De par son rôle dans de nombreuses fonctions biologiques, la vitamine A est une molécule majeure et cruciale du développement embryonnaire à l’âge adulte. Celle-ci est aussi, à l’heure actuelle, déjà largement utilisée comme agent thérapeutique pour de nombreuses pathologies affectant principalement la peau et les yeux (cancer, acné, psoriasis,brûlures oculaires) et certains cancers. Son action pro-cicatrisante - bien que largement étudiée grâce à de nombreux modèles humains et animaux - reste encore aujourd’hui mal caractérisée quant aux mécanismes d’action moléculaire (régulation de gènes) et cellulaire(migration, prolifération…) qu’elle utilise.Dans le but d’améliorer et de mieux maîtriser l’utilisation de la vitamine A dans le traitement de lésions telles que les brûlures oculaires, ce travail visait d’une part, à étudier, plus en détail,l’effet de l’acide tout-trans rétinoïque ou ATRA - dérivé le plus actif - sur la cicatrisation de ’épithélium cornéen en utilisant un modèle in vivo de brûlures cornéennes par base chez la souris. Son but était également de déterminer par quels processus cellulaires, l’ATRA agit, en utilisant cette fois-ci un modèle in vitro (cellules épithéliales cornéennes humaines). Enfin,nous nous sommes intéressés à la régulation de gènes cibles par l’ATRA au niveau de la sphère oculaire, connus pour être impliqués dans la dynamique de la MEC.Ainsi, nous avons démontré que l’ATRA permettait la cicatrisation de l’épithélium cornéen en agissant principalement sur la migration cellulaire. Puis nous avons identifié un gène :LOXL4 - membre de la famille des lysyl oxydases - dont l’expression est induite par l’ATRA,et nous avons prouvé que son rôle était essentiel dans la cicatrisation cornéenne, décrivant ainsi pour la première fois un lien génique direct et protéique entre la vitamine A, substance active et son action clinique pro-cicatrisante. / Because of its role in many biological functions, Vitamin A is a major and crucialmolecule from development to adulthood. Currently, it is largely used as therapeutic agent inseveral eye or skin pathologies (acne, psoriasis, ocular burns) and cancers. Its pro-healingproperties have been largely studied in human and animal models but molecular (generegulations) and cellular (migration, proliferation…) mechanisms of the vitamin A actionhave to be more detailed.In order to better improve and control its use in the treatment of lesions such as ocular burns,this work aimed to study, more in details, the effects of atRA (all-trans-retinoic acid), activederivative form of vitamin A, on corneal epithelium healing using an in vivo model of alkaliocular burns in mouse and then, to determine by which cellular process atRA acts, by usingthis time, an in vitro model (human corneal epithelial cells). Finally, we were interested intargeting genes regulation by atRA in the ocular sphere, specially known to be implied in theECM dynamic.First, we demonstrated that atRA improves corneal epithelium wound healing, essentially byacting on migration. Then, we identified a gene, LOXL4, member of the lysyl oxidase family,which expression is induced by atRA and we proved that this one is essential in cornealwound healing, describing for the first time a direct gene and protein link between vitamin A,active substance, and its clinical pro-healing action.

Le tégument est formé de deux tissus, un épithélium et un mésenchyme. Il comprend la peau et la cornée. Au niveau de la face, ces derniers ont une origine embryonnaire commune: ectoderme et cellules des crêtes neurales. J'ai tout d'abord contribué à la mise en évidence de l'acquisition par le derme embryonnaire de ses capacités inductrices sur l'épiderme, et de l'indépendance de la différenciation de l'épithélium cornéen vis-à-vis de son mésenchyme, le stroma. Mes travaux principaux ont été d'établir quelle était la signature moléculaire du programme cornéen, et à quel moment et comment ce programme est mis en place chez l'embryon. La comparaison des transcriptomes des cellules souches de la cornée à celui des cellules souches épidermiques chez la souris montre 3621 gènes communs et 1768 gènes cornéens propres, en plus de Pax6, le gène clé de l'oeil, et de K12, la kératine type de la différenciation terminale de l'épithélium cornéen. La cornée résultant, selon un dogme ancien, d'une induction par le cristallin, j'ai effectué des expériences chez l'embryon de poulet de 2 jours afin de le vérifier. L'ablation chirurgicale de la placode cristallinienne ayant mis en évidence sa régénération, j'ai prévenu sa formation en électroporant Gremlin, un inhibiteur de BMP4, requis lors la spécification du cristallin par la vésicule optique. L'obtention d'oeil sans cristallin mais avec un épithélium cornéen exprimant K12 montre que le programme cornéen s'effectue par défaut lorsque le programme cristallinien est interrompu. Cet arrêt se produit normalement à la périphérie de la placode cristallinienne qui s'invagine, lors de la migration des cellules des crêtes neurales, productrices de Gremlin. Les précurseurs de l'épithélium cornéen sont donc communs avec ceux du cristallin, qui sont connus pour se ségréger chez l'embryon lors de la formation du domaine préplacodal au stade neurula.

De par son rôle dans de nombreuses fonctions biologiques, RAGE est une récepteur membranaire crucial du développement embryonnaire jusqu’à l’âge adulte. Ce récepteur multi-ligand est capable d’activer de nombreuses cascades de signalisation, lui permettant entre autres d’être impliqué dans les processus inflammatoires et cicatriciels. Bien que décrite, son action cellulaire et moléculaire dans les processus de régénération/cicatrisation reste encore à éclaircir, malgré des études déjà menées sur les épithéliums cutanée et pulmonaire. Concernant la cicatrisation de l’épithélium cornéen, l’action de ce récepteur et de ses ligands est peu documentée et largement controversé. Ce travail a permis de tester l’effet de 2 ligands de RAGE (HMGB1 et AGEs) sur la cicatrisation de l’épithélium cornéen en utilisant un modèle in vitro de cellules épithéliales de cornée humaine (HCE). Il visait aussi à étudier les cascades de signalisation et les processus cellulaire mis en jeu suite à l’activation de ce récepteur. Les résultats obtenus ont tout d’abord permis de démontrer que l’action pro-cicatrisante du récepteur RAGE sur des cellules de l’épithélium cornéen, était ligand et dose spécifique. Ainsi seul le ligand AGEs promeut la cicatrisation indépendamment des processus de migration et de prolifération cellulaire. Dans cette étude le couple AGEs/RAGE est capable d’activer la cascade de signalisation NF-κB et la transcription d’un gène cible Connexine 43, dont le rôle a déjà été décrit durant la cicatrisation.Malgré la complexité du « signal RAGE », les premières pistes apportées par cette étude permettent d’envisager dans un futur proche la caractérisation précise de son action pro-cicatrisante au niveau de la sphère oculaire. Ceci passera non seulement par l’étude exhaustive des cascades de signalisations activées et des gènes régulés mais aussi par l’utilisation du modèle animal souris sauvage et RAGE -/-. / Because of its role in many biological functions, RAGE is a crucial transmembranous receptor from development to adulthood. This multiligand receptor can activate numerous signaling pathways, and it is involved in inflammatory and wound healing processes. Although already describe, molecular and cellular processes involved during wound healing still to be clarify despite some studies conducted on skin and lung epithelium. In the corneal epithelium wound healing, RAGE and its ligands effects still poorly understood and widely controversial. This work allowed the test of 2 ligands (HMGB1 and AGEs) on corneal epithelium healing using an in-vitro model of human corneal epithelial cells (HCE). It also aims to study the signaling pathways and cellular processes involved after this receptor activation. Results obtained permit to demonstrate a ligand and dose-dependent action of RAGE during this pro-healing process. Thus, only AGEs ligand promotes wound healing independently of cellular migration and proliferation processes. In this study, AGEs/RAGE couple can activate NF-kB signaling pathway and Connexin 43 target gene expression, already describe to be involved in wound healing. Despite the “RAGE signal” complexity, first tracks brought by this study allow to plan in the near future the precise elucidation of its pro-healing properties in the ocular sphere. This will pass not only by the exhaustive study of the signaling pathways activated and the regulated genes but also by the use of wild-type and RAGE - / - mouse model.

La cécité d’origine cornéenne est Ia deuxième cause de cécité dans le monde. Son traitement de choix est la kératoplastie. ll est aujourd’hui nécessaire de réfléchir à de nouvelles solutions pour remplacer la kératoplastie dans sa forme actuelle qui bien que satisfaisante, n’est pas totalement parfaite. En effet, les techniques actuelles de kératoplastie utilisent une allogreffe. Le greffon va subir chez le donneur une diminution de la densité des cellules endothéliales (CE) du greffon au fil du temps. Ce travail présente successivement les solutions abordées par le BiiGC pour produire des CE en masse ainsi que les différents supports en vue d’une kératoplastie lamellaire postérieure. Les solutions envisagées par le laboratoire BiiGC doivent permettre un transfert à l’être humain dans des conditions de sécurité et d’acceptabilité maximales. Les différents contrôles de l’identité des cellules obtenues et les contrôles de sécurité nécessitent une connaissance robuste de la biologie, du morphotype et du phénotype des CE cornéennes. Cette thèse présente les différentes exigences réglementaires et de qualité nécessaires à l’obtention de greffons cornéens bioengineerés. Le choix du BiiGC devant se conformer d’emblée à ces exigences en vue d’un transfert à l’être humain. Dans une première partie, nous présentons une revue de la littérature sur le bioengineering de greffons cornéens. La production de CE et de stroma seront ensuite exposés avec les différentes approches abordées par le BiiGC. Enfin, les différentes techniques de validation morphologiques et fonctionnelles de greffons obtenus seront présentées. / Corneal diseases are the first leading cause of blindness worldwide. Its treatment relies on keratoplasty which in its actual form is a satisfying but not a perfect solution. We have to think about new solutions for corneal graft. Today, corneal graft is often an allograft. With this technique, there is a loss of endothelial cell (EC) density through time. This work presents the solutions which BiiGC laboratory is working on for mass production of EC and different carriers for these cells for posterior keratoplasty. These solutions must be possible on human being with safety conditions. Controls of identity, of obtained cells and security controls need a strong knowledge of biology, morphology and phenotype of EC. This work presents the legal conditions of quality needed to obtain bioengineered corneal grafts. The choice of BiiGC laboratory must involve these conditions for a transfer to human being. In a first part, we present a review of the literature about corneal bioengineering. Production of EC and of corneal stroma are discussed with different approaches by BiiGC laboratory. In the end, the different techniques of morphological controls of corneal grafts are discussed.

La bioimpression assistée par laser (LAB) permet de positionner des gouttesde cellules avec une précision micrométrique. Il est ainsi possible de donner uneorganisation initiale aux cellules au sein d’une structure tissulaire 3D. Notre objectif estd’utiliser le LAB pour reproduire l’histo-architecture du stroma cornéen. Le stroma cornéenest un assemblage transparent de lamelles d’une épaisseur totale de 500 μm. Au sein dechaque lamelle, les fibres de collagène ont une même direction, un même diamètre et sontrégulièrement espacées grâce à la présence de protéoglycanes spécifiques du stromacornéen. Pour reproduire cette organisation, nous avons fait l’hypothèse qu’en alignant desfibroblastes du stroma sur un hydrogel de collagène à l’aide du LAB, il serait possibled’aligner les fibres de collagène dans la même direction. Du fait que les cellules impriméessont vivantes et dynamiques, le motif cellulaire initialement imprimé est soumis à desprocessus d’auto-organisation. Il a donc fallu déterminer les paramètres, à la foisd’impression et de culture, permettant d’obtenir de façon reproductible des alignements decellules stables dans le temps. Grâce à la microscopie à génération de secondeharmonique, le remaniement des fibres de collagène par les fibroblastes cornéens a pu êtreobservé. La direction des fibres de collagène correspond à celle de l’alignement cellulaire.En imprimant les fibroblastes de cornée sur des couches successives de collagène, noussommes parvenus à reproduire les variations de direction des fibres de collagène d’unelamelle à l’autre qui sont observées dans le stroma cornéen natif. / Laser-Assisted Bioprinting allows positioning of cell droplets with amicrometric precision. It is thus possible to give an initial organization to the cells within a3D tissue structure. Our objective is to use LAB to reproduce the corneal stroma histoarchitecture.The corneal stroma is a transparent assembly of lamellae with a totalthickness of 500 μm. Within each lamella, collagen fibers have the same direction, thesame diameter, and a regular spacing thanks to the presence of proteoglycans which arespecific from the corneal stroma. To reproduce this organization, we make the hypothesisthat through corneal fibroblasts alignment, using LAB, on a collagen hydrogel, it would bepossible to align collagen fibers in the same direction. Because printed cells are alive anddynamic, the cell pattern initially printed is subjected to self-organization processes. It isthus necessary to determine the printing and culture parameters that promote reproducibleand stable cell alignments. By using second harmonic generation microscopy, collagenfiber reorganization by corneal fibroblasts has been observed. Collagen fiber direction ismatching with cell alignment. Corneal fibroblasts have been printed on successive collagenlayers; it allows reproducing the variations in collagen fiber direction from one lamella toanother that are observed in the native corneal stroma.

La greffe de Membrane Amniotique Humaine (MAH) permet la cicatrisation des ulcères pré-perforants de la cornée et de sauver un nombre significatif d'yeux victimes de brûlures chimiques. La MAH est un matériel biologique, son utilisation pour le traitement des maladies de la surface oculaire donne de bons résultats en raison de sa capacité à réduire l'inflammation et promouvoir une épithélialisation rapide. Pour son utilisation en clinique, la MAH doit bien évidemment être stérile, mais aussi facile à transporter du centre préleveur au centre greffeur, et stockable longtemps et facilement. Actuellement en routine à la banque de tissus de Rouen, la membrane amniotique est séparée de l’amnios puis dénudée de leur couche spongieuse. Par la suite cette membrane est conservée par cryopréservation (congélation à –80°C) ce qui complique potentiellement l’acheminement des membranes. Par conséquent, dans le cadre de cette étude avec la Banque Normande de Cornées du CHU de Rouen nous avons développé la lyophilisation des MAH pour faciliter son utilisation et sa distribution. L’étude du mapping de la MAH permettra également de déterminer si le taux de facteurs de croissance est homogène dans la MAH ou s’il dépend sa distance par rapport au cordon ombilical. L’étude de la biocompatibilité in vivo d’un deuxième matériau composé de collagène nous permet également d’envisager une alternative pour une implantation du stroma. Nos analyses protéiques (ELISA et Label-free) des MAH la lyophilisées ne montrent pas de différence significative en terme de quantité et de qualité protéique. L’approche protéomique est complétée par l’analyse de la capacité des cellules épithéliales de cornée humaines (CEC) à se multiplier sur la membrane amniotique lyophilisée in vitro. Nous n’avons pas observé de différence entre la croissance des cellules épithéliales sur la MAH lyophilisée ou congelée. L’analyse du total de protéines extraites montre également que la lyophilisation ne dégrade pas les MAH au niveau protéique.Au niveau structurel les résultats de la microscopie électronique ont montré que la structure du stroma de la MAH est impactée par la lyophilisation. La greffe des MAH a été réalisée sur les ulcères cornéens chez le lapin. Au cours de l’expérimentation les lapins n’ont pas montré de signe d’inflammation, les analyses histologiques ont mis en évidence l’épithélialisation de la surface oculaire. Ce projet est en collaboration avec l‘association ophtalmo sans frontière pour qu’à terme le développement de l’utilisation clinique des MAHL répondant notamment à des besoins humanitaires (Cameroun). Notre étude de la cartographie de la MAH a également montré qu’une variabilité en termes de quantité de protéine existe entre les différents donneurs. Dans cette étude nous avons également montré que la couche spongieuse est une source de facteurs de croissance importante dans le processus de cicatrisation des ulcères cornéens. / The Human Amniotic Membrane (HAM) graft allows the healing of corneal ulcers and rescues a significant number of eyes with chemical burn. HAM is a biological material, its use for the treatment of ocular surface diseases gives good results because of its ability to reduce inflammation and promote rapid epithelialization. For its clinical use, the HAM must of course be sterile, but also easy to transport from the sampling center to the transplant center, and easily storable and for a long time. Currently on routine in the tissue bank of Rouen, the amniotic membrane is separated from the amnion and denuded of its spongy layer. Subsequently this membrane is stored by cryopreservation (freezing at -80 ° C) which potentially complicates the delivery of membranes. Consequently, as part of this study with the Banque Normande de Cornées of Rouen University Hospital, we have developed freeze-drying of HAM to facilitate its use and distribution. The HAM mapping study will also determine whether the level of growth factors is homogeneous in the HAM or whether it depends on its distance from the umbilical cord. The study of the in vivo biocompatibility of a second material composed of collagen also allows us to consider an alternative for implantation at the level of the stroma. Our protein analyzes (ELISA and Label-free) of freeze-dried HAM do not show any significant difference in terms of quantity and protein quality. The proteomic approach is complemented by the analysis of the ability of human corneal epithelial cells (CECs) to multiply on the freeze-dried amniotic membrane in vitro. We did not observe any difference between the epithelial cells growths on freeze-dried or frozen HAM. The analysis of the extracted protein total also shows that freeze-drying does not degrade the HAM at the protein level. At the structural level the electron microscopy results showed that the structure of the MAH stroma is impacted by freeze-drying. The MAH transplant performed on corneal ulcers in rabbits was performed. During the experiment the rabbits did not show any sign of inflammation, the histological analyzes highlighted the epithelialization of the ocular surface.This project is in collaboration with OSF association for the development of the clinical use of MAHL responding in particular to humanitarian needs (Cameroon). Our study of HAM mapping also showed that variability in terms of amount of protein exists between different donors. We have also shown that the spongy layer is an important source of important growth factor in the healing process of corneal ulcers.

Nous proposons de construire un atlas numérique 3D contenant les caractéristiques moyennes et les variabilités de la morphologie d’un organe. Nos travaux seront appliqués particulièrement à la construction d'un atlas numérique 3D de la totalité de la cornée humaine incluant la surface antérieure et postérieure à partir des cartes topographiques fournies par le topographe Orbscan II. Nous procédons tout d'abord par normalisation de toute une population de cornées. Dans cette étape, nous nous sommes basés sur l'algorithme de recalage ICP (iterative closest point) pour aligner simultanément les surfaces antérieures et postérieures d'une population de cornée vers les surfaces antérieure et postérieure d'une cornée de référence. En effet, nous avons élaboré une variante de l'algorithme ICP adapté aux images (cartes) de cornées qui tient compte de changement d'échelle pendant le recalage et qui se base sur la recherche par voisinage via la distance euclidienne pour établir la correspondance entre les points. Après, nous avons procédé pour la construction de l'atlas cornéen par le calcul des moyennes des élévations de surfaces antérieures et postérieures recalées et leurs écarts-types associés. Une population de 100 cornées saines a été utilisée pour construire l'atlas cornéen normal. Pour visualiser l’atlas, on a eu recours à des cartes topographiques couleurs similairement à ce qu’offrent déjà les systèmes topographiques actuels. Enfin, des observations ont été réalisées sur l'atlas cornéen reflétant sa précision et permettant de développer une meilleure connaissance de l’anatomie cornéenne. / We propose to build a 3D digital atlas which contains the average characteristics and variability of the morphology of an organ. In particular our work consists in the construction of a 3D digital atlas of the entire human cornea including anterior and posterior surfaces. The atlas was built using topographies provided by the Orbscan II system. First, we normalized the given population of corneas using a variant of the ICP (iterative closest point) algorithm for shape registration to fit simultaneously the anterior and posterior surfaces with the anterior and posterior surfaces of a reference cornea. Indeed, we developed a specific algorithm for corneas topographies that considers scaling during registration and which is based on neighborhood search via the Euclidean distance to find the correspondence between points. After that, we built the corneal atlas by averaging elevations of anterior and posterior surfaces and by calculating their associated standard deviations. A population of 100 healthy corneas was used to construct the normal corneal atlas. To illustrate the atlas, we used topographic color maps like those already offered by existing topographic systems. Finally, observations were made on the corneal atlas that reflects its precision and allows to develop a better understanding of corneal anatomy.

Le contrôle qualité réalisé sur les cornées en organoculture dans les banques de cornées est primordial pour l'évaluation de la qualité des greffons. Dans une première partie, nous avons montré, sur 505 cornées en routine, que les paramètres mesurés avec notre analyseur d'images Sambacornea (CV de taille et hexagonalité cellulaire endothéliale) étaient tout à fait cohérents avec ceux mesurés en microscopie spéculaire in vivo chez les patients. Notre dispositif fournit une méthode fiable, validée pour la mesure de la densité cellulaire endothéliale DCE et de la morphométrie cellulaire. Dans une deuxième partie, nous avons analysé les erreurs inhérentes à la méthode de comptage à cadre fixe (grille calibrée ou réticule) lors de la mesure de la DCE par les banques de cornées. Nous avons mesuré sur 3000 zones, la DCE de 20 mosaïques cornéennes gravées, en utilisant des grilles dont la maille variait de 50 à 300 µm. La méthode était répétable avec des grilles de 200 µm à condition de considérer la moyenne sur 10 comptages et présentait une variabilité résiduelle de 5 % vs la DCE réelle. Les grilles classiques de 100 µm utilisées en comptage manuel devraient être abandonnées et remplacées par des grilles de 200 µm. L'analyse d'images numériques demeure cependant la meilleure solution. Dans une troisième partie, le développement d'un dispositif de mesure de la transparence et des diamètres utiles en greffe de cornée (cornée claire et diamètre total) est décrit. La transparence est appréciée via la mesure de la fonction de modulation de transfert à travers la cornée sur une mire originale dessinée dans notre laboratoire. Les mesures étaient reproductibles. D'après l'analyse de 358 cornées en routine, la transparence n'était pas corrélée à l'âge du donneur, ni à la DCE, et baissait au fil de la conservation. Ce dispositif simple et objectif permet de standardiser la "transparence" ; il devra être redéployé sur notre bioréacteur, et pourrait mener à la définition d'un seuil de transparence

Nous proposons de construire un atlas numérique 3D contenant les caractéristiques moyennes et les variabilités de la morphologie d’un organe. Nos travaux seront appliqués particulièrement à la construction d'un atlas numérique 3D de la totalité de la cornée humaine incluant la surface antérieure et postérieure à partir des cartes topographiques fournies par le topographe Orbscan II. Nous procédons tout d'abord par normalisation de toute une population de cornées. Dans cette étape, nous nous sommes basés sur l'algorithme de recalage ICP (iterative closest point) pour aligner simultanément les surfaces antérieures et postérieures d'une population de cornée vers les surfaces antérieure et postérieure d'une cornée de référence. En effet, nous avons élaboré une variante de l'algorithme ICP adapté aux images (cartes) de cornées qui tient compte de changement d'échelle pendant le recalage et qui se base sur la recherche par voisinage via la distance euclidienne pour établir la correspondance entre les points. Après, nous avons procédé pour la construction de l'atlas cornéen par le calcul des moyennes des élévations de surfaces antérieures et postérieures recalées et leurs écarts-types associés. Une population de 100 cornées saines a été utilisée pour construire l'atlas cornéen normal. Pour visualiser l’atlas, on a eu recours à des cartes topographiques couleurs similairement à ce qu’offrent déjà les systèmes topographiques actuels. Enfin, des observations ont été réalisées sur l'atlas cornéen reflétant sa précision et permettant de développer une meilleure connaissance de l’anatomie cornéenne. / We propose to build a 3D digital atlas which contains the average characteristics and variability of the morphology of an organ. In particular our work consists in the construction of a 3D digital atlas of the entire human cornea including anterior and posterior surfaces. The atlas was built using topographies provided by the Orbscan II system. First, we normalized the given population of corneas using a variant of the ICP (iterative closest point) algorithm for shape registration to fit simultaneously the anterior and posterior surfaces with the anterior and posterior surfaces of a reference cornea. Indeed, we developed a specific algorithm for corneas topographies that considers scaling during registration and which is based on neighborhood search via the Euclidean distance to find the correspondence between points. After that, we built the corneal atlas by averaging elevations of anterior and posterior surfaces and by calculating their associated standard deviations. A population of 100 healthy corneas was used to construct the normal corneal atlas. To illustrate the atlas, we used topographic color maps like those already offered by existing topographic systems. Finally, observations were made on the corneal atlas that reflects its precision and allows to develop a better understanding of corneal anatomy.

Le contrôle qualité réalisé sur les cornées en organoculture dans les banques de cornées est primordial pour l'évaluation de la qualité des greffons. Dans une première partie, nous avons montré, sur 505 cornées en routine, que les paramètres mesurés avec notre analyseur d'images Sambacornea (CV de taille et hexagonalité cellulaire endothéliale) étaient tout à fait cohérents avec ceux mesurés en microscopie spéculaire in vivo chez les patients. Notre dispositif fournit une méthode fiable, validée pour la mesure de la densité cellulaire endothéliale DCE et de la morphométrie cellulaire. Dans une deuxième partie, nous avons analysé les erreurs inhérentes à la méthode de comptage à cadre fixe (grille calibrée ou réticule) lors de la mesure de la DCE par les banques de cornées. Nous avons mesuré sur 3000 zones, la DCE de 20 mosaïques cornéennes gravées, en utilisant des grilles dont la maille variait de 50 à 300 µm. La méthode était répétable avec des grilles de 200 µm à condition de considérer la moyenne sur 10 comptages et présentait une variabilité résiduelle de 5 % vs la DCE réelle. Les grilles classiques de 100 µm utilisées en comptage manuel devraient être abandonnées et remplacées par des grilles de 200 µm. L'analyse d'images numériques demeure cependant la meilleure solution. Dans une troisième partie, le développement d'un dispositif de mesure de la transparence et des diamètres utiles en greffe de cornée (cornée claire et diamètre total) est décrit. La transparence est appréciée via la mesure de la fonction de modulation de transfert à travers la cornée sur une mire originale dessinée dans notre laboratoire. Les mesures étaient reproductibles. D’après l’analyse de 358 cornées en routine, la transparence n'était pas corrélée à l’âge du donneur, ni à la DCE, et baissait au fil de la conservation. Ce dispositif simple et objectif permet de standardiser la «transparence» ; il devra être redéployé sur notre bioréacteur, et pourrait mener à la définition d'un seuil de transparence / The corneal quality control (QC) in eye banks is essential for the assessment of the quality of grafts. In the first part, we showed on 505 consecutive corneas, that the parameters measured by our image analyzer Sambacornea (size CV and hexagonality of endothelial cells) were entirely consistent with those measured by specular microscopy in vivo in patients. Our device provides a reliable validated method for the measurement of the Endothelial Cell Density ECD and cell morphometry. In a second part, we analyzed the inherent errors of the fixed-frame counting method (calibrated grid or graticule) for corneal ECD in eye banks. We measured in 3000 areas, the 20 corneal mosaic ECD using grids ranged from 50 to 300 µm. The method was repeatable with 200 µm long grids if the average of 10 counts were used: it showed a residual variability of 5 % vs the real ECD. Conventional 100 µm long grids used in manual counting should be abandoned and replaced by 200 µm grids. The digital image analysis, however, is the best solution. In the third part, the development of a device for measuring the transparency and effective diameters in corneal transplantation (clear cornea and total diameter) is described. Transparency is assessed by measuring the modulation transfer function through the cornea on an original pattern designed in our laboratory. The measurements were reproducible. Based on the analysis of 358 corneas routine, transparency was not correlated with donor age, or the ECD, and decreased with duration of stockage. This simple and objective device standardizes the QC "transparency" and it should be used with our bioreactor, and could lead to the definition of a level for transparency