La présente étude vise à étudier le potentiel de bifidobactéries à protéger les cellules contre l’infection par le Coxsackie B4 (CV-B4). Le criblage de bifidobactéries a identifié deux des cinq souches qui protégeaient les cellules HEp-2 lorsque les bifidobactéries sont pré-incubées avec les particules virales avant l'inoculation sur les cellules Hep-2. En revanche, aucun effet protecteur n'a été observé en incubant les cellules Hep-2 avec des bifidobactéries avant l'inoculation de CV-B4. Les lipoprotéines des parois cellulaires (LpAs) sécrétées par les souches sélectionnées sont testées pour leur activité antivirale. Les deux LpAs présentaient une activité antivirale quand ils sont incubés avec les particules virales avant d’être inoculées aux cellules HEp-2. Aucun effet protecteur n'a été induit par incubation des LpAs avec les cellules HEp-2 avant l'inoculation de CV-B4. La protéine recombinante présente une activité antivirale identique. Pour identifier les séquences peptidiques interagissant avec les particules virales, les protéines de LpAs sont alignées avec les séquences peptidiques du nord bord du canyon et avec l’empreinte de la région puff sur le Coxsackievirus et sur le récepteur de l’adénovirus (CAR). L'étude d'amarrage moléculaire in silico (Docking) utilisant le CV-B3 en tant que modèle a montré une faible énergie de liaison indiquant un système stable pour les peptides sélectionnés et par conséquent une interaction probable avec le CV-B. Les peptides de B.longum et de B.breve qui sont homologues à l’empreinte du rebord nord viral sur la séquence CAR, forment des liaisons d’hydrogène avec plusieurs résidus viraux dans la région du rebord nord du canyon, qui sont déjà décrits pour leur interaction avec le CAR.En conclusion, les protéines de LPAS bifidobactéries peuvent inhiber l'infection par le CV-B4 probablement par liaison aux acides aminés de la capside qui interagissent avec le CAR. / The present study aims at investigating the potential of bifidobacteria in protecting cells from Coxsackievirus B4 (CV-B4) infection. The bifidobacterial screening identified two out of five strains that protected HEp-2 cell viability when bifidobacteria were incubated with the viral particles prior inoculation. In contrast, no effect was shown by incubating HEp-2 cells with bifidobacteria prior CV-B4 inoculation. Cell-wall lipoproteins secreted by the selected strains (LpAs) were assayed for their anti-viral activity. The two LpAs exhibited anti-viral activity when they were incubated with the viral particles prior inoculation to HEp-2 cells. No effect was induced by incubating LpAs with HEp-2 cells prior CV-B4 inoculation. The recombinant LpAs derived-protein exhibited identical anti-viral activity. To identify the peptide sequences interacting with the virus particles, LpAs proteins were aligned with the peptide sequences of north canyon rim and puff footprint onto coxsackievirus and adenovirus receptor (CAR). The in silico molecular docking study using CV-B3 as template showed a low energy binding indicating a stable system for the selected peptides and consequently a likely binding interaction with CV-B. B.longum and B.breve peptides homologous to the viral north rim footprint onto CAR sequence formed hydrogen bonds with several viral residues in the north rim of the canyon, which were already predicted as interacting with CAR. In conclusion, proteins from bifidobacterial LpAs can inhibit the infection with CV-B4 likely through binding to the capsid aminoacids that interact with CAR.

INKT cells are non-conventional T lymphocytes that are restricted to glycolipid presenting CD1d molecule. iNKT cells express an invariant TCR a chain (Va14-Ja18 in mice and Va28-Ja18 in humans). Their particularity is to rapidly produce copious amounts of cytokines (IFN-? and IL-4) after activation and to activate other cells of the immune system such as dendritic cells, NK cells and T lymphocytes. iNKT cells, therefore, form a bridge between innate and adaptive immune responses. Type 1 diabetes is an autoimmune disease characterized by the destruction of pancreatic ß cells whose role is to produce insulin. While diabetes development can clearly be associated with genetic polymorphisms, environmental factors were also implicated in the etiology of the disease. Numerous studies suggest that viral infections, particularly infections with Coxsackievirus B4 (CVB4), could be implicated in the development of type 1 diabetes. Our study was performed with NOD mice that develop type 1 diabetes around 15 weeks of age and with proinsulin 2 knockout NOD mice (Pro-ins2-/-) which become diabetic around 8 weeks of age. Our results show that CVB4 infection induces accelerated diabetes in around half of NOD and Pro-ins2-/- mice compared to uninfected mice. However, the activation of iNKT cells with their agonist, aGalactosylceramide (aGalCer), at the time of infection greatly decreases diabetes incidence. CVB4 infection induces a strong recruitment of macrophages into the pancreas. Interestingly, iNKT cell activation modifies the function of these macrophages. Indeed, pancreatic macrophages of CVB4 infected mice strongly express IL-1, IL-6 and TNF-a, indicating their pro-inflammatory character. On the contrary, macrophages of mice infected with CVB4 and treated with aGalCer express low levels of these cytokines, but strong levels of suppressive enzymes iNOS (inducible NO synthase), IDO (Indoleamine 2,3-dioxygenase) and arginase I. The use of inhibitors of these enzymes showed that diabetes prevention is induced by IDO. We have also observed that autoreactive T cells strongly infiltrate the pancreatic islets after CVB4 infection. It is interesting to note that the high diabetes incidence of CVB4 infected mice is associated with an increased frequency of IFN-? producing autoreactive T cells in pancreatic islets. On the contrary, the frequency of these cells is very low in infected mice treated with aGalCer. The inhibition of IFN-? production is dependent on IDO enzyme, since the use of its inhibitor strongly increases IFN-? production by anti-islet T cells and diabetes incidence. To summarize, our results show that iNKT cell activation during the infection with CVB4 induces immunosuppressive macrophages in the pancreas. These cells inhibit the function of autoreactive T cells and prevent diabetes development.

Les coxsackievirus du groupe B (CVB) sont des petits virus à ARN appartenant à au genre Enterovirus et à la famille des Picornaviridae. Chez, l’homme, les CVB sont responsables de nombreuses infections aiguës bénignes ou sévères. Ils sont également incriminés dans le développement de maladies chroniques telles que le diabète de type 1 (DT1). En effet, plusieurs données épidémio-cliniques sont en faveur d’un lien entre les entérovirus et notamment les CVB et le DT1. Deux mécanismes majeurs ont été proposés pour expliquer cette pathogenèse entérovirale du DT1. Il s’agit de l’activation « en passant » d’un environnement inflammatoire et la persistance virale qui concourent à l’initiation du processus auto-immun. Les études présentées dans cette thèse visent à comprendre les caractéristiques et conséquences de l’infection à CVB qui pourraient expliquer l’implication de ces mécanismes. Les résultats obtenus suggèrent que CVB4 (utilisé comme modèle des CVB) est un virus inflammatoire. In vitro, il induit la production de grandes quantités d’IFNα par les cellules mononuclées du sang (CMN). Néanmoins cette induction d’IFNα n’est possible qu’en cas de facilitation de l’infection par des anticorps non neutralisants, qui se traduit par une entrée importante du virus dans les cellules. Dans nos travaux, l’IFNα a été détecté dans le plasma de sujets diabétiques, et fréquemment associé à la présence d’ARN entéroviral. De même, parmi les CMN, les monocytes ont été identifiés comme les principales cellules cibles du virus. En dehors de l’IFNα, nous avons montré que CVB4 peut induire la synthèse de plusieurs autres cytokines pro-inflammatoires notamment l’IL-6 et le TNFα. De façon intéressante, l’infection des cellules n’est pas indispensable car cette induction est possible par des particules non infectieuses. Cette production de cytokines pro-inflammatoires par les CMN peut également être amplifiée par la facilitation de l’infection en présence de particules infectieuses de CVB4. Nous avons montré que les macrophages, cellules effectrices importantes de l’immunité innée au niveau tissulaire, peuvent produire en présence de CVB4 de l’IFNα et d’autres cytokines pro-inflammatoires. Les macrophages dérivés de CMN en présence de M-CSF (mais pas de GM-CSF) sont infectables par CVB4 et le virus peut persister dans ces cellules. CVB4 peut également établir une infection chronique productive de type « état porteur » dans des cellules canalaires pancréatiques. Les cellules chroniquement infectées peuvent être guéries grâce à un traitement par de la fluoxétine. Cette molécule utilisée dans le traitement de troubles psychiatriques, présente in vitro une activité antivirale vis-à-vis de certains entérovirus, et permet d’éliminer complètement en quelques semaines le virus des cellules chroniquement infectées par CVB4. Des modifications cellulaires ont été observées au niveau des cellules chroniquement infectées notamment une diminution de l’expression de PDX-1, une résistance à la lyse au cours d’une réinfection par CVB4, ainsi qu’une diminution très importante de l’expression du récepteur CAR. Ces modifications cellulaires acquises au cours de l’infection chronique pouvaient persister après l’élimination du virus. Les cellules chroniquement infectées présentent également un profil de microARNs très différent de celui des cellules non infectées. Une évolution du virus a été également observée avec des changements phénotypiques et génotypiques. L’ensemble de nos observations montre que les caractéristiques de l’infection à CVB4 sont compatibles avec les mécanismes évoqués dans la pathogenèse entérovirale du DT1 et renforcent l’hypothèse de l’implication des CVB dans cette maladie. / Group B coxsackieviruses (CVB) are small RNA viruses belonging to Enterovirus genus and to the Picornaviridae family. In humans, CVB can cause numerous mild and severe acute infections. They are also thought to be involved in the development of chronic diseases such as type 1 diabetes (T1D). Several epidemiological and clinical data support a link between enteroviruses, especially CVB and T1D. Two main mechanisms have been described to explain this enteroviral pathogenesis of T1D including a “bystander activation” of an inflammatory environment and viral persistence. These mechanisms contribute to initiation of the autoimmune process. Our studies aimed to understand the features and outcomes of CVB infection that could explain their involvement in these mechanisms. The results suggest that CVB4 (used as CVB model) is an inflammatory virus. CVB4 induces in vitro the production by peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of high amounts of IFNα. However this induction is only possible when CVB4 infection is enhanced by non-neutralizing antibodies, resulting in increased viral entry in cells. We also reported detection of IFNα in plasma of T1D patients, commonly associated with enteroviral RNA. In addition, monocytes have been identified as major targets of enteroviruses among PBMCs. Besides IFNα, CVB4 can induce the synthesis of other proinflammatory cytokines, mainly IL-6 and TNFα. Interestingly, infection is not needed, since inactivated viral particles can induce these proinflammatory cytokines. In addition, the enhancing of CVB4 infection in PBMCs results in increased production of these cytokines. We have shown that macrophages that are known as major innate immunity effectors can produce IFNα and other proinflammatory cytokines upon infection with CVB4. Macrophages derived from PBMCs in presence of M-CSF (but not GM-CSF) can be infected by CVB4, and the virus can persist in these cells. CVB4 can also establish a productive, carrier-sate persistent infection in pancreatic ductal-like cells. The virus can be completely cleared from chronically-infected cells using fluoxetine. This molecule already used in the treatment of depression and other mental disorders, has displayed antiviral activity against many enteroviruses, and can completely clear CVB4 from chronically-infected cells within few weeks. Cellular changes have been observed during chronic infection including a reduced expression of PDX-1, a resistant profile to lysis upon superinfection with CVB4, and an important decrease of CAR expression. These changes can linger even after the clearance of CVB4. In addition the miRNA profile in chronically-infected ductal-like cells was clearly different from that of mock-infected cells. Some phenotypic and genotypic changes were also observed in the virus derived from chronic infection. Altogether, these findings show the features of CVB4 infection are compatible with mechanisms reported in the enteroviral pathogenesis of T1D, and support the hypothesis of involvement of CVB in this disease.

Les cellules NKT invariantes (iNKT) sont des lymphocytes T non conventionnels restreints par la molécule CD1d qui présente des glycolipides. Les cellules iNKT expriment un TCR avec une chaîne a invariante, Va14-Ja18 chez la souris et Va28-Ja18 chez l’homme. Elles ont la particularité de produire de grande quantité de cytokines (IFN-? et IL-4) rapidement après leur activation et peuvent à leur tour stimuler d’autres cellules du système immunitaire comme les cellules dendritiques, les cellules NK et les lymphocytes T. Elles représentent ainsi un pont entre les réponses immunitaires innées et adaptatives. Le diabète de type 1 est une maladie autoimmune caractérisée par la destruction des cellules ß pancréatiques productrices d’insuline. Bien que l’apparition de diabète de type 1 soit associée à des polymorphismes génétiques, les facteurs environnementaux ont également été impliqués dans l’étiologie de cette maladie. De nombreuses études suggèrent que les infections virales, en particulier les infections par le virus de coxsackie B4 (CVB4), pourraient être impliquées dans le développement de cette maladie. Notre étude a été réalisée avec des souris NOD qui développent un diabète de type 1 vers 15 semaines d’âge et des souris NOD déficientes pour la proinsulin 2 (Pro-ins2-/-) développant un diabète vers 8 semaines d’âge. Nos résultats montrent qu’après infection par CVB4, la moitié des souris NOD et Pro-ins2-/- développent un diabète accéléré par rapport à des souris non infectées. Toutefois, une injection de l’agoniste des cellules iNKT, la molécule aGalactosylceramide (aGalCer), au moment de l’infection des souris, diminue fortement l’incidence de diabète. L’infection par CVB4 induit un fort recrutement de macrophages dans le pancréas et l’activation des cellules iNKT modifie la fonction de ces macrophages. En effet, les macrophages pancréatiques des souris infectées par CVB4 expriment fortement les cytokines IL-1ß, IL-6 et TNF-a, révélant leur caractère pro-inflammatoire alors que les macrophages des souris infectées et traitées par aGalCer expriment faiblement ces cytokines inflammatoires et fortement des enzymes immunosuppressives iNOS (inducible NO synthase), IDO (Indoleamine 2,3-dioxygenase) et arginase I. L’utilisation d’inhibiteurs de ces enzymes montre que la protection contre le diabète est induite par IDO. Nous avons également observé une forte infiltration de lymphocytes T autoréactifs dans les îlots pancréatiques des souris infectées. De façon intéressante, l’incidence accrue de diabète du groupe CVB4 est associée à une fréquence élevée de cellules T autoréactives produisant de l’IFN-? dans le pancréas, alors que la production d’IFN-? par les cellules T autoréactives est très faible dans les souris du groupe CVB4+aGalCer. Cette inhibition de la production d’IFN-? est dépendante de l’enzyme IDO, car l’utilisation d’un inhibiteur d’IDO augmente fortement la production d’IFN-? par les lymphocytes T anti-îlots et l’incidence de diabète. Dans l’ensemble nos résultats montrent, que l’activation des cellules iNKT lors de l’infection par CVB4 induit des macrophages immunosuppresseurs dans le pancréas, ces cellules inhibant la fonction des lymphocytes T autoréactifs et ainsi le développement du diabète. / INKT cells are non-conventional T lymphocytes that are restricted to glycolipid presenting CD1d molecule. iNKT cells express an invariant TCR a chain (Va14-Ja18 in mice and Va28-Ja18 in humans). Their particularity is to rapidly produce copious amounts of cytokines (IFN-? and IL-4) after activation and to activate other cells of the immune system such as dendritic cells, NK cells and T lymphocytes. iNKT cells, therefore, form a bridge between innate and adaptive immune responses. Type 1 diabetes is an autoimmune disease characterized by the destruction of pancreatic ß cells whose role is to produce insulin. While diabetes development can clearly be associated with genetic polymorphisms, environmental factors were also implicated in the etiology of the disease. Numerous studies suggest that viral infections, particularly infections with Coxsackievirus B4 (CVB4), could be implicated in the development of type 1 diabetes. Our study was performed with NOD mice that develop type 1 diabetes around 15 weeks of age and with proinsulin 2 knockout NOD mice (Pro-ins2-/-) which become diabetic around 8 weeks of age. Our results show that CVB4 infection induces accelerated diabetes in around half of NOD and Pro-ins2-/- mice compared to uninfected mice. However, the activation of iNKT cells with their agonist, aGalactosylceramide (aGalCer), at the time of infection greatly decreases diabetes incidence. CVB4 infection induces a strong recruitment of macrophages into the pancreas. Interestingly, iNKT cell activation modifies the function of these macrophages. Indeed, pancreatic macrophages of CVB4 infected mice strongly express IL-1, IL-6 and TNF-a, indicating their pro-inflammatory character. On the contrary, macrophages of mice infected with CVB4 and treated with aGalCer express low levels of these cytokines, but strong levels of suppressive enzymes iNOS (inducible NO synthase), IDO (Indoleamine 2,3-dioxygenase) and arginase I. The use of inhibitors of these enzymes showed that diabetes prevention is induced by IDO. We have also observed that autoreactive T cells strongly infiltrate the pancreatic islets after CVB4 infection. It is interesting to note that the high diabetes incidence of CVB4 infected mice is associated with an increased frequency of IFN-? producing autoreactive T cells in pancreatic islets. On the contrary, the frequency of these cells is very low in infected mice treated with aGalCer. The inhibition of IFN-? production is dependent on IDO enzyme, since the use of its inhibitor strongly increases IFN-? production by anti-islet T cells and diabetes incidence. To summarize, our results show that iNKT cell activation during the infection with CVB4 induces immunosuppressive macrophages in the pancreas. These cells inhibit the function of autoreactive T cells and prevent diabetes development.

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