Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2010-2011 / La maladie de Stargardt est la dégénérescence maculaire la plus fréquente chez les enfants de 6 à 12 ans. La maladie se caractérise par une perte graduelle et irréversible de la vision centrale. La forme récessive du Stargardt (90% des cas) est causée par le gène ABCA4. Le but de notre étude était d'identifier la nature et la prévalence des mutations retrouvées dans ABC A4 chez la population canadienne-française souffrant de Stargardt. Parmi les 19 familles recrutées, 29 patients souffraient de Stargardt et se partageaient 39 haplotypes distincts. Sur les 20 variations détectées, 15 étaient de réelles mutations alors que les cinq autres étaient des polymorphismes sans conséquence sur la maladie. 45% des 58 chromosomes étudiés ont été associés à une mutation. Sept nouvelles mutations ont été confirmées, mais aucun effet fondateur n'a été observé. Ceci est dû au gène ABCA4 qui est extrêmement polymorphique et sujet aux réarrangements géniques.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La cécité d’origine cornéenne est Ia deuxième cause de cécité dans le monde. Son traitement de choix est la kératoplastie. ll est aujourd’hui nécessaire de réfléchir à de nouvelles solutions pour remplacer la kératoplastie dans sa forme actuelle qui bien que satisfaisante, n’est pas totalement parfaite. En effet, les techniques actuelles de kératoplastie utilisent une allogreffe. Le greffon va subir chez le donneur une diminution de la densité des cellules endothéliales (CE) du greffon au fil du temps. Ce travail présente successivement les solutions abordées par le BiiGC pour produire des CE en masse ainsi que les différents supports en vue d’une kératoplastie lamellaire postérieure. Les solutions envisagées par le laboratoire BiiGC doivent permettre un transfert à l’être humain dans des conditions de sécurité et d’acceptabilité maximales. Les différents contrôles de l’identité des cellules obtenues et les contrôles de sécurité nécessitent une connaissance robuste de la biologie, du morphotype et du phénotype des CE cornéennes. Cette thèse présente les différentes exigences réglementaires et de qualité nécessaires à l’obtention de greffons cornéens bioengineerés. Le choix du BiiGC devant se conformer d’emblée à ces exigences en vue d’un transfert à l’être humain. Dans une première partie, nous présentons une revue de la littérature sur le bioengineering de greffons cornéens. La production de CE et de stroma seront ensuite exposés avec les différentes approches abordées par le BiiGC. Enfin, les différentes techniques de validation morphologiques et fonctionnelles de greffons obtenus seront présentées. / Corneal diseases are the first leading cause of blindness worldwide. Its treatment relies on keratoplasty which in its actual form is a satisfying but not a perfect solution. We have to think about new solutions for corneal graft. Today, corneal graft is often an allograft. With this technique, there is a loss of endothelial cell (EC) density through time. This work presents the solutions which BiiGC laboratory is working on for mass production of EC and different carriers for these cells for posterior keratoplasty. These solutions must be possible on human being with safety conditions. Controls of identity, of obtained cells and security controls need a strong knowledge of biology, morphology and phenotype of EC. This work presents the legal conditions of quality needed to obtain bioengineered corneal grafts. The choice of BiiGC laboratory must involve these conditions for a transfer to human being. In a first part, we present a review of the literature about corneal bioengineering. Production of EC and of corneal stroma are discussed with different approaches by BiiGC laboratory. In the end, the different techniques of morphological controls of corneal grafts are discussed.

L'objectif du projet est la synthèse d'une cornée artificielle biocompatible à base de collagène de type I extrait et purifié à partir de tendons de queues de rats. La synthèse utilise les propriétés mésogènes (cristal-liquides) de la molécule de collagène ainsi qu'une transition sol-gel mimant l'étape de fibrillogenèse qui se déroule in vivo. Des solutions acides de collagène (500 mM en acide acétique) sont dyalisées contre des solutions de diverses concentrations en acide acétique et en acide chlorhydrique puis concentrées jusqu'à 90 mg/mL. Les phases cristal-liquides données par les différentes conditions physico-chimiques sont analysées par microscopie à lumière polarisée et par génération de seconde harmonique. L'une des conditions permet d’obtenir une phase dite en contreplaqué, ce qui est l’organisation des lamelles de fibrilles de collagène dans la cornée.Analysée par microscopie électronique à transmission, la structure des matrices obtenues après fibrillogénèse présente des domaines en contreplaqué indiquant une conservation et une stabilisation de l’organisation cristal-liquide d'origine. L’organisation obtenue est proche de celle du stroma cornéen. Par une optimisation des conditions physico-chimiques, les matrices synthétisées présentent une transparence proche de 90 % et possèdent de bonnes propriétés mécaniques avec un module d’Young proche de 1 MPa. Des cultures cellulaires effectuées sur les matrices transparentes montrent qu’elles sont un très bon support pour la culture de cellules cornéennes, en particulier des cellules épithéliales. Tous ses résultats confortent la méthode utilisée et les essais in vivo constituent l’étape suivante. / In view to generate artificial corneas, dense transparent collagen type-I scaffolds were synthesized exploiting the intrinsic liquid crystals properties of collagen molecules. 3 mg/mL collagen solutions in 500 mM acetic acid were dialyzed against a solution of precise concentrations in acetic and hydrochloric acid. When concentrated, solution provided a liquid-crystal organization resembling plywood, which is the organization of the collagen fibrils in the cornea. This was verified by polarized light and second harmonic generation microscopy experiments. In parallel these collagen solutions were also concentrated by centrifugation-filtration up to 90 mg/mL. The concentrated solutions were pressed into cornea-like shape and submitted to ammonia vapor in order to induce the fibrillogenesis of collagen. The result is a transparent dense fibrillated collagen matrix (transparency 90 %). Transmission electron microscopy revealed that fibrils kept the organization of the concentrated solution. Using a custom made device, mechanical tests showed that the Young modulus reached 900kPa. Human donor limbal explants were sewed on top of the scaffolds and cultured for 14 days. Optical microscopy and immunocytochemical analysis showed the development of an epithelium with characteristics of corneal epithelial cells. Preliminary experiments showed that keratocytes could be successfully inserted during the synthesis process. Thus, the results show the viability of the process of fabrication, and the following step is the in vivo experiment.

L’utilisation de lentilles cornéennes peut servir à améliorer le profil d’administration d’un principe actif dans les yeux. Avec une efficacité d’administration de 5% par l’utilisation de gouttes, on comprend rapidement que l’administration oculaire doit être améliorée. Cette faible administration a donné naissance à plusieurs tentatives visant à fabriquer des lentilles cornéennes médicamentées. Cependant, à cause de multiples raisons, aucune de ces tentatives n’a actuellement été mise sur le marché. Nous proposons dans cette étude, une possible amélioration des systèmes établis par le développement d’une lentille cornéenne à base de 2-(hydroxyéthyle)méthacrylate (HEMA), dans laquelle des microgels, à base de poly N-isopropylacrylamide (pNIPAM) thermosensible encapsulant un principe actif, seront incorporé. Nous avons donc débuté par développer une méthode analytique sensible par HPCL-MS/MS capable de quantifier plusieurs molécules à la fois. La méthode résultante a été validée selon les différents critères de la FDA et l’ICH en démontrant des limites de quantifications et de détections suffisamment basses, autant dans des fluides simulés que dans les tissus d’yeux de lapins. La méthode a été validée pour sept médicaments ophtalmiques : Pilocarpine, lidocaïne, proparacaïne, atropine, acétonide de triamcinolone, timolol et prednisolone. Nous avons ensuite fait la synthèse des microgels chargés négativement à base de NIPAM et d’acide méthacrylique (MAA). Nous avons encapsulé une molécule modèle dans des particules ayant une taille entre 200 et 600 nm dépendant de la composition ainsi qu’un potentiel zêta variant en fonction de la température. L’encapsulation de la rhodamine 6G (R6G) dans les microgels a été possible jusqu’à un chargement (DL%) de 38%. L’utilisation des isothermes de Langmuir a permis de montrer que l’encapsulation était principalement le résultat d’interactions électrostatiques entre les MAA et la R6G. Des cinétiques de libérations ont été effectuées à partir d’hydrogels d’acrylamide chargés en microgels encapsulant la R6G. Il a été trouvé que la libération des hydrogels chargés en microgels s’effectuait majoritairement selon l’affinité au microgel et sur une période d’environ 4-24 heures. La libération à partir de ces systèmes a été comparée à des formules d’hydrogels contenant des liposomes ou des nanogels de chitosan. Ces trois derniers (liposomes, microgels et nanogels) ont présenté des résultats prometteurs pour différentes applications avec différents profils de libérations. Enfin, nous avons transposé le modèle développé avec les gels d’acrylamide pour fabriquer des lentilles de contact de 260 à 340 µm d’épaisseur à base de pHEMA contenant les microgels avec une molécule encapsulée devant être administrée dans les yeux. Nous avons modifié la composition de l’hydrogel en incorporant un polymère linéaire, la polyvinylpyrrolidone (PVP). L’obtention d’hydrogels partiellement interpénétrés améliore la rétention d’eau dans les lentilles cornéennes. L’encapsulation dans les microgels chargés négativement a donné de meilleurs rendements avec la lidocaïne et cette dernière a été libérée de la lentille de pHEMA en totalité en approximativement 2 heures qu’elle soit ou non encapsulée dans des microgels. Ainsi dans cette étude pilote, l’impact des microgels n’a pas pu être déterminé et, de ce fait, nécessitera des études approfondies sur la structure et les propriétés de la lentille qui a été développée. En utilisant des modèles de libération plus représentatifs de la physiologie de l’œil, nous pourrions conclure avec plus de certitude concernant l’efficacité d’un tel système d’administration et s’il est possible de l’optimiser. / The development of corneal contact lenses initially aimed to correct vision troubles but more recently targets to improve administration of ophthalmic drugs. Eye drops from ophthalmic solutions has a poor administration efficiency of 5% or less and is currently the most used method to deliver drugs to the eye. Such administration technique needs to be improved and contact lenses could be the solution according to many opticians. However, no marketed therapeutic contact lenses has been marketed up to date. In this project we have developed a model of a contact lens made of 2-(hydroxyethyl)methacrylate embedding microgels of poly N-isopropylacrylamide (pNIPAM), encapsulating a model drug. We first developed an analytical method capable to quantify simultaneously seven ophthalmic drugs: Pilocarpine, lidocaine, proparacaine, atropine, triamcinolone acetonide, timolol and prednisolone. This method was developed on a HPLC-MS/MS device and was validated according to FDA and ICH criteria. Using this method, we achieved very low detection and quantitation limits with high precision and accuracy in both simulated lachrymal fluids and in rabbit ocular tissues. Each seven drugs was validated using this method. We proceeded with the synthesis of negatively charged microgels of NIPAM using methacrylic acid (MAA) as comonomer. Resulting size were ranging between 200-600 nm and zeta potential was found to increase (absolute value) with temperature. The microgels were used to encapsulate a model molecule, rhodamine 6G (R6G), in different medium and were loaded in the microgel up to 38% (drug loading, DL%). Using Langmuir isotherms to measure affinity and adsorption of R6G, it was found well correlated to MAA content in microgels, suggesting electrostatic interaction was the main parameter for drug loading. Release kinetics was performed using a model hydrogel of acrylamide embedding the R6G-loaded microgels. The measured release was found to follow an affinity-based mechanism for over 4-24 hours. The release kinetics were then compared to a formulation of liposomes and nanogels of chitosan embedded in hydrogel. All formulations exhibited interesting release profiles making them promising systems for different therapeutic applications. Finally, we changed the acrylamide gels for pHEMA designed to reproduce contact lenses containing drug-loaded microgels. The hydrogel composition, in terms of monomer / cross-linker ratio, was first optimized to fit contact lenses properties of 260-340 µm thick contact lenses. We also made use of semi-interpenetrated polyvinylpirrolidone (PVP) in the pHEMA hydrogel matrix to increase its water content. The highest DL% of negatively charged microgels were obtained using lidocaine and were used for release studies, where the total content of lidocaine was released in approximately 2 hours with and without microgels. In the end, this was a pilot study aiming to evaluate the potential of microgel usability in contact lenses. However, the impact of microgels on release was not fully conclusive. Additional studies should be undertaken to achieve a better comprehension and characterization of the release mechanism such as using more eye relevant physiological models. Such studies would provide further insights on the use of such materials for eye drug delivery and its applicability.

La myopie est désormais considérée un problème de santé publique par l’Organisation Mondiale de la Santé et de multiples méthodes ont été mises en place afin de contrôler sa progression chez les jeunes en croissance. Parmi celles-ci, les lentilles cornéennes multifocales sont utilisées, permettant une focalisation au niveau de la rétine centrale et un défocus myopique en périphérie. Ce défocus rétinien aurait comme effet de diminuer la progression de la myopie et l’élongation du globe oculaire. Comme plusieurs études ont montré que la rétine est apte à percevoir le défocus et à différencier son sens, l’utilisation d’outils tels que l’électrorétinographie permet d’étudier ce phénomène plus en profondeur. Cette étude vise donc à mesurer la réponse rétinienne, à 5 différentes excentricités, avec l’électrorétinographie lorsqu’on soumet la rétine à un défocus myopique en utilisant des lentilles cornéennes multifocales à addition élevée et à comparer cet effet lorsque le diamètre de leurs zones optiques varie. Le flash global mfERG a été effectué sur 27 participants à trois reprises, soit avec une lentille cornéenne ne causant pas de défocus et avec deux lentilles multifocales ayant des zones optiques de différents diamètres (4mm et 7mm), permettant ainsi de varier l’aire du défocus. Les résultats montrent que l’amplitude de l’onde directe, causée principalement par les photorécepteurs et les cellules bipolaires, n’est pas influencée par le design des lentilles. L’amplitude de l’onde induite est toutefois diminuée de façon significative avec la LC ayant une zone optique plus petite et causant un défocus sur une plus grande surface rétinienne. Cette différence est présente au niveau de l’anneau 5, qui correspond à une excentricité rétinienne de 15,7o à 24,0o. Ceci précise l’endroit qui semblerait le plus sensible au défocus myopique. Ces données peuvent influencer le design des lentilles souples multifocales utilisées pour le contrôle de la myopie. / Myopia is now considered a public health issue by the World Health Organization and multiple methods have been developed to control its progression. Among these methods, soft multifocal contact lenses are used, which allow a focused image on the central retina and a myopic defocus peripherally. This retinal defocus impacts the progression of myopia and axial length. Since several studies have shown that the retina is sensitive to the type of defocus, the use of tools such as electroretinography allow the study of the retinal response in greater depth. The purpose of this study was to evaluate the retinal response, at 5 different eccentricities, with electroretinography when the retina is subjected to myopic defocus using different high addition soft multifocal contact lenses and to compare this effect when the diameter of their optical zones varies. 27 participants performed a global flash mfERG three times, either with a single vision contact lens or with two multifocal lenses carrying different optical zone diameters (4mm and 7mm), allowing for the variation in defocus area. The results show that the amplitude of the direct wave, caused mainly by photoreceptors and bipolar cells, is not influenced by the design of the lenses. The amplitude of the induced wave, however, is significantly decreased when the optical zone is smaller and the lenses cause a defocus over a larger retinal area. This difference is present at ring 5, which corresponds to a retinal eccentricity of 15.7o to 24.0o. This specifies the location that would appear to be most sensitive to myopic defocus. This data may influence the design of multifocal soft lenses used for myopia control.

La dystrophie cornéenne endothéliale de Fuchs (FECD, pour l’abréviation du terme anglais « Fuchs endothelial corneal dystrophy ») est une maladie de l'endothélium cornéen. Sa pathogenèse est mal connue. Aucun traitement médical n’est efficace. Le seul traitement existant est chirurgical et consiste dans le remplacement de l’endothélium pathologique par un endothélium sain provenant de cornées de la Banque des yeux. Le traitement chirurgical, en revanche, comporte 10% de rejet immunologique. Des modèles expérimentaux sont donc nécessaires afin de mieux comprendre cette maladie ainsi que pour le développement de traitements alternatifs. Le but général de cette thèse est de développer un modèle expérimental de la FECD en utilisant le génie tissulaire. Ceci a été réalisé en trois étapes. 1) Tout d'abord, l'endothélium cornéen a été reconstruit par génie tissulaire en utilisant des cellules endothéliales en culture, provenant de patients atteints de FECD. Ce modèle a ensuite été caractérisé in vitro. Brièvement, les cellules endothéliales cornéennes FECD ont été isolées à partir de membranes de Descemet prélevées lors de greffes de cornée. Les cellules au deuxième ou troisième passages ont ensuite été ensemencées sur une cornée humaine préalablement décellularisée. Suivant 2 semaines de culture, les endothélia cornéens reconstruits FECD (n = 6) ont été évalués à l'aide d'histologie, de microscopie électronique à transmission et d’immunomarquages de différentes protéines. Les endothélia cornéens reconstruits FECD ont formé une monocouche de cellules polygonales bien adhérées à la membrane de Descemet. Les immunomarquages ont démontré la présence des protéines importantes pour la fonctionnalité de l’endothélium cornéen telles que Na+-K+/ATPase α1 et Na+/HCO3-, ainsi qu’une expression faible et uniforme de la protéine clusterine. 2) Deux techniques chirurgicales (DSAEK ; pour « Descemet stripping automated endothelial keratoplasty » et la kératoplastie pénétrante) ont été comparées pour la transplantation cornéenne dans le modèle animal félin. Les paramètres comparés incluaient les défis chirurgicaux et les résultats cliniques. La technique « DSAEK » a été difficile à effectuer dans le modèle félin. Une formation rapide de fibrine a été observée dans tous les cas DSAEK (n = 5). 3) Finalement, la fonctionnalité in vivo des endothélia cornéens reconstruits FECD a été évaluée (n = 7). Les évaluations in vivo comprenaient la transparence, la pachymétrie et la tomographie par cohérence optique. Les évaluations post-mortem incluaient la morphométrie des cellules endothéliales, la microscopie électronique à transmission et des immunomarquage de protéines liées à la fonctionnalité. Après la transplantation, la pachymétrie a progressivement diminué et la transparence a progressivement augmenté. Sept jours après la transplantation, 6 des 7 greffes étaient claires. La microscopie électronique à transmission a montré la présence de matériel fibrillaire sous-endothélial dans toutes les greffes d’endothelia reconstruits FECD. Les endothélia reconstruits exprimaient aussi des protéines Na+-K+/ATPase et Na+/HCO3-. En résumé, cette thèse démontre que les cellules endothéliales de la cornée à un stade avancé FECD peuvent être utilisées pour reconstruire un endothélium cornéen par génie tissulaire. La kératoplastie pénétrante a été démontrée comme étant la procédure la plus appropriée pour transplanter ces tissus reconstruits dans l’œil du modèle animal félin. La restauration de l'épaisseur cornéenne et de la transparence démontrent que les greffons reconstruits FECD sont fonctionnels in vivo. Ces nouveaux modèles FECD démontrent une réhabilitation des cellules FECD, permettant d’utiliser le génie tissulaire pour reconstruire des endothelia fonctionnels à partir de cellules dystrophiques. Les applications potentielles sont nombreuses, y compris des études physiopathologiques et pharmacologiques. / Fuchs endothelial corneal dystrophy (FECD) is a primary disease of the corneal endothelium. Its pathogenesis is poorly understood. No medical treatment is effective. Surgical treatment (the only available treatment) carries 10% of immunogenic rejection. Experimental models are needed in order to better understand the disease and to investigate potential autologous treatments (to prevent immunogenic rejection). The overall goal of this thesis is to develop an experimental model for FECD using tissue engineering. This was achieved in three steps. 1) An in vitro tissue-engineered FECD model was created and characterized. Briefly, Descemet’s membranes from patients with late-stage FECD undergoing Descemet’s Stripping Automated Endothelial Keratoplasty (DSAEK) were used to isolate and culture FECD endothelial cells. Second or third-passaged FECD endothelial cells were seeded on a previously decellularized human cornea. After 2 weeks in culture, TE-FECD corneas (n=6) were assessed using histology, transmission electron microscopy (TEM) and immunofluorescence labeling of various proteins. TE-FECD endothelium yielded a monolayer of polygonal cells well adhered to Descemet’s membrane. The TE-FECD corneal endothelium expressed the function-related proteins Na+-K+/ATPase α1 and Na+/HCO3-. Clusterin expression was faint and uniform. 2) In order to determine the best surgical procedure to transplant the TE-FECD corneas in the feline model, a DSAEK procedure was evaluated and compared to penetrating keratoplasty technique. DSAEK assessments included surgical challenges and clinical outcomes. DSAEK technique was challenging to perform in the feline model. Rapid fibrin formation was observed in all DSAEK cases (n=5). 3) The in vivo functionality of the TE-FECD corneas was assessed. TE-FECD corneas were grafted in the feline model (n=7) using penetrating keratoplasty procedure and observed for seven days. In vivo assessments included transparency, pachymetry, optical coherence tomography, endothelial cell morphometry, TEM and immunostaining of function-related proteins. After transplantation, pachymetry gradually decreased and transparency gradually increased. Seven days after transplantation, 6 out of 7 grafts were clear. Post-mortem TEM showed subendothelial loose fibrillar material deposition in all TE-FECD grafts. The TE grafted endothelium expressed Na+-K+/ATPase and Na+/HCO3-. This thesis demonstrates that endothelial cells from late-stage FECD corneas can be used to engineer a corneal endothelium. Compared to DSEAK, penetrating keratoplasty is a more appropriate procedure for corneal transplantation in the feline model, since the DSAEK procedure in the feline model presently yields inconsistent clinical results. Restoration of corneal thickness and transparency demonstrates that the TE-FECD grafts are functional in vivo. This novel FECD living model suggests a potential role of tissue engineering for FECD cell rehabilitation. Potential applications are numerous, including pathophysiological and pharmacological studies.

Introduction : Malgré leur état non-prolifératif in vivo, les cellules endothéliales cornéennes (CEC) peuvent être amplifiées in vitro. Leur transplantation subséquente par injection intracamérale pourrait surmonter la pénurie de tissus associée à l’allo-greffe traditionnelle – l’unique traitement définitif disponible pour les endothéliopathies cornéennes. Objectif : Évaluer la fonctionnalité d’un endothélium cornéen reconstitué par injection de CEC dans la chambre antérieure du félin. Méthodes : Les yeux droits de 16 animaux ont été opérés. Huit ont été désendothélialisés centralement avec injection de 2x10e5 (n=4) ou 1x10e6 (n=4) CEC félines supplémentées avec Y-27632 et marquées avec SP-DiOC18(3). Deux ont été désendothélialisés complètement et injectés avec 1x10e6 CEC et Y-27632. Six contrôles ont été désendothélialisés centralement (n=3) ou complètement (n=3) et injectés avec Y-27632 sans CEC. La performance clinique, l’intégrité anatomique, le phénotype fonctionnel et l’expression de SP-DiOC18(3) du nouvel endothélium ont été étudiés. Résultats : Les cornées greffées avec 2x10e5 CEC et les contrôles désendothélialisés centralement ont réussi le mieux cliniquement. Les contrôles désendothélialisés complètement sont restés opaques. L’histopathologie a révélé une monocouche endothéliale fonctionnelle dans les cornées greffées avec 2x10e5 CEC et les contrôles désendothélialisés centralement, une multicouche endothéliale non-fonctionnelle dans les cornées désendothélialisées centralement et greffées avec 1x10e6 CEC, et un endothélium fibrotique non-fonctionnel dans les cornées désendothélialisées complètement. L’expression de SP-DiOC18(3) était rare dans les greffes. Conclusion : La thérapie par injection cellulaire a reconstitué un endothélium partiellement fonctionnel, auquel les CEC injectées n’ont contribué que peu. L’injection de Y-27632 sans CEC a reconstitué l’endothélium le plus sain. Des études additionnelles investiguant l’effet thérapeutique de Y-27632 seul sont justifiées. / Introduction : Despite their growth arrest in vivo, corneal endothelial cells (CEC) can be amplified in vitro. Their subsequent transplantation by cell-injection therapy could overcome the tissue scarcity associated with traditional allo-transplantation, which is the only currently available treatment for irreversible corneal endothelial failure. Objective : To evaluate the functionality of a corneal endothelium reconstituted by cell- injection therapy in the feline. Methods: The right eyes of 16 animals underwent surgery. Eight underwent central endothelial scraping and injection with 2x10e5 (n=4) or 1x10e6 (n=4) feline CEC supplemented with Y-27632 and labeled with SP-DiOC18(3). After total scraping, two eyes were injected with 1x10e6 labeled CEC and Y-27632. The central (n=3) or entire (n=3) endothelium was scraped in six controls followed by Y-27632 injection without CEC. Outcomes included clinical performance, anatomical integrity, functional phenotype and SP-DiOC18(3) expression of the new endothelium. Results: Corneas grafted with 2x10e5 CEC and centrally scraped controls performed the best clinically. Entirely scraped controls remained hazy and thick. Histopathology revealed a confluent, functional endothelial monolayer in corneas grafted with 2x10e5 CEC and centrally scraped controls, a non-uniform, non-functional endothelial multilayer in centrally scraped corneas grafted with 1x10e6 CEC, and a non-functional fibrotic endothelium in entirely scraped grafts and controls. SP-DiOC18(3) was scarce in grafts and absent in controls. Conclusion : Cell-injection therapy reconstituted an incompletely functional endothelium, to which injected CEC contributed little. Y-27632 injection without CEC reconstituted the healthiest endothelium. Further studies investigating the therapeutic effect of Y-27632 alone are warranted.

En France, les dysfonctions endothéliales représentent environ la moitié des indications de greffes de cornée réalisées chaque année. Cependant, les problématiques liées à la pénurie de greffon, aux difficultés des techniques chirurgicales de greffes endothéliales ainsi qu’aux risques d’échec ou de rejet de greffe poussent les chercheurs à développer de nouvelles thérapies moins invasives et plus efficaces. La thérapie cellulaire cornéenne endothéliale est une des voies de recherche actuellement explorées dont le but est de s’affranchir des aléas de la greffe de cornée. La cornée humaine est un tissu idéal pour la thérapie cellulaire. Grâce à ses caractéristiques d’organe à la fois avasculaire et immunitairement privilégié, les cellules transplantées sont ainsi bien mieux tolérées par rapport aux autres tissus et organes vascularisés. Les avancées dans le domaine des cellules souches, de l'ingénierie, particulièrement avec l’arrivée des greffes de cellules souches épithéliales pour le traitement des pathologies sévères de la surface oculaire, ont suscité un intérêt massif afin d’adapter ces techniques aux cellules endothéliales / In France, around half of all corneal keratoplasties are performed to treat corneal endothelial dysfunction each year. However, the use of endothelial keratoplasty is limited by the technical difficulty of the procedure, a shortage of available grafts, and the potential for graft failure or rejection. These limitations are driving researchers to develop new, less invasive, and more effective therapies. Corneal endothelial cell therapy is being explored as a potential therapeutic measure, to avoid the uncertainty associated with grafting. The human cornea is an ideal tissue for cell therapy as owing to its avascular characteristics, transplanted cells are better tolerated compared with other vascularized tissues and organs. Advances in the field of stem-cell engineering, particularly the development of corneal epithelial stem cell therapy for the treatment of severe diseases of the ocular surface, have aroused a massive interest in adapting cell-therapy techniques to corneal endothelial cells

La dystrophie cornéenne endothéliale de Fuchs (FECD, pour l’abréviation du terme anglais « Fuchs endothelial corneal dystrophy ») est une maladie de l'endothélium cornéen. Sa pathogenèse est mal connue. Aucun traitement médical n’est efficace. Le seul traitement existant est chirurgical et consiste dans le remplacement de l’endothélium pathologique par un endothélium sain provenant de cornées de la Banque des yeux. Le traitement chirurgical, en revanche, comporte 10% de rejet immunologique. Des modèles expérimentaux sont donc nécessaires afin de mieux comprendre cette maladie ainsi que pour le développement de traitements alternatifs. Le but général de cette thèse est de développer un modèle expérimental de la FECD en utilisant le génie tissulaire. Ceci a été réalisé en trois étapes. 1) Tout d'abord, l'endothélium cornéen a été reconstruit par génie tissulaire en utilisant des cellules endothéliales en culture, provenant de patients atteints de FECD. Ce modèle a ensuite été caractérisé in vitro. Brièvement, les cellules endothéliales cornéennes FECD ont été isolées à partir de membranes de Descemet prélevées lors de greffes de cornée. Les cellules au deuxième ou troisième passages ont ensuite été ensemencées sur une cornée humaine préalablement décellularisée. Suivant 2 semaines de culture, les endothélia cornéens reconstruits FECD (n = 6) ont été évalués à l'aide d'histologie, de microscopie électronique à transmission et d’immunomarquages de différentes protéines. Les endothélia cornéens reconstruits FECD ont formé une monocouche de cellules polygonales bien adhérées à la membrane de Descemet. Les immunomarquages ont démontré la présence des protéines importantes pour la fonctionnalité de l’endothélium cornéen telles que Na+-K+/ATPase α1 et Na+/HCO3-, ainsi qu’une expression faible et uniforme de la protéine clusterine. 2) Deux techniques chirurgicales (DSAEK ; pour « Descemet stripping automated endothelial keratoplasty » et la kératoplastie pénétrante) ont été comparées pour la transplantation cornéenne dans le modèle animal félin. Les paramètres comparés incluaient les défis chirurgicaux et les résultats cliniques. La technique « DSAEK » a été difficile à effectuer dans le modèle félin. Une formation rapide de fibrine a été observée dans tous les cas DSAEK (n = 5). 3) Finalement, la fonctionnalité in vivo des endothélia cornéens reconstruits FECD a été évaluée (n = 7). Les évaluations in vivo comprenaient la transparence, la pachymétrie et la tomographie par cohérence optique. Les évaluations post-mortem incluaient la morphométrie des cellules endothéliales, la microscopie électronique à transmission et des immunomarquage de protéines liées à la fonctionnalité. Après la transplantation, la pachymétrie a progressivement diminué et la transparence a progressivement augmenté. Sept jours après la transplantation, 6 des 7 greffes étaient claires. La microscopie électronique à transmission a montré la présence de matériel fibrillaire sous-endothélial dans toutes les greffes d’endothelia reconstruits FECD. Les endothélia reconstruits exprimaient aussi des protéines Na+-K+/ATPase et Na+/HCO3-. En résumé, cette thèse démontre que les cellules endothéliales de la cornée à un stade avancé FECD peuvent être utilisées pour reconstruire un endothélium cornéen par génie tissulaire. La kératoplastie pénétrante a été démontrée comme étant la procédure la plus appropriée pour transplanter ces tissus reconstruits dans l’œil du modèle animal félin. La restauration de l'épaisseur cornéenne et de la transparence démontrent que les greffons reconstruits FECD sont fonctionnels in vivo. Ces nouveaux modèles FECD démontrent une réhabilitation des cellules FECD, permettant d’utiliser le génie tissulaire pour reconstruire des endothelia fonctionnels à partir de cellules dystrophiques. Les applications potentielles sont nombreuses, y compris des études physiopathologiques et pharmacologiques. / Fuchs endothelial corneal dystrophy (FECD) is a primary disease of the corneal endothelium. Its pathogenesis is poorly understood. No medical treatment is effective. Surgical treatment (the only available treatment) carries 10% of immunogenic rejection. Experimental models are needed in order to better understand the disease and to investigate potential autologous treatments (to prevent immunogenic rejection). The overall goal of this thesis is to develop an experimental model for FECD using tissue engineering. This was achieved in three steps. 1) An in vitro tissue-engineered FECD model was created and characterized. Briefly, Descemet’s membranes from patients with late-stage FECD undergoing Descemet’s Stripping Automated Endothelial Keratoplasty (DSAEK) were used to isolate and culture FECD endothelial cells. Second or third-passaged FECD endothelial cells were seeded on a previously decellularized human cornea. After 2 weeks in culture, TE-FECD corneas (n=6) were assessed using histology, transmission electron microscopy (TEM) and immunofluorescence labeling of various proteins. TE-FECD endothelium yielded a monolayer of polygonal cells well adhered to Descemet’s membrane. The TE-FECD corneal endothelium expressed the function-related proteins Na+-K+/ATPase α1 and Na+/HCO3-. Clusterin expression was faint and uniform. 2) In order to determine the best surgical procedure to transplant the TE-FECD corneas in the feline model, a DSAEK procedure was evaluated and compared to penetrating keratoplasty technique. DSAEK assessments included surgical challenges and clinical outcomes. DSAEK technique was challenging to perform in the feline model. Rapid fibrin formation was observed in all DSAEK cases (n=5). 3) The in vivo functionality of the TE-FECD corneas was assessed. TE-FECD corneas were grafted in the feline model (n=7) using penetrating keratoplasty procedure and observed for seven days. In vivo assessments included transparency, pachymetry, optical coherence tomography, endothelial cell morphometry, TEM and immunostaining of function-related proteins. After transplantation, pachymetry gradually decreased and transparency gradually increased. Seven days after transplantation, 6 out of 7 grafts were clear. Post-mortem TEM showed subendothelial loose fibrillar material deposition in all TE-FECD grafts. The TE grafted endothelium expressed Na+-K+/ATPase and Na+/HCO3-. This thesis demonstrates that endothelial cells from late-stage FECD corneas can be used to engineer a corneal endothelium. Compared to DSEAK, penetrating keratoplasty is a more appropriate procedure for corneal transplantation in the feline model, since the DSAEK procedure in the feline model presently yields inconsistent clinical results. Restoration of corneal thickness and transparency demonstrates that the TE-FECD grafts are functional in vivo. This novel FECD living model suggests a potential role of tissue engineering for FECD cell rehabilitation. Potential applications are numerous, including pathophysiological and pharmacological studies.