now identified adenoviral-mediated maintenance of Cx43 gap junction structures, we next wanted to test for changing in mechanical coupling (i.e. how tightly are the cells connected to one another) where we demonstrate an increase in mechanical coupling during adenoviral infection. Our future directions are to determine if this increase in Cx43 gap junction maintenance and mechanical coupling is concomitant with changes in CAR expression/localization on uninfected neighboring cells and if altered, does this predispose uninfected neighbors of infected cells to infection.

No description available.

Die vorgelegte Dissertationsschrift dient der Identifizierung des Mechanismus, über welchen neonatale Kardiomyozyten der Ratte biaxialen zyklischen Stretch wahrnehmen. Angriffspunkt dafür bildeten sowohl Stretch Activated Ion Channels (SAIC) als auch die mit Integrinen assoziierte Focal Adhesion Kinase (FAK). Die Inhibition der SAIC erfolgte mit Gadolinium und eine Blockade der FAK konnte durch den FAK-Inhibitor II erreicht werden. Eigens angelegte Zellkulturen wurden unter definierten Parametern für 24 Stunden unter Einwirkung genannter Stoffe gestretcht und anschließend einer Analyse mittels Immunfluoreszenz und Western Blot unterzogen. Gestretchte Kardiomyozyten richteten sich schräg zur Achse der einwirkenden Kraft aus und wiesen eine Polarisierung von Connexin 43 auf, außerdem zeigte sich dessen gesteigerte Expression. Durch die Blockade der FAK konnte lediglich eine aufgehobene Polarisierung von Connexin 43 bei unveränderter Expression und Ausrichtung der Kardiomyozyten festgestellt werden. Auch die Mikrotubuli veränderten nach Stretch ihre Orientierung bezogen auf die Zellachse. Die zunächst annähernde Parallelität der Fasern zeigte sich nach Inhibition der FAK deutlich aufgelockert. Für die Aktinfilamente konnte dies nicht nachgewiesen werden. Die Integrine dienen demnach der Wahrnehmung von Stretch und vermitteln die Polarisierung von Connexin 43 sowie die Orientierung der Mikrotubuli über die FAK. Für die anderen genannten Prozesse ist die Aktivierung eines FAK-unabhängigen Integrin-Signalweges denkbar. Gadolinium hatte insgesamt keinen Effekt auf beschriebene Veränderungen, sodass ein Einfluss der SAIC auf Stretch-induzierte Veränderungen in Kardiomyozyten ausgeschlossen werden konnte. Gleichzeitig konnte durch die Beobachtung der Polarisierung von Microtubule Organizing Center, Kinesin und Golgi-Apparat die Hypothese der sich durch Stretch orientierenden neonatalen Kardiomyozyte unterstützt werden, welche die Voraussetzung für die Anordnung von Connexin 43 an den Zellpolen darstellen könnte. Sowohl die Selbstorganisation des Myokards im Rahmen der Embryogenese als auch die Pathophysiologie verschiedener kardialer Erkrankungen könnte dadurch womöglich besser verstanden werden.

Hintergrund: Connexine (Cx) spielen eine wichtige Rolle bei Wachstum und Differenzierung. Die Angiogenese ist an vielen physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt. Jedoch ist noch unklar, ob Connexine einen Einfluss auf die Angiogenese haben. Fragestellung; In dieser Arbeit sollte die Rolle endothelialer Connexine an der Angiogenese untersucht werden. Methoden: Venöse Zellen der menschlichen Nabelschnur (HUVEC) wurden kultiviert bis sie subkonfluent waren. Vor der 3D Kultur im Matrigel wurden die Zellen entweder mit Nicotin, dem Gap Junction Inhibitor Palmitoleinsäure (PA), einem siRNA-Knockdown von entweder Cx37, Cx40 oder Cx43 oder mit Isoprenalin behandelt. Die Zellen wurden dann auf ein in vitro Angiogenese-Assay (3D-Kultur, Matrigel) gegeben und nach 18h wurden unterschiedliche Angiogeneseparameter erhoben, um die Komplexität der Angiogenese zu beurteilen. Änderungen der Expression der Cx mRNA- und Proteinexpression sowie der Kommunikation über Gap Junctions wurden mittels PCR, Immunfluoreszenzmikroskopie, Western Blot und Lucifer Yellow Dye Transfer untersucht. Bei Gewebeproben der A. mammaria von Rauchern und Nichtrauchern wurden mittels Immunofluoreszenzmikroskopie die Expression der Cx beurteilt. Ergebnisse: Die Behandlung mit spezifischer siRNA führte zu einer signifikanten Abnahme der Expression des jeweiligen Connexins in den HUVECs. Sowohl der Knockdown als auch die Behandlung mit PA verringerte die Kommunikation über Gap Junctions signifikant und reduzierte die Anzahl der Abzweigungen im Angiogenese-Assay. Der Knockdown des Cx43 und Cx40 sowie die Behandlung mit PA reduzierten ebenfalls die Komplexität des Musters im Matrigel-Assay. Nicotin führte zu einer Reduktion der Cx43- und Cx37-Proteinexpression, wohingegen Cx40 durch transskriptionelle Gegenregulation konstant gehalten wurde, sowie zu einer Abnahme der Länge der Kapillar-ähnlichen-Strukturen, der Anzahl der Abzweigungen und des Musters im Matrigelassay, während die Anzahl der Zellen zunahm. Die mRNA-Expression der Connexine war hingegen erhöht. In Gewebeproben von Rauchern konnte analog eine verminderte Expression von Cx43 und Cx37, aber nicht von Cx40, in der Intima gezeigt werden. Isoprenalin erhöhte die Proteinexpression der endothelialen Connexine und verbesserte sowohl die interzelluläre Kommunikation als auch das Muster im Matrigel-Assay. Ebenso waren die Kapillar-ähnlichen Strukturen im Vergleich zur Kontrolle länger. Schlussfolgerung: Aus den erhobenen Ergebnissen lässt sich der Schluss ziehen, dass Connexine bei der Angiogenese involviert sind, vor allem beim Vorgang der Verzweigung. Dies kann teilweise die Veränderung erklären, die eine Nicotinbehandlung auf die Angiogenese hat.

In der vorliegenden Arbeit wurden Myokardproben des rechtsventrikulären Ausflusstraktes von Patienten mit Fallot’scher Tetralogie sowie Double Outlet Right Ventricle vom Fallot - Typ untersucht. Hintergrund der Studie waren Untersuchungen anderer Autoren an Cx43 - knock - out Mäusen, die dort Veränderungen des kardialen Phänotyps beschrieben, die sie als Fallot - artig interpretierten. Daraus wurde die Hypothese entwickelt, dass Änderungen auf der Ebene des Connexin 43 ursächlich mit der Fallot’schen Tetralogie verbunden sein könnten. Es erfolgte eine histologische Analyse von 25 Patientenproben im Hinblick auf die Lokalisation von Connexin 43 sowie N - Cadherin. Es zeigte sich eine altersabhängige Verteilung von Connexin 43 und N - Cadherin. Insbesondere Patienten der Gruppe 1 (jünger als zwei Jahre) zeigten eine Verteilung sowohl an der lateralen Zellseite, als auch am Pol der Kardiomyozyten. Mit zunehmendem Alter beschränkten sich sowohl Connexin 43 als auch N - Cadherin auf die Disci intercalares zwischen den Kardiomyozyten und befanden sich dort in enger Nachbarschaft zueinander. Des Weiteren erfolgte eine Analyse der codierenden Region des Connexin 43 Gens mittels High Resolution Melting - PCR und sich daran anschließender Sequenzierung. Es zeigten sich sowohl bei den Kontrollen als auch den Patienten bereits bekannte Single Nucleotide Polymorphismen sowie bis dato unbekannte Sequenzvariationen. Allerdings wurden keine homozygoten Veränderungen der DNA festgestellt. Auch fand sich keine der heterozygoten Veränderungen in allen untersuchten Patienten. Somit ist es unwahrscheinlich, dass ein einzelner Basenaustausch zum komplexen Krankheitsbild der Fallot’schen Tetralogie beziehungsweise zum Double Outlet Right Ventricle vom Fallot - Typ führt.

Gap Junctions als wichtigste Elemente der Zelle zur Ermöglichung einer interzellulären Kommunikation erlauben eine koordinierte Antwort auf externe und interne Stimuli und somit ein Zusammenspiel von Zellgruppen und Organen im Gesamtorganismus. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss einer mittelfristigen und chronischen Stimulation neonataler Rattenkardiomyozyten durch Insulin und den Wachstumsfaktoren Insulin-like Growth Factor-1 (IGF-1), Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), Transforming Growth Factor-β (TGF-β) und Fibroblast Growth Factor-2 (FGF-2) auf die Expression der Connexine 40, 43 und 45 untersucht. Dabei zeigte sich unter der Insulin-Stimulation eine konzentrationsabhängige Regulation der Connexin 43 (Cx43) Expression. Die Exposition gegenüber IGF-1 hatte einen signifikanten Anstieg der Cx43 Proteinmenge zur Folge. Unter 24stündiger VEGF- oder FGF-2-Stimulation fand sich dagegen diesbezüglich kein relevanter Unterschied. Die Analysen nach langfristiger Exposition gegebenüber TGF-β zeigten eine signifikante Abnahme der Cx43 Proteinmenge bei unveränderter Cx43 mRNA. Zur Erfassung mittelfristiger Veränderungen wurden die Kardiomyozyten jeweils 3 Stunden mit den Wachstumsfaktoren VEGF und TGF-β inkubiert. Dabei zeigte sich jeweils eine signifikante Zunahme der Cx43 Proteinmenge und –mRNA. Die Connexine 40 und 45 waren in den ventrikulären Kardiomyozyten nur spärlich nachweisbar und durch keinen der untersuchten Faktoren signifikant induzierbar.

No description available.

Gap junctions are intercellular channels that permit passage of electrical and chemical signals between neighbouring cells. Vascular endothelium typically co-expresses Cx37 and Cx40, but may downregulate its expression of Cx37 (and upregulate Cx43) in response to changes in flow. The specific regulatory roles mediated by vascular endothelial connexins, and the consequences of altered connexin expression, remain unclear. In this study, we hypothesized that Cx37 and Cx40 regulate distinct vascular responses. We further hypothesize that Cx37 is predominantly involved in vascular growth control, whereas vascular growth is not affected by ablation of Cx40 expression. We show herein that Cx37, but not Cx40 or Cx43, suppresses growth of a highly-proliferative cancer cell line by inducing G1 cell cycle accumulation. We further show that Cx37-deficient mice, lacking Cx37's putative growth inhibitory effect on the vasculature, exhibit a more extensive native and post-ischemic collateral circulation, and greater ischemia-induced microvascular density. In addition, Cx37-/- mice demonstrate a functional improvement in recovery over wild-type animals in two models of hindlimb ischemia. By contrast, Cx40-/- mice fail to recover distal limb flow following unilateral hindlimb ischemia, resulting in necrosis. Long-term angiotensin II antagonism normalized post-ischemic hindlimb bloodflow, reduced macrophage infiltration, and delayed (but did not reverse) the necrotic phenotype of these animals. In summary, we show a distinct role for each of the endothelial connexins, Cx37 and Cx40, in regulating post-ischemic vascular responses.

Venous valves (VVs) are critical for unidirectional blood flow from superficial and deep veins towards the heart. Congenital valve aplasia or agenesis may, in some cases, be a direct cause of vascular disease, motivating an understanding of the molecular mechanisms underlying the development and maintenance of VVs. Three gap junction proteins (Connexins), Cx37, Cx43, and Cx47, are specifically expressed at VVs in a highly polarized fashion. VVs are absent from adult mice lacking Cx37; however it is not known if Cx37 is required for the initial formation of valves. In addition, the requirement of Cx43 and Cx47 for VV development has not been studied. Here, we provide a detailed description of Cx37, Cx43, and Cx47 expression during mouse vein development and show by gene knockout that each Cx is necessary for normal valve development. The valve phenotypes in the knockout lines exhibit Cx-specific differences, however, including whether peripheral or central VVs are affected by gene inactivation. In addition, we show that a Cx47 null mutation impairs peripheral VV development but does not affect lymphatic valve formation, a finding of significance for understanding how some CX47 mutations cause inherited lymphedema in humans. Finally, we demonstrate a striking segregation of Foxc2 and NFATc1 transcription factor expression between the downstream and upstream faces, respectively, of developing VV leaflets and show that this segregation is closely associated with the highly polarized expression of Cx37, Cx43, and Cx47. The partition of Foxc2 and NFATc1 expression at VV leaflets makes it unlikely that these factors directly cooperate during the leaflet elongation stage of VV development. (C) 2016 Elsevier Inc. All rights reserved.

Lymphatic valves (LVs) are cusped luminal structures that permit the movement of lymph in only one direction and are therefore critical for proper lymphatic vessel function. Congenital valve aplasia or agenesis can, in some cases, be a direct cause of lymphatic disease. Knowledge about the molecular mechanisms operating during the development and maintenance of LVs may thus aid in the establishment of novel therapeutic approaches to treat lymphatic disorders. In this study, we examined the role of Connexin43 (Cx43), a gap junction protein expressed in lymphatic endothelial cells (LECs), during valve development. Mouse embryos with a null mutation in Cx43 (Gja1) were previously shown to completely lack mesenteric LVs at embryonic day 18. However, interpreting the phenotype of Cx43(-/-) mice was complicated by the fact that global deletion of Cx43 causes perinatal death due to heart defects during embryogenesis. We have now generated a mouse model (Cx43(∆LEC)) with a lymphatic-specific ablation of Cx43 and show that the absence of Cx43 in LECs causes a delay (rather than a complete block) in LV initiation, an increase in immature valves with incomplete leaflet elongation, a reduction in the total number of valves, and altered lymphatic capillary patterning. The physiological consequences of these lymphatic changes were leaky valves, insufficient lymph transport and reflux, and a high incidence of lethal chylothorax. These results demonstrate that the expression of Cx43 is specifically required in LECs for normal development of LVs.