At the author’s request, the abstract has been removed due to the confidential nature of the thesis. It will be added once the embargo period has passed.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Glioblastoma is a lethal cancer that arises from support cells in the nervous system and kills around 20,000 people in the United States each year. While much is known about the highly malignant primary glioblastoma, the natural history of lower grade glioma (LGG) is less understood. While the majority of LGGs are initiated by a mutation in isocitrate dehydrogenase, the events leading to their malignant progression into a grade IV tumor are not known. Analysis of primary tumor sample data has revealed that low transcript levels of Angiomotin-like-1 (AmotL1) strongly associate with poor outcomes of patients with these cancers. Follow-up RNA-sequencing of human embryonic astrocytes with AmotL1 silencing revealed the downregulation of many transcripts that encode proteins mediating gap junctions (GJ) between astrocytes, especially connexin-43 (Cx43). Cx43 protein oligomerizes to form functional channels comprising the astrocytic GJ. AmotL1 knockdown through RNA interference decreases Cx43 transcript and protein levels while increasing its distribution to GJs. This suggests increased GJ formation and intercellular communication, as similar localization patterns are observed in differentiated astrocytes. Astrocytes with AmotL1 knockdown also display a pronounced pancake-like morphology, suggesting that the actin cytoskeleton is affected. Imaging reveals that cells with reduced AmotL1 have characteristic losses in both stress fibers and focal actin under the cell body but notable increases in cortical F-actin. Consistent with previous studies, AmotL1 may promote increases in the number and thickness of F-actin fibers. Because actin binding to related angiomotins is inhibited by phosphorylation from the LATs kinases, I define the effects of expressing wildtype AmotL1 versus mutants that mimic or prevent phosphorylation by LATs1/2. Interestingly, expression of AmotL1 S262D in combination with NEDD4-1, a ubiquitin ligase, results in a profound loss of actin stress fibers. Dependence on NEDD4-1 suggests that this phenotype is due to the induced degradation of proteins that promote F-actin, e.g. RhoA. These results directly support a model in which phosphorylated AmotL1 specifically inhibits F-actin formation as opposed to unphosphorylated AmotL1 which is known to promote stress fiber formation. Thus, in addition to regulating polarity and YAP/TAZ transcriptional co-activators, AmotL1 plays major functions in dictating cellular F-actin dynamics. / 2021-01-01

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The purpose of this thesis project was to examine the function of connexin-36 (Cx36) gap junctions (GJs) in producing alcohol's intoxicating and rewarding effects. GABA neurons are thought to inhibit dopamine (DA) neurotransmission in the mesocorticolimbic system, which originates in the midbrain ventral tegmental area (VTA) and projects to limbic structures such as the nucleus accumbens (NAcc). The mesolimbic DA system is believed to be the neural substrate of alcohol intoxication and addiction (Tepper, Paladini, & Celada, 1998). Alcohol suppresses the firing rate of GABA neurons in the VTA (Gallegos, Criado, Lee, Henriksen, & Steffensen, 1999) and presumably disinhibits DA neurons thereby resulting in enhanced release of DA in the NAcc. Interestingly, VTA GABA neurons appear to form part of a larger syncytium of GABA neurons in the reticular formation that are linked by electrical synapses via Cx36 GJs (Allison, et al., 2006; Stobbs, et al., 2004; Lassen, et al., 2007). Gap junction blockers, including the Cx36-selective antagonist mefloquine, also suppress the excitability and electrical coupling of VTA GABA neurons (Stobbs, et al., 2004). Thus, I hypothesized that Cx36 GJs cause synchrony in VTA GABA neurons which alcohol blocks to cause intoxication and reward. To accomplish these studies I compared the effects of intoxicating doses of ethanol in Cx36 knockout (KO) mice and mefloquine-treated mice and their wild-type (WT) controls with two tests that index ataxia, an open field activity system and the fixed-speed rotarod apparatus, as well as with ethanol self-administration. I found that Cx36 KO and mefloquine-treated mice exhibit significantly more ethanol-induced loss of movement in the open field test, a paradigm which indexes gross motor activity and tremor, but less ataxia than their WT controls in the rotarod paradigm, a paradigm which indexes balance and coordination. Most importantly, both Cx36 KO and mefloquine-treated mice consumed less ethanol than their controls. These findings provide evidence in support of the hypothesis that Cx36 GJs are important targets for ethanol effects in the mesolimbic system.

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Hintergrund: Connexine (Cx) spielen eine wichtige Rolle bei Wachstum und Differenzierung. Die Angiogenese ist an vielen physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt. Jedoch ist noch unklar, ob Connexine einen Einfluss auf die Angiogenese haben. Fragestellung; In dieser Arbeit sollte die Rolle endothelialer Connexine an der Angiogenese untersucht werden. Methoden: Venöse Zellen der menschlichen Nabelschnur (HUVEC) wurden kultiviert bis sie subkonfluent waren. Vor der 3D Kultur im Matrigel wurden die Zellen entweder mit Nicotin, dem Gap Junction Inhibitor Palmitoleinsäure (PA), einem siRNA-Knockdown von entweder Cx37, Cx40 oder Cx43 oder mit Isoprenalin behandelt. Die Zellen wurden dann auf ein in vitro Angiogenese-Assay (3D-Kultur, Matrigel) gegeben und nach 18h wurden unterschiedliche Angiogeneseparameter erhoben, um die Komplexität der Angiogenese zu beurteilen. Änderungen der Expression der Cx mRNA- und Proteinexpression sowie der Kommunikation über Gap Junctions wurden mittels PCR, Immunfluoreszenzmikroskopie, Western Blot und Lucifer Yellow Dye Transfer untersucht. Bei Gewebeproben der A. mammaria von Rauchern und Nichtrauchern wurden mittels Immunofluoreszenzmikroskopie die Expression der Cx beurteilt. Ergebnisse: Die Behandlung mit spezifischer siRNA führte zu einer signifikanten Abnahme der Expression des jeweiligen Connexins in den HUVECs. Sowohl der Knockdown als auch die Behandlung mit PA verringerte die Kommunikation über Gap Junctions signifikant und reduzierte die Anzahl der Abzweigungen im Angiogenese-Assay. Der Knockdown des Cx43 und Cx40 sowie die Behandlung mit PA reduzierten ebenfalls die Komplexität des Musters im Matrigel-Assay. Nicotin führte zu einer Reduktion der Cx43- und Cx37-Proteinexpression, wohingegen Cx40 durch transskriptionelle Gegenregulation konstant gehalten wurde, sowie zu einer Abnahme der Länge der Kapillar-ähnlichen-Strukturen, der Anzahl der Abzweigungen und des Musters im Matrigelassay, während die Anzahl der Zellen zunahm. Die mRNA-Expression der Connexine war hingegen erhöht. In Gewebeproben von Rauchern konnte analog eine verminderte Expression von Cx43 und Cx37, aber nicht von Cx40, in der Intima gezeigt werden. Isoprenalin erhöhte die Proteinexpression der endothelialen Connexine und verbesserte sowohl die interzelluläre Kommunikation als auch das Muster im Matrigel-Assay. Ebenso waren die Kapillar-ähnlichen Strukturen im Vergleich zur Kontrolle länger. Schlussfolgerung: Aus den erhobenen Ergebnissen lässt sich der Schluss ziehen, dass Connexine bei der Angiogenese involviert sind, vor allem beim Vorgang der Verzweigung. Dies kann teilweise die Veränderung erklären, die eine Nicotinbehandlung auf die Angiogenese hat.

In der vorliegenden Arbeit wurden Myokardproben des rechtsventrikulären Ausflusstraktes von Patienten mit Fallot’scher Tetralogie sowie Double Outlet Right Ventricle vom Fallot - Typ untersucht. Hintergrund der Studie waren Untersuchungen anderer Autoren an Cx43 - knock - out Mäusen, die dort Veränderungen des kardialen Phänotyps beschrieben, die sie als Fallot - artig interpretierten. Daraus wurde die Hypothese entwickelt, dass Änderungen auf der Ebene des Connexin 43 ursächlich mit der Fallot’schen Tetralogie verbunden sein könnten. Es erfolgte eine histologische Analyse von 25 Patientenproben im Hinblick auf die Lokalisation von Connexin 43 sowie N - Cadherin. Es zeigte sich eine altersabhängige Verteilung von Connexin 43 und N - Cadherin. Insbesondere Patienten der Gruppe 1 (jünger als zwei Jahre) zeigten eine Verteilung sowohl an der lateralen Zellseite, als auch am Pol der Kardiomyozyten. Mit zunehmendem Alter beschränkten sich sowohl Connexin 43 als auch N - Cadherin auf die Disci intercalares zwischen den Kardiomyozyten und befanden sich dort in enger Nachbarschaft zueinander. Des Weiteren erfolgte eine Analyse der codierenden Region des Connexin 43 Gens mittels High Resolution Melting - PCR und sich daran anschließender Sequenzierung. Es zeigten sich sowohl bei den Kontrollen als auch den Patienten bereits bekannte Single Nucleotide Polymorphismen sowie bis dato unbekannte Sequenzvariationen. Allerdings wurden keine homozygoten Veränderungen der DNA festgestellt. Auch fand sich keine der heterozygoten Veränderungen in allen untersuchten Patienten. Somit ist es unwahrscheinlich, dass ein einzelner Basenaustausch zum komplexen Krankheitsbild der Fallot’schen Tetralogie beziehungsweise zum Double Outlet Right Ventricle vom Fallot - Typ führt.

Die vorgelegte Dissertationsschrift dient der Identifizierung des Mechanismus, über welchen neonatale Kardiomyozyten der Ratte biaxialen zyklischen Stretch wahrnehmen. Angriffspunkt dafür bildeten sowohl Stretch Activated Ion Channels (SAIC) als auch die mit Integrinen assoziierte Focal Adhesion Kinase (FAK). Die Inhibition der SAIC erfolgte mit Gadolinium und eine Blockade der FAK konnte durch den FAK-Inhibitor II erreicht werden. Eigens angelegte Zellkulturen wurden unter definierten Parametern für 24 Stunden unter Einwirkung genannter Stoffe gestretcht und anschließend einer Analyse mittels Immunfluoreszenz und Western Blot unterzogen. Gestretchte Kardiomyozyten richteten sich schräg zur Achse der einwirkenden Kraft aus und wiesen eine Polarisierung von Connexin 43 auf, außerdem zeigte sich dessen gesteigerte Expression. Durch die Blockade der FAK konnte lediglich eine aufgehobene Polarisierung von Connexin 43 bei unveränderter Expression und Ausrichtung der Kardiomyozyten festgestellt werden. Auch die Mikrotubuli veränderten nach Stretch ihre Orientierung bezogen auf die Zellachse. Die zunächst annähernde Parallelität der Fasern zeigte sich nach Inhibition der FAK deutlich aufgelockert. Für die Aktinfilamente konnte dies nicht nachgewiesen werden. Die Integrine dienen demnach der Wahrnehmung von Stretch und vermitteln die Polarisierung von Connexin 43 sowie die Orientierung der Mikrotubuli über die FAK. Für die anderen genannten Prozesse ist die Aktivierung eines FAK-unabhängigen Integrin-Signalweges denkbar. Gadolinium hatte insgesamt keinen Effekt auf beschriebene Veränderungen, sodass ein Einfluss der SAIC auf Stretch-induzierte Veränderungen in Kardiomyozyten ausgeschlossen werden konnte. Gleichzeitig konnte durch die Beobachtung der Polarisierung von Microtubule Organizing Center, Kinesin und Golgi-Apparat die Hypothese der sich durch Stretch orientierenden neonatalen Kardiomyozyte unterstützt werden, welche die Voraussetzung für die Anordnung von Connexin 43 an den Zellpolen darstellen könnte. Sowohl die Selbstorganisation des Myokards im Rahmen der Embryogenese als auch die Pathophysiologie verschiedener kardialer Erkrankungen könnte dadurch womöglich besser verstanden werden.

Mais de 200 mutações patogênicas já foram descritas no gene que codifica a Cx26 (GJB2) que levam à surdez hereditária. A mais frequente destas mutações é a c.35delG. Ela é a principal causa de surdez não sindrômica com padrão de herança autossômico recessivo na população brasileira e em diversas populações do mundo. O genoma humano contém 21 diferentes genes de proteínas da família das conexinas que são expressos em diversos tecidos. Os canais comunicantes e hemicanais formados por conexinas facilitam a passagem de pequenos metabólitos entre as células adjacentes e entre a célula e o meio extracelular, promovendo a homeostasia celular. Este estudo teve o objetivo de avaliar os efeitos da mutação c.35delG em homozigose no gene GJB2 em SHEDs sobre a diferenciação celular e sobre a expressão das Cx26 (GJB2), Cx30 (GJB6), Cx31 (GJB3), Cx43 (GJA1) e Cx50 (GJA8) em SHEDs (Stem cells from human exfoliated deciduous teeth). Para isso, obtivemos linhagens de SHEDs a partir de 3 indivíduos portadores da mutação c.35delG em homozigose e de 3 indivíduos controle, sem a mutação. Nossos resultados indicaram que SHEDs portadoras da mutação apresentam maiores taxas de diferenciação em adipócitos e em osteócitos do que SHEDs de indivíduos controle. Por meio de RT-PCR, RT-PCR quantitativa e citometria de fluxo identificamos a expressão dos genes GJB2 (Cx26), GJB6 (Cx30) e GJA1 (Cx43) e suas respectivas proteínas, tanto em SHEDs dos indivíduos com a mutação como em SHEDs de indivíduos controle. Não há expressão dos genes GJA8 (Cx50) e GJB3 (Cx31) e suas respectivas proteínas em SHEDs. Por meio de RT-PCR quantitativa observamos aumento dos níveis de expressão do RNAm de GJA1 e redução de RNAm de GJB2 em SHEDs oriundas de pacientes com c.35delG, quando comparadas às de amostras controle. Resultados obtidos por meio de Western Blotting mostraram aumento de aproximadamente 50% na expressão da Cx43 corroborando os resultados obtidos por meio de RT-PCR quantitativo. Detectamos que a expressão da Cx26 em células de indivíduos com mutação é 50% menor do que em células de indivíduos controle. Os aumentos observados das taxas de diferenciação em adipócitos e em osteócitos podem estar relacionados ao aumento da expressão da Cx43. Sabe-se que a Cx43 possui importante papel na manutenção de pré-adipócitos durante a fase de expansão clonal na adipogênese. A Cx43 também está relacionada à sinalização celular nas vias de proliferação e diferenciação durante a osteogênese. Indivíduos portadores da mutação c.35delG apresentam surdez sem outros fenótipos associados sugerem que ocorra redundância funcional entre as conexinas. Além disso, o aumento da expressão de GJA1 (Cx43) nas SHEDs oriundas dos indivíduos surdos com a mutação c.35delG falam a favor da existência de um mecanismo de regulação compensatório a ser esclarecido, que aumenta a síntese de Cx43 na redução ou ausência da Cx26 funcional / More than 200 patogenic mutations in the connexin 26 gene (GJB2) were associated to deafness. The most frequent is the c.35delG mutation, which is the most common cause of nonsydromic recessive hearing loss in the Brazilian population, and also in several populations in the world. The human genome contains 21 genes that comprise the gene family of the connexins, expressed in many different tissues. Connexins are components of gap junctions and hemichannels, which facilitate the transference of small metabolites between cells and between cells and the extracelular medium. The aim of this study was to investigate the effects of the c.35delG mutation on adipogenesis, chondrogenesis and osteogenesis, and also its effects on mRNA and protein expression related to Cx26 (GJB2), Cx30(GJB6), Cx31 (GJB3), Cx43 (GJA1) and Cx50 (GJA8) in SHEDs (stem cells from human exfoliated deciduous teeth). For this purpose, 3 SHED lines from patients with c.35delG mutation in homozygosis and 3 lines from individuals without mutation were established. We observed that the rates of induced differentiation into adipocytes and osteocytes were higher in SHEDs from individuals with the c.35delG mutation than in SHEDs from control individuals. By RT-PCR, real time RT-PCR and flow cytometry were detected the expression of GJB2, GJB6 and GJA1 genes and their respective proteins Cx26, Cx30 and Cx43 in SHEDs from control samples and in SHEDs with the mutation. The expression of GJA8 (Cx50) and of GJB3 (Cx31) were not detected in SHEDS from both groups. Quantitative gene expression analysis using real-time RT-PCR revealed significantly elevated levels of GJA1 mRNA expression and decreased GJB2 mRNA expression in cells from patients with c.35delG, when compared to cells from normal controls. Western Blotting analysis showed an increase of about of 50% of the protein Cx43 in cells with c.35delG mutation, in comparison to cells from normal controls, in accordance with the real-time RT-PCR results. We detected that Cx26 protein expression in samples with c.35delG mutation is approximately 50% lower than in SHEDs from normal controls. The observed increase in differentiation rates related to adipogenesis and osteogenesis may be explained by the higher levels of Cx43 expression. This is supported by the fact that Cx43 was reported to play an important role in the maintenance of pre-adipocytes during clonal expansion and it was also related to cell signaling pathways in proliferation and differentiation during osteogenesis. Individuals with c.35delG in homozygosis present only deafness, without other symptoms, which suggests that functional redundancy between connexins may exist. The increase of Cx43 expression in SHEDs from deaf patients with c.35delG mutation found by us may be related to a compensation mechanism to be clarified, which results in increase of the production of Cx43 when functional connexin Cx26 is reduced or absent

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