As espécies forrageiras alfafa e cornichão são importantes plantas utilizadas durante o período hibernal nas pastagens do Rio Grande do Sul, reunindo características desejadas, como alto valor nutritivo, elevada produção de forragem, boa aceitabilidade e digestibilidade. No entanto, no Brasil, existe uma carência de trabalhos que visem à seleção e caracterização de estirpes de rizóbio em alfafa e cornichão que sejam mais competitivas e tenham alta capacidade de nodulação e fixação de nitrogênio. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi selecionar rizóbios eficientes na fixação biológica de nitrogênio em simbiose a Lotus corniculatus e Medicago sativa. Especificamente, os objetivos são: (a) isolar e caracterizar genética e fenotipicamente rizóbios isolados de alfafa e cornichão; (b) avaliar a produção de ácido indol-acético e sua influência na germinação de sementes de arroz; (c) selecionar rizóbios mais eficientes em alfafa; (d) selecionar a campo rizóbios para cornichão; (e) avaliar o efeito do nitrogênio na simbiose de rizóbio e alfafa. Foram realizados experimentos, em casa de vegetação, em laboratório e a campo, com plantas de L. corniculatus e M. sativa. Os rizóbios isolados de alfafa foram identificados como pertencentes às espécies de Sinorhizobium meliloti e Rhizobium sp. Alguns isolados de alfafa foram capazes de produzir ácido indol-acético e estimular o crescimento de sementes de arroz. Os isolados UFRGS Ms98, Ms63, Ms208 e Ms204 apresentaram índice de eficiência relativa da fixação de nitrogênio superiores aos das estirpes recomendadas para inoculação de M. sativa, indicando um bom potencial destes isolados para estudos a campo. O isolado de rizóbio nativo UFRGS Lc322 e a estirpe U510 foram mais eficientes na fixação biológica de nitrogênio, em condições de campo, do que a estirpe SEMIA 816, recomendada para cornichão no país. O aumento da dose de nitrogênio afetou a interação entre rizóbios e alfafa, no entanto foi possível selecionar o isolado UFRGS Ms208 como mais tolerante ao nitrogênio mineral. / Alfalfa and birdsfoot forages are important plants used during the pastures’ hibernal period of Rio Grande do Sul, gathering desired traits such as high nutritional value, high forage production, good acceptability and digestibility. However, in Brazil, there is a lack of studies aiming the selection and characterization of Rhizobium strains in alfalfa and birdsfoot that are more competitive and have high capacity for nodulation and nitrogen fixation. Thus, the objective of this study was to select Rhizobia efficient in biological nitrogen fixation in symbiosis with Lotus corniculatus and Medicago sativa. Specifically, the objectives were: (a) to isolate and characterize genetically and phenotypically Rhizobia from alfalfa and birdsfoot; (b) to evaluate the production of indole acetic acid and its influence on germination of rice seeds; (c) to select the most efficient Rhizobia in alfalfa; (d) to select Rhizobia for birdsfoot in field; (e) to evaluate the effect of nitrogen in the symbiosis of Rhizobium and alfalfa. Experiments were performed, in a greenhouse, in laboratory and in field conditions, with L. corniculatus and M. sativa. The Rhizobia isolated from alfalfa were identified as belonging to the species of Sinorhizobium meliloti and Rhizobium sp. Some strains of alfalfa were able to produce indole acetic acid and stimulate the growth of rice seeds. The isolates UFRGS Ms98, Ms63, Ms208 and Ms204 showed efficiency index for nitrogen fixation higher than the strains recommended for inoculation of M. sativa, indicating a good potential of these isolates for field studies. The isolated of the native Rhizobium UFRGS Lc322 and the strain U510 were more efficient in nitrogen fixation in field conditions than SEMIA 816 strain, recommended for birdsfoot in the country. The increasing in the nitrogen dose affected the interaction between Rhizobia and alfalfa, but it was possible to select UFRGS Ms208 isolate as the most tolerant to mineral nitrogen.

A utilização de pastagens capazes de tolerar o alumínio em níveis elevados apresenta-se como uma alternativa viável para contornar um dos principais problemas existentes em áreas de cultivo com solos ácidos. Entre as leguminosas forrageiras, o cornichão (Lotus corniculatus L.) destaca-se pela sua qualidade nutricional e versatilidade de adaptação. Em função disso, esse trabalho foi desenvolvido com o objetivo de selecionar plantas de L. corniculatus tolerantes ao alumínio, bem como analisar a diversidade genética existente entre estes materiais com o auxílio de marcadores moleculares do tipo microssatélites. Foram utilizados três genótipos de cornichão (Draco, São Gabriel e UFRGS) em solução nutritiva, contendo 200µmol/L de cálcio (CaCl2.2H2O), 100 µmol/L de alumínio (AlCl3) e pH controlado em uma faixa de 4,1 - 4,3. Realizaram-se dois ciclos de seleção, sendo as plântulas selecionadas pelo comprimento final das radículas. Posteriormente, testou-se o progresso alcançado pelos ciclos de seleção através de um experimento em solução nutritiva, semelhante ao utilizado nas seleções, com as populações originais e melhoradas, em quatro concentrações de alumínio (0, 50, 100 e 150 µmol/L) (AlCl3). Foram avaliados o comprimento inicial, final e o crescimento das radículas. Após o término do segundo ciclo de seleção, realizou-se a análise da diversidade genética existente entre os genótipos de cornichão estudados. Foram utilizados 18 pares de primers desenvolvidos para Lotus japonicus (Regel) Larsen e Trifolium repens L. As similaridades genéticas, com base no coeficiente de Jaccard, foram utilizadas para fazer o agrupamento dos genótipos pelo método UPGMA, através do programa NTSYS pc 2.1. O número de alelos e o conteúdo de informação de polimorfismo (PIC) também foram calculados para cada loco. A seleção em solução nutritiva mostra-se eficiente na seleção de plântulas de cornichão tolerantes ao alumínio. Os materiais analisados apresentam diferenças em relação a esta característica, destacando-se como o genótipo mais tolerante UFRGS F2, proveniente de dois ciclos de seleção. Os marcadores microssatélites revelam-se adequados para acessar a variabilidade genética entre os genótipos de L. corniculatus. / The use of grasslands capable to tolerate high levels of aluminum is a viable alternative to bypass one of the main problems existing in cultivated areas with acid soils. Among the forage legumes, the birdsfoot trefoil (Lotus corniculatus L.) stands out for its nutritional quality and versatility of adaptation. Given the importance, this work was carried out to select plants of L. corniculatus tolerant to aluminum, and analyze the genetic diversity between these materials with the aid of microsatellite molecular markers. Three genotypes of birdsfoot trefoil were used (Draco, São Gabriel and UFRGS) in nutrient solution containing 200 µmol/L of calcium (CaCl2.2H2O), 100 µmol/L of aluminum (AlCl3) and controlled in a pH range of 4.1 - 4.3. Two selection cycles were made, where the seedlings were selected by the root length. Subsequently, the progress achieved by cycles of selection was tested in an experiment in nutrient solution, similar to that used in the selections, with the original and improved populations, in four concentrations of aluminum (0, 50, 100 and 150 µmol/L) (AlCl3). The initial, final and the growth of the radicle were evaluated. After the end of the second cycle of selection it was carried out the analysis of genetic diversity among genotypes of birdsfoot trefoil studied. Eighteen pairs of primers developed for Lotus japonicus (Regel) Larsen and Trifolium repens L. were used. The genetic similarities based on Jaccard coefficient was used to make the grouping of genotypes by the UPGMA method, using the program NTSYS pc 2.1. The number of alleles and the polymorphism information content (PIC) were calculated for each locus. The selection in nutrient solution was efficient in the selection of seedlings of birdsfoot trefoil tolerant to aluminum. The materials analyzed differ for this characteristic, with the genotype UFRGS F2, being the most tolerant. The microsatellite markers are suitable for accessing the genetic variability among genotypes of L. corniculatus.

O presente trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar e selecionar genótipos de alfafa crioula e de cornichão cultivar São Gabriel para aptidão ao pastejo. Neste trabalho, foi proposto o termo aptidão ao pastejo em substituição à resistência ao pastejo. O procedimento padrão utilizado no processo de seleção e de caracterização dos genótipos constou de experimentos nos quais as plantas eram submetidas a uma pressão de pastejo elevada e contínua (3-5 cm de altura do resíduo). Houve diferença (P<0,05) na sobrevivência das diferentes populações de alfafa crioula, evidenciando variabilidade para a aptidão ao pastejo, o que não se evidenciou de forma consistente para o cornichão, que, no entanto, apresentou uma maior porcentagem de sobrevivência em comparação com a alfafa. A avaliação das características morfofisiológicas em alfafa não evidenciou diferenças (P>0,05) na contração das coroas, área da coroa e da raiz, área foliar residual e específica, número de hastes por planta, tipo de haste predominante (basilar ou axilar) e reservas orgânicas. Foram evidenciadas diferenças (P<0,05) no comprimento do entrenó e no índice de gemas específicas, proposto neste trabalho como descritor funcional da aptidão ao pastejo. Ensaios em casa-de-vegetação identificaram um marcador morfológico (altura do primeiro nó) nas plântulas de alfafa e de cornichão, capaz de separar precocemente os genótipos contrastantes quanto à aptidão ao pastejo. Foi comparada a efetividade das estirpes de rizóbio recomendadas para o cornichão com a de novas estirpes isoladas, demonstrando a possibilidade de obtenção de estirpes mais eficientes.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Farmácia. / Made available in DSpace on 2012-10-24T20:41:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 261614.pdf: 631140 bytes, checksum: ff121f74c5bc6020d896f00ab345d6e4 (MD5) / A Lotus corniculatus (Fabaceae) é distribuída em muitas regiões do mundo e possui grande valor agronômico por seus constituintes: proantocianidinas, flavonoides e ácido oleanólico. Esta planta é utilizada como alimento para o gado proporcionando o aumento no ganho de peso e na produção de leite, além do controle de infecções intestinais parasitárias nos animais. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito anti-inflamatório e antibacteriano do extrato bruto (CE) da Lotus corniculatus v. São Gabriel, frações (hexano (HEX), acetato de etila (AcOEt), butanólica (BuOH) e resíduo aquoso (AF)), e compostos isolados (canferitrin, ácido oleanólico e ß-sitosterol). As partes aéreas da Lotus corniculatus foram secas a temperatura ambiente, e a partir desse material (620 g), foi extraído o extrato bruto (CE) por maceração com etanol 96% por um mês. O solvente foi evaporado resultando em 78 g de extrato bruto (CE). O extrato bruto foi fracionado por extração líquido-líquido utilizando solventes em ordem crescente de polaridade resultando nas frações hexano (HEX), acetato de etila (AcOEt), butanólica (BuOH) e resíduo aquoso (AF). A partir da fração HEX foram isolados o ácido oleanólico e o ß-sitosterol, e a partir da fração AcOEt o canferitrin. Para a avaliação da atividade anti-inflamatória foi utilizado o modelo de pleurisia induzida pela carragenina, em camundongos, e foram avaliados os seguintes parâmetros inflamatórios: concentrações de leucócitos, exsudação, atividade da mieloperoxidase (MPO) e da adenosina-deaminase (ADA), além das concentrações de nitrito/nitrato (NOx) e interleucina-1 beta (IL-1 ). Nesse protocolo experimental, foram utilizados camundongos albinos suíços, os quais foram distribuídos em diferentes grupos e tratados com CE (100 - 400 mg/kg), HEX (50 - 200 mg/kg), AcOEt (100 - 400 mg/kg), BuOH (50 - 200 mg/kg), AF (25 - 200 mg/kg), canferitrin (50 - 100 mg/kg), ácido oleanólico (10 - 100 mg/kg) ou ß-sitosterol (10 - 100 mg/kg) 0,5 h antes da administração da carragenina (1%, i.pl.). Os parâmetros inflamatórios foram avaliados 4 h após. Todos os animais, exceto nos experimentos que foram analisadas as atividades enzimáticas, foi administrado previamente (10 min.) Azul de Evans (25 mg/kg, i.v.) a fim de avaliar a exsudação. Dexametasona e indometacina foram utilizados como fármacos anti-inflamatórios de referência. Para a avaliação da atividade antibacteriana, foi utilizada a técnica de microdiluição em caldo para a determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e da concentração bactericida mínima (CBM). Neste protocolo, o material vegetal, o extrato bruto (CE), frações e compostos isolados, foram dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO) e transferidos para uma placa em diluição seriada e, a seguir, o inóculo bacteriano foi adicionado. Gentamicina foi utilizada como fármaco antibacteriano de referência. Diferenças estatísticas entre os grupos, para os parâmetros inflamatórios, foram determinadas pela análise dos testes t de Student ou de variância (ANOVA). Valores de P < 0,05 foram considerados significativos. O extrato bruto da Lotus corniculatus (200 - 400 mg/kg) e frações (50 - 200 mg/kg), assim como os compostos isolados (25 - 100 mg/kg) inibiram: leucócitos, neutrófilos, exsudação, a atividade da MPO e da ADA, além das concentrações de NO e IL-1 (P < 0,05). A indometacina e a dexametasona inibiram todos os parâmetros inflamatórios estudados (P < 0,05). Em relação à atividade antibacteriana, somente as frações HEX e AcOEt, e os compostos isolados ácido oleanólico e canferitrin, revelaram atividade bactericida e/ou bacteriostática. A fração HEX demonstrou moderada atividade antibacteriana (CIM = 100 µg mL-1) para a bactéria Bacillus cereus, e fraca atividade antibacteriana (CIM = 600 a 1000 µg mL-1) para as bactérias Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus epidermidis, Providencia alcalifaciens e Acinetobacter calcoaceticus. A fração AcOEt demonstrou fraca atividade antibacteriana (CIM = 800 µg mL-1) para as bactérias Enterococcus faecalis, Bacillus cereus e Acinetobacter calcoaceticus. O ácido oleanólico revelou boa atividade antibacteriana para Staphylococcus aureus meticilina resistente (CIM = 100 µg mL-1),Listeria monocytogenes e Bacillus cereus (CIM = 25 µg mL1), e o canferitrin demonstrou boa atividade antibacteriana para as bactérias: Staphylococcus epidermidis, Shigella flexinerii, Salmonella typhimurium e Acinetobacter calcoaceticus (CIM = 100 µg mL-1). Este composto demonstrou excelente atividade antibacteriana para as bactérias Enterococcus faecalis (CIM = 3.9 µg mL-1) e Bacillus cereus (CIM = 8.5 µg mL-1). O extrato bruto, frações e compostos isolados da Lotus corniculatus v. São Gabriel demonstraram importante atividade anti-inflamatória e antibacteriana. Os compostos isolados: canferitrin, ácido oleanólico e ß-sitosterol podem ser responsáveis por estes efeitos anti-inflamatório e/ou antibacteriano. The Lotus corniculatus (Fabaceae) is distributed in many regions of the world and has a high agronomic value for its constituted: proanthocyanidins, flavonoids and oleanolic acid. This plant is used as food for cattle providing the enhancement of the weight and of milk production beyond the control of intestinal parasitic infections in the animals. The aim of this study was to evaluate the anti-inflammatory and anti-bacterial effects of crude extract (CE), fractions (hexane (HEX), ethyl acetate (AcOEt), n-butanol (BuOH) and aquous fraction (AF)), and isolated compounds (kaempferitrin, oleanolic acid and ß-sitosterol) from Lotus corniculatus v. São Gabriel. The aerial parts of Lotus corniculatus were dried at room temperature and this material (620 g) the crude extract (CE) was extracted by maceration with ethanol 96% for one month. The solvent was evaporated resulting in 78 g of crude extract (CE). The crude extract was fractionated by liquid-liquid extraction using solvents in growing order of polarity resulting in hexane (HEX), ethyl acetate (AcOEt), n-butanol (BuOH) and aqueous fraction (AF). From the HEX fraction it was isolated the oleanolic acid and the ß-sitosterol and from AcOEt fraction the kaempferitrin. To evaluate the anti-inflamatory activity, it was used the mouse model of pleurisy induced by carrageenan and the following inflammatory parameters were evaluated: leukocytes, exudation, myeloperoxidase (MPO) and adenosine-deaminase (ADA) activities, as well as, nitrite/nitrate (NOx) and interleukin-1 beta (IL-1ß) levels. In this experimental protocol, swiss mice were used in the in vivo experiments, which were distributed in different groups and they were treated with CE (100 - 400 mg/kg), HEX (50 - 200 mg/kg), AcOEt (100 - 400 mg/kg), BuOH (50 - 200 mg/kg), RA (25 - 200 mg/kg), kaempferitrin (50 - 100 mg/kg), oleanolic acid (10 - 100 mg/kg) or ß-sitosterol (10 - 100 mg/kg) 0,5 h before carrageenan (1%,i.pl.). The inflammatory parameters were evaluated 4 h after. All animals, except in the experiments that were analyzed enzymatic activities, the animals were previously pretreated (10 min.) with Evans blue dye (25 mg/kg, i.v.) in order to evaluate the exudation. Dexamethasone and indomethacin were used as anti-inflammatory reference drugs. To evaluate the anti-bacterial activity, it was used the microdilution in broth technical to determine the minimal inhibitory concentraton (MIC) and the minimal bactericidal concentration (MBC) methodology. In this protocol the crude extract (CE), fractions and isolated compounds were dissolved in dimethylsulfoxide (DMSO) and transferred to plate in serial dilution and, after, the bacterial inoculum were added. The gentamicin was used as the anti-bacterial reference drug. To the anti-inflammatory parameters, statistical differences between groups were determined by Student's t test and analysis of variance (ANOVA). Values of P < 0.05 were considered significant. The crude extract of Lotus corniculatus (200 - 400 mg/kg) and fractions (50 - 200 mg/kg), as well as its isolated compound (25 - 100 mg/kg) inhibited: lekocytes, neutrophils and exudation, the MPO and ADA activities, as well as NO and IL-1 levels (P < 0.05). Indomethacin and dexamethasone inhibited all the studied inflammatory parameters (P < 0.05). In regard to the anti-bacterial activity, only the HEX and AcOEt fractions and the isolated compounds, oleanolic acid and kaempferitrin, revealed anti-bacterial and/or bacteriostatic activities. The hexane fraction showed moderate anti-bacterial effect (MIC = 100 µg mL-1) on Bacillus cereus and weak anti-bacterial effect (MIC = 600 to 1000 µg mL-1) on Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus epidermidis, Providencia alcalifaciens and Acinetobacter calcoaceticus. The AcOEt fraction demonstrated a weak anti-bacterial activity (MIC = 800 µg mL-1) on Enterococcus faecalis, Bacillus cereus and Acinetobacter calcoaceticus.The Oleanolic acid, isolated from hexane fraction, exhibited a good anti-bacterial activity on methycillin-resistant Staphylococcus aureus (MIC = 100 µg mL-1), Listeria monocytogenes and Bacillus cereus (MIC = 25 µg mL-1) and the kaempferitrin, a compound isolated from this fraction, demonstrated a good anti-bacterial effect on: Staphylococcus epidermidis, Shigella flexinerii, Salmonella typhimurium and Acinetobacter calcoaceticus (MIC = 100 µg mL-1). This compound showed an excellent anti-bacterial activity on Enterococcus faecalis (MIC = 3.9 µg mL-1) and Bacillus cereus (MIC = 8.5 µg mL-1). The crude extract, fraction and isolated compound from Lotus corniculatus v. São Gabriel, demonstrated important anti-inflammatory and anti-bacterial activities. The isolated compounds: kampferitrin, oleanolic acid and ß-sitosterol can be responsible for these anti-inflammatory and/or anti-bacterial effects.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T00:57:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 289130.pdf: 934362 bytes, checksum: 45e1f5c2bc758369144b6b49b7c34dae (MD5) / O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito anti-inflamatório da Lotus corniculatus no modelo de pleurisia induzida por bradicinina, em camundongos. Materiais e métodos: As partes aéreas da L. corniculatus var. São Gabriel foram secas ao ar e cortadas. Ao material obtido foi adicionado etanol 96% para obter o extrato bruto hidroálcoólico (CE). Este foi fracionado por partição líquido-líquido utilizando hexano, acetato de etila, n-butanol e água, em ordem crescente de polaridade, resultando nas frações hexano (HEX), acetato de etila (AcOEt), butanol (BuOH), e aquosa (Aq). Os compostos 1 e 2 foram isolados das frações HEX e AcOEt por meio de coluna cromatográfica de sílica gel, e identificados como ácido oleanólico e canferitrina. Camundongos albinos suíços foram utilizados nos experimentos e a pleurisia foi induzida por bradicinina (BK), de acordo com metodologia descrita por Saleh et al. (1997). Inicialmente, diferentes grupos de animais foram tratados com diferentes doses de CE (25-200 mg/kg), HEX (5-25 mg/kg), AcOEt (5-25 mg/kg), BuOH (5-25 mg/kg), Aq (5-25 mg/kg), ácido oleanólico (1-5 mg/kg), ou canferitrina (1-10 mg/kg), 0,5 h antes da indução por BK. Os parâmetros inflamatórios (leucócitos, exsudação, atividade das enzimas mieloperoxidase (MPO) e adenosina-deaminase (ADA), e concentrações de nitrato/nitrito (NOx) e interleucina-17A (IL-17A)) foram avaliados 4 h após a indução da pleurisia. Diferenças estatísticas entre os grupos foram determinadas pela analise de variância (ANOVA), complementadas quando necessário, com Dunnett ou teste t de Student. Valores de p < 0,05 foram considerados significantes. Resultados: o CE, suas frações e compostos isolados inibiram significativamente os leucócitos, a exsudação, a atividade das enzimas MPO e ADA, assim como as concentrações de NOx e IL-17A (p < 0,05). Conclusão: A L. corniculatus apresentou importante efeito anti-inflamatório, principalmente pela inibição do influxo de leucócitos e exsudação causada pela BK. Este efeito parece ser em parte mediado pela inibição das enzimas MPO e ADA, e dos mediadores NO e IL-17A. Além disso, os compostos ácido oleanólico e canferitrina parecem ser responsáveis, em parte, pelo efeito anti-inflamatório observado.