A administração sistêmica da peçonha bruta da cascavel Sul-Americana (Crotalus durissus terrificus, Cdt) induz prejuízos de memória espacial em ratos, sugerindo a ocorrência de dano hipocampal. No presente estudo, foram utilizadas técnicas In vivo e In vitro, a fim de testar os potenciais efeitos centrais do veneno de Cdt e da crotoxina (CTX), principal neurotoxina componente da peçonha bruta da serpente. Foram investigados (1) efeitos comportamentais da administração sistêmica e intrahipocampal do veneno de Cdt e da CTX envolvendo diferentes versões do labirinto aquático de Morris; (2) a morte neuronal, o curso temporal e a ação protetora do soro anticrotálico à exposição de culturas organotípicas de hipocampo a doses crescentes (0,05-1 μg/mL) do veneno bruto de Cdt e de CTX, por meio da coloração fluorescente por Iodeto de propídeo (PI) (que reflete a morte neuronal); e (3) alguns dos possíveis mecanismos fisiopatológicos do envenenamento experimental em culturas de hipocampo utilizando o antagonista de receptores AMPA de glutamato, NBQX, à administração de 0,05 μg/mL do veneno bruto de Cdt, para avaliar a possível participação do glutamato e seus receptores na morte neuronal. A administração sistêmica e intrahipocampal do veneno bruto de cascavel em ratos promoveu marcados prejuízos de memória espacial de referência e operacional. Diferentemente, a CTX promoveu prejuízos comportamentais apenas quando a administração foi intrahipocampal. As culturas expostas ao veneno bruto apresentaram dano sobretudo nas células piramidais de CA1, enquanto as culturas incubadas com CTX não apresentaram danos. Essa seletividade em relação ao CA1 foi mais proeminente nas doses baixas. O soro anticrotálico preveniu a morte neuronal quando administrado até uma hora após a exposição do veneno. O NBQX preveniu parcialmente o dano em CA1 indicando a participação de receptores AMPA de glutamato na cascata de eventos que subjazem os danos a estas células causados pela peçonha bruta de Cdt. Estes achados podem contribuir para a tanto para elucidação dos mecanismos quanto para a conduta utilizada durante o envenenamento crotálico / Systemic administration of the South American rattlesnake (Crotalus durissus terrificus, Cdt) venom in rats permanently disrupts performance in hippocampus-dependent spatial memory tasks, thus indicating the occurrence of damage to this brain area. In vivo and In vitro approaches were employed in the present study to investigate the effects of the venom and its main compound, crotoxin (CTX). We investigated (1) behavioral effects after both systemic and intrahipocampal administration of either venom or CTX in rats on performance in different versions of the Morris\' water maze task; (2) neuronal death, evaluated by the intensity of propidium iodide (PI) fluorescence (neurotoxicity of the venom and of CTX, and the protection by the antivenom, on organotypic hippocampal slice cultures, were evaluated by comparing slices exposed to venom and (1) slices treated only with vehicle - negative control - and (2) slices incubated with 1 mM glutamate - positive control for maximal neuronal death), and the time course of neurotoxic effects of 0.05-1 μg/mL of crude Cdt venom and CTX, and the Brazilian anticrotalid serum on organotypic hippocampal slice cultures; and (3) provide an initial screening of the mechanisms underlying the venom action on cultured hippocampal slices, using the AMPA receptor antagonist NBQX and the crude venom at 0.5 μg/mL dose, to test whether the neuronal damage is mediated by glutamate following the experimental envenomation. Both systemic and intrahippocampal administration of Cdt venom induces permanent disruption of spatial reference memory and spatial working memory in rats. In contrast, CTX only promoted behavioral effects when administered intrahippocampally. Slices exposed to Cdt venom, but not to CTX, exhibited substantial neuronal damage. This effect was particularly prominent in the CA1 sub-field at lower concentrations of the venom. The antivenom prevented damage when applied until 1 hour after the exposure of the venom. The NBQX partially prevented damage to CA1, thus indicating that AMPA receptors play a role in the damage caused by the Cdt venom. These findings may be helpful in the elucidation and management of rattlesnake envenomation

A administração sistêmica da peçonha bruta da cascavel Sul-Americana (Crotalus durissus terrificus, Cdt) induz prejuízos de memória espacial em ratos, sugerindo a ocorrência de dano hipocampal. No presente estudo, foram utilizadas técnicas In vivo e In vitro, a fim de testar os potenciais efeitos centrais do veneno de Cdt e da crotoxina (CTX), principal neurotoxina componente da peçonha bruta da serpente. Foram investigados (1) efeitos comportamentais da administração sistêmica e intrahipocampal do veneno de Cdt e da CTX envolvendo diferentes versões do labirinto aquático de Morris; (2) a morte neuronal, o curso temporal e a ação protetora do soro anticrotálico à exposição de culturas organotípicas de hipocampo a doses crescentes (0,05-1 μg/mL) do veneno bruto de Cdt e de CTX, por meio da coloração fluorescente por Iodeto de propídeo (PI) (que reflete a morte neuronal); e (3) alguns dos possíveis mecanismos fisiopatológicos do envenenamento experimental em culturas de hipocampo utilizando o antagonista de receptores AMPA de glutamato, NBQX, à administração de 0,05 μg/mL do veneno bruto de Cdt, para avaliar a possível participação do glutamato e seus receptores na morte neuronal. A administração sistêmica e intrahipocampal do veneno bruto de cascavel em ratos promoveu marcados prejuízos de memória espacial de referência e operacional. Diferentemente, a CTX promoveu prejuízos comportamentais apenas quando a administração foi intrahipocampal. As culturas expostas ao veneno bruto apresentaram dano sobretudo nas células piramidais de CA1, enquanto as culturas incubadas com CTX não apresentaram danos. Essa seletividade em relação ao CA1 foi mais proeminente nas doses baixas. O soro anticrotálico preveniu a morte neuronal quando administrado até uma hora após a exposição do veneno. O NBQX preveniu parcialmente o dano em CA1 indicando a participação de receptores AMPA de glutamato na cascata de eventos que subjazem os danos a estas células causados pela peçonha bruta de Cdt. Estes achados podem contribuir para a tanto para elucidação dos mecanismos quanto para a conduta utilizada durante o envenenamento crotálico / Systemic administration of the South American rattlesnake (Crotalus durissus terrificus, Cdt) venom in rats permanently disrupts performance in hippocampus-dependent spatial memory tasks, thus indicating the occurrence of damage to this brain area. In vivo and In vitro approaches were employed in the present study to investigate the effects of the venom and its main compound, crotoxin (CTX). We investigated (1) behavioral effects after both systemic and intrahipocampal administration of either venom or CTX in rats on performance in different versions of the Morris\' water maze task; (2) neuronal death, evaluated by the intensity of propidium iodide (PI) fluorescence (neurotoxicity of the venom and of CTX, and the protection by the antivenom, on organotypic hippocampal slice cultures, were evaluated by comparing slices exposed to venom and (1) slices treated only with vehicle - negative control - and (2) slices incubated with 1 mM glutamate - positive control for maximal neuronal death), and the time course of neurotoxic effects of 0.05-1 μg/mL of crude Cdt venom and CTX, and the Brazilian anticrotalid serum on organotypic hippocampal slice cultures; and (3) provide an initial screening of the mechanisms underlying the venom action on cultured hippocampal slices, using the AMPA receptor antagonist NBQX and the crude venom at 0.5 μg/mL dose, to test whether the neuronal damage is mediated by glutamate following the experimental envenomation. Both systemic and intrahippocampal administration of Cdt venom induces permanent disruption of spatial reference memory and spatial working memory in rats. In contrast, CTX only promoted behavioral effects when administered intrahippocampally. Slices exposed to Cdt venom, but not to CTX, exhibited substantial neuronal damage. This effect was particularly prominent in the CA1 sub-field at lower concentrations of the venom. The antivenom prevented damage when applied until 1 hour after the exposure of the venom. The NBQX partially prevented damage to CA1, thus indicating that AMPA receptors play a role in the damage caused by the Cdt venom. These findings may be helpful in the elucidation and management of rattlesnake envenomation

O presente estudo investigou o efeito do veneno de Crotalus durissus terrificus (VCdt) e da sua principal fração, crotoxina (ctx) sobre a resposta inflamatória induzida pela carragenina (cg). Foram avaliados o efeito do pré e do pós-tratamento com o VCdt sobre o desenvolvimento do edema de pata, a migração celular para a cavidade peritoneal e a interação leucócito-endotélio na microcirculação do músculo cremaster de camundongos induzidos por carragenina. O pré (14, 7 dias ou 1 h) e pós-tratamento (48, 4 ou 1 h) com o VCdt (1,5 μg/50 μL s.c.) inibiu o desenvolvimento do edema de pata induzido pela injeção intraplantar de carragenina em todos os tempos analisados (300 μg/50 μL). O mesmo efeito inibitório foi observado para o pré (21, 14, 7 dias ou 1 h) e pós-tratamento (1 h) com o VCdt (1,5 μg/50 μL s.c.) sobre a migração celular para a cavidade peritoneal induzida pela carragenina (300 μg/50 μL). A administração do VCdt por via oral (8,8 μg/200 μL) antes (14, 7 dias ou 1 h) ou após (1 h) a injeção de carragenina (300 μg/200 μL) também inibiu o influxo celular para a mesma cavidade. Em relação à interação leucócito-endotélio, o tratamento com o VCdt 1 h antes ou após a injeção de carragenina no subcutâneo da bolsa escrotal (300 μg/100 μL), aumentou o número de células em estado de rolling. Por outro lado, reduziu a adesão das células ao endotélio e a migração celular para o tecido extravascular. Da mesma forma que o VCdt, a ctx (0,89 μg/50 μL s.c.) administrada 1 h antes ou após a carragenina inibiu todos os eventos acima citados. Os efeitos inibitórios do VCdt sobre o edema e sobre a migração celular foi comparado ao de clássicas drogas antiinflamatórias: a dexametasona, a indometacina, o L-NAME e o nimesulide. Para o edema, foi observado que somente o VCdt e o nimesulide impediram a formação do segundo pico de edema de carragenina. Para a migração celular, não foi observada diferença entre o tratamento com o VCdt e as drogas antiinflamatórias. A associação do VCdt com as drogas antiinflamatórias acima citadas não potencializou as suas ações inibitórias sobre a migração celular. Os dados demonstram que o VCdt apresenta um efeito antiinflamatório prolongado, e ainda, que a ctx pode contribuir para o efeito antinflamatório do VCdt. / In the present study, we investigated the effects of Crotalus durissus terrificus venom (CdtV) and crotoxin (ctx) on vascular and cellular events of inflammation induced by carrageenan (cg) in mice. It was evaluated the effect of the pre or post-treatment with CdtV on development of paw edema, cell migration and leukocyte-endothelium interaction at the cremaster muscle microcirculation induced by cg in mice. The pre (14, 7 days or 1h) and posttreatment (48, 4 or 1h) with CdtV (1,5 μg/50 μL s.c.), inhibited the paw edema induced by carrageenan (300 μg/50 μL) in all periods of time evaluated. The same inhibitory effect of CdtV (1,5 μg/50 μL s.c.) was observed to the pre (21, 14, 7 days or 1 h) and post-treatment (1h) on cell migration to the peritoneal cavity induced by cg (300 μg/200 μL). The oral administration of CdtV (8,8 μg/200 μL) before (14, 7 days or 1h) or after (1h) intraperitoneal injection of cg (300 μg/200 μL), also inhibited the cell influx to the same cavity. To evaluate leukocyte-endothelium interaction, the treatment with CdtV 1h before or after the cg injection (300 μg/100 μL) into the scrotal bag of the animals induced an increase in leukocyte rolling, but reduced the cellular adhesion to the endothelium surface and cellular migration to the extravascular tissue. The administration of ctx (0,89 μg/50 μL s.c.) 1 h before or after cg injection, could inhibit all inflammatory events mentioned above. The inhibitory effect of CdtV on paw edema and cellular migration were also compared with that observed for classical anti-inflammatory drugs, such as: dexamethasone, indomethacin, LNAME and nimesulide. Only CdtV and nimesulide blocked the second peak of edema formation induced by cg. For cell migration, no differences were observed among the treatment with CdtV and anti-inflamatory drugs. The association of CdtV with drugs did not potentialize their actions on cell migration. These results demonstrate that CdtV exhibits a long-lasting antiinflammatory effect and that ctx could contribute for the anti-inflammatory effect of CdtV.

A hemostasia previne a perda de sangue após uma lesão vascular e garante a fluidez sanguínea. Para isso há a participação de células carreadoras de fator tissular e também de plaquetas, além de fatores plasmáticos, cofatores, fosfolipídios e íons cálcio que resultam na liberação dos fibrinopeptídios do fibrinogênio e polimerização dos monômeros de fibrina, transformando-os em fibrina estável. Os polifosfatos também participam da ativação da via intrínseca da cascata de coagulação ativando o fator XII e a pré-calicreína plasmática. Os répteis possuem peculiaridades quanto ao mecanismo de coagulação, apresentando níveis altos de anticoagulantes circulantes e ausência ou deficiência de alguns fatores de coagulação. Pouco se sabe sobre a participação real dos trombócitos e polifosfatos no mecanismo hemostático de serpentes. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar o mecanismo hemostático da serpente de C.d. terrificus, avaliando também o papel dos trombócitos e dos polifosfatos. Os testes de coagulação apresentaram tempos prolongados, mas o nível de fibrinogênio (227, 47 ± 20,38 g/dL) foi semelhante ao humano. Foi constatada a presença de FXII, que foi ativado pelos polifosfatos, reduzindo o tempo de coagulação em Rotem. Os trombócitos de C.d. terrificus (13,37 ± 1,22 x 109/L) são células nucleadas elipsoidais, que apresentam superfície lisa quando não estão ativados. Esses trombócitos agregaram com colágeno 5,84 ± 0,85 Ω) e cálcio ionóforo (24 ± 3,3 %). Porém, não ativaram com ADP, como previamente mostrado em outros répteis. A adesão trombocitária observada (1,25 ± 0,37 %) foi mais baixa do que em seres humanos (11%), lembrando que a adaptação do método usado não foi totalmente adequada às serpentes. Embora se saiba pouco sobre a importância das variações das características morfológicas das fibras de fibrina, que em C.d. terrificus diferem das de ratos, humanos e outras espécies descritas de mamíferos, o tipo dessa rede de fibrina pode estar influenciando no processo final da hemostasia, juntamente com a participação dos trombócitos. A eficácia do mecanismo hemostático em serpentes C.d. terrificus parece estar relacionada principalmente à ativação da coagulação pelo fator tissular. Assim, a fase de iniciação é tão eficiente quanto em mamíferos, diferindo mais na fase de propagação do coágulo, ou seja, na via intrínseca. A baixa concentração de alguns fatores de coagulação e níveis elevados de inibidores naturais, tais como a antitrombina, interfere nesse sistema mais lento e possivelmente diminui os riscos trombóticos / Hemostasis prevents blood loss after vascular injury and provides the blood flow. Platelets and tissue factor bearing cell, plasma factors, cofactors, phospholipids and calcium ions participate in this process that results in the release of fibrinogen fibrinopeptides and polymerization of fibrin monomers, converting to stable fibrin. Polyphosphates also participate in the activation of the intrinsic pathway of the coagulation cascade by activating factor XII and plasma prekallikrein. The peculiarities of blood coagulation of reptiles are high levels of circulating anticoagulants and absence or low level of some coagulation factors. The role of thrombocytes and polyphosphates in the hemostatic mechanism of snakes is not well known. The objective of this study was to investigate the hemostatic mechanism of C.d. terrificus snake evaluating the role of thrombocytes and polyphosphates. Coagulation tests showed prolonged times, but the level of fibrinogen (227.47 ± 20.38 g/dL) was similar to human. It was also observed the presence of FXII activated by polyphosphates reducing the clotting time in Rotem. Thrombocytes of C.d. terrificus (13.37 ± 1.22 x 109/L) are ellipsoidal nucleated cells, which exhibit smooth surface when not activated. These thrombocytes were activated by collagen (5.84 ± 0.85 Ω) and calcium ionophore (24 ± 3.3%). However, they did not aggregate with ADP as previously shown in other reptiles. The thrombocytes adhesiveness observed (1.25 ± 0.37%) was lower than in humans (11%), probably, in part because the adaptation of the method used was not fully adequate to snakes. Although little is known about the importance of morphological characteristics of C.d. terrificus fibrin fibers, which differ from rat, human and other mammalian species described, possibly this type of fibrin network may influence the final stages of hemostasis, with thrombocytes participation. The efficacy of the hemostatic mechanism in C.d. terrificus snakes seems to be mainly related to the activation of coagulation by tissue factor. Thus, the initiation phase is as efficient as in mammals, differing in the propagation phase of coagulation or intrinsic pathway. The low concentration of some coagulation factors and high levels of natural inhibitors such as antithrombin may be interfering with that system, and also preventing thrombotic diseases

O presente estudo investigou o efeito do veneno de Crotalus durissus terrificus (VCdt) e da sua principal fração, crotoxina (ctx) sobre a resposta inflamatória induzida pela carragenina (cg). Foram avaliados o efeito do pré e do pós-tratamento com o VCdt sobre o desenvolvimento do edema de pata, a migração celular para a cavidade peritoneal e a interação leucócito-endotélio na microcirculação do músculo cremaster de camundongos induzidos por carragenina. O pré (14, 7 dias ou 1 h) e pós-tratamento (48, 4 ou 1 h) com o VCdt (1,5 μg/50 μL s.c.) inibiu o desenvolvimento do edema de pata induzido pela injeção intraplantar de carragenina em todos os tempos analisados (300 μg/50 μL). O mesmo efeito inibitório foi observado para o pré (21, 14, 7 dias ou 1 h) e pós-tratamento (1 h) com o VCdt (1,5 μg/50 μL s.c.) sobre a migração celular para a cavidade peritoneal induzida pela carragenina (300 μg/50 μL). A administração do VCdt por via oral (8,8 μg/200 μL) antes (14, 7 dias ou 1 h) ou após (1 h) a injeção de carragenina (300 μg/200 μL) também inibiu o influxo celular para a mesma cavidade. Em relação à interação leucócito-endotélio, o tratamento com o VCdt 1 h antes ou após a injeção de carragenina no subcutâneo da bolsa escrotal (300 μg/100 μL), aumentou o número de células em estado de rolling. Por outro lado, reduziu a adesão das células ao endotélio e a migração celular para o tecido extravascular. Da mesma forma que o VCdt, a ctx (0,89 μg/50 μL s.c.) administrada 1 h antes ou após a carragenina inibiu todos os eventos acima citados. Os efeitos inibitórios do VCdt sobre o edema e sobre a migração celular foi comparado ao de clássicas drogas antiinflamatórias: a dexametasona, a indometacina, o L-NAME e o nimesulide. Para o edema, foi observado que somente o VCdt e o nimesulide impediram a formação do segundo pico de edema de carragenina. Para a migração celular, não foi observada diferença entre o tratamento com o VCdt e as drogas antiinflamatórias. A associação do VCdt com as drogas antiinflamatórias acima citadas não potencializou as suas ações inibitórias sobre a migração celular. Os dados demonstram que o VCdt apresenta um efeito antiinflamatório prolongado, e ainda, que a ctx pode contribuir para o efeito antinflamatório do VCdt. / In the present study, we investigated the effects of Crotalus durissus terrificus venom (CdtV) and crotoxin (ctx) on vascular and cellular events of inflammation induced by carrageenan (cg) in mice. It was evaluated the effect of the pre or post-treatment with CdtV on development of paw edema, cell migration and leukocyte-endothelium interaction at the cremaster muscle microcirculation induced by cg in mice. The pre (14, 7 days or 1h) and posttreatment (48, 4 or 1h) with CdtV (1,5 μg/50 μL s.c.), inhibited the paw edema induced by carrageenan (300 μg/50 μL) in all periods of time evaluated. The same inhibitory effect of CdtV (1,5 μg/50 μL s.c.) was observed to the pre (21, 14, 7 days or 1 h) and post-treatment (1h) on cell migration to the peritoneal cavity induced by cg (300 μg/200 μL). The oral administration of CdtV (8,8 μg/200 μL) before (14, 7 days or 1h) or after (1h) intraperitoneal injection of cg (300 μg/200 μL), also inhibited the cell influx to the same cavity. To evaluate leukocyte-endothelium interaction, the treatment with CdtV 1h before or after the cg injection (300 μg/100 μL) into the scrotal bag of the animals induced an increase in leukocyte rolling, but reduced the cellular adhesion to the endothelium surface and cellular migration to the extravascular tissue. The administration of ctx (0,89 μg/50 μL s.c.) 1 h before or after cg injection, could inhibit all inflammatory events mentioned above. The inhibitory effect of CdtV on paw edema and cellular migration were also compared with that observed for classical anti-inflammatory drugs, such as: dexamethasone, indomethacin, LNAME and nimesulide. Only CdtV and nimesulide blocked the second peak of edema formation induced by cg. For cell migration, no differences were observed among the treatment with CdtV and anti-inflamatory drugs. The association of CdtV with drugs did not potentialize their actions on cell migration. These results demonstrate that CdtV exhibits a long-lasting antiinflammatory effect and that ctx could contribute for the anti-inflammatory effect of CdtV.

A hemostasia previne a perda de sangue após uma lesão vascular e garante a fluidez sanguínea. Para isso há a participação de células carreadoras de fator tissular e também de plaquetas, além de fatores plasmáticos, cofatores, fosfolipídios e íons cálcio que resultam na liberação dos fibrinopeptídios do fibrinogênio e polimerização dos monômeros de fibrina, transformando-os em fibrina estável. Os polifosfatos também participam da ativação da via intrínseca da cascata de coagulação ativando o fator XII e a pré-calicreína plasmática. Os répteis possuem peculiaridades quanto ao mecanismo de coagulação, apresentando níveis altos de anticoagulantes circulantes e ausência ou deficiência de alguns fatores de coagulação. Pouco se sabe sobre a participação real dos trombócitos e polifosfatos no mecanismo hemostático de serpentes. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar o mecanismo hemostático da serpente de C.d. terrificus, avaliando também o papel dos trombócitos e dos polifosfatos. Os testes de coagulação apresentaram tempos prolongados, mas o nível de fibrinogênio (227, 47 ± 20,38 g/dL) foi semelhante ao humano. Foi constatada a presença de FXII, que foi ativado pelos polifosfatos, reduzindo o tempo de coagulação em Rotem. Os trombócitos de C.d. terrificus (13,37 ± 1,22 x 109/L) são células nucleadas elipsoidais, que apresentam superfície lisa quando não estão ativados. Esses trombócitos agregaram com colágeno 5,84 ± 0,85 Ω) e cálcio ionóforo (24 ± 3,3 %). Porém, não ativaram com ADP, como previamente mostrado em outros répteis. A adesão trombocitária observada (1,25 ± 0,37 %) foi mais baixa do que em seres humanos (11%), lembrando que a adaptação do método usado não foi totalmente adequada às serpentes. Embora se saiba pouco sobre a importância das variações das características morfológicas das fibras de fibrina, que em C.d. terrificus diferem das de ratos, humanos e outras espécies descritas de mamíferos, o tipo dessa rede de fibrina pode estar influenciando no processo final da hemostasia, juntamente com a participação dos trombócitos. A eficácia do mecanismo hemostático em serpentes C.d. terrificus parece estar relacionada principalmente à ativação da coagulação pelo fator tissular. Assim, a fase de iniciação é tão eficiente quanto em mamíferos, diferindo mais na fase de propagação do coágulo, ou seja, na via intrínseca. A baixa concentração de alguns fatores de coagulação e níveis elevados de inibidores naturais, tais como a antitrombina, interfere nesse sistema mais lento e possivelmente diminui os riscos trombóticos / Hemostasis prevents blood loss after vascular injury and provides the blood flow. Platelets and tissue factor bearing cell, plasma factors, cofactors, phospholipids and calcium ions participate in this process that results in the release of fibrinogen fibrinopeptides and polymerization of fibrin monomers, converting to stable fibrin. Polyphosphates also participate in the activation of the intrinsic pathway of the coagulation cascade by activating factor XII and plasma prekallikrein. The peculiarities of blood coagulation of reptiles are high levels of circulating anticoagulants and absence or low level of some coagulation factors. The role of thrombocytes and polyphosphates in the hemostatic mechanism of snakes is not well known. The objective of this study was to investigate the hemostatic mechanism of C.d. terrificus snake evaluating the role of thrombocytes and polyphosphates. Coagulation tests showed prolonged times, but the level of fibrinogen (227.47 ± 20.38 g/dL) was similar to human. It was also observed the presence of FXII activated by polyphosphates reducing the clotting time in Rotem. Thrombocytes of C.d. terrificus (13.37 ± 1.22 x 109/L) are ellipsoidal nucleated cells, which exhibit smooth surface when not activated. These thrombocytes were activated by collagen (5.84 ± 0.85 Ω) and calcium ionophore (24 ± 3.3%). However, they did not aggregate with ADP as previously shown in other reptiles. The thrombocytes adhesiveness observed (1.25 ± 0.37%) was lower than in humans (11%), probably, in part because the adaptation of the method used was not fully adequate to snakes. Although little is known about the importance of morphological characteristics of C.d. terrificus fibrin fibers, which differ from rat, human and other mammalian species described, possibly this type of fibrin network may influence the final stages of hemostasis, with thrombocytes participation. The efficacy of the hemostatic mechanism in C.d. terrificus snakes seems to be mainly related to the activation of coagulation by tissue factor. Thus, the initiation phase is as efficient as in mammals, differing in the propagation phase of coagulation or intrinsic pathway. The low concentration of some coagulation factors and high levels of natural inhibitors such as antithrombin may be interfering with that system, and also preventing thrombotic diseases

Made available in DSpace on 2016-01-26T18:55:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao.pdf: 176084 bytes, checksum: ba3ed3d023a44786d6afb86a343a98e0 (MD5) Previous issue date: 2010-08-27 / Accidents ofidic cart a relevant medical problem in our country due to the high toxicity and lethality of the poisons. About 8% of the accidents they are related to the gender Crotalus being in second place in the number of accidents and in first in relation to the death index. The study had as objective evaluates and to compare the effectiveness of the therapy of the intoxication for poison crotalic in dogs, with use of antiophidic serum isolated or associated the frozen plasma. The dogs were divided in two groups being: Group VS: animals inoculated with poison crotalic and treaties with antiophidic serum bothropic-crotalic; Group VSP: animals inoculated with poison crotalic, treaties with antiophidic serum and plasma frozen fresh. The animals were submitted the clinical evaluation and laboratorial. It was observed us of the two groups edema in the place of inoculation of the poison and mitigation with more precocious recovery in the animals of the group VSP, presence of reflex pupillary the light, dilated pupils, lameness, flaccid paralysis of the musculature, mandibular ptose, increase of the breathing frequency, decrease in the erythrocyte number, hemoglobin and hematocrit, decrease in the number of lymphocytes, increase in the neutrophil number, leukocytes, sanguine incoagulability and increase in the time of protrombina and partial tromboplastina activated with more precocious recovery in the animals of the group VSP. In conclusion the dose of poison crotalic used in the experimental intoxication of dogs was capable to produce alterations in the clinical parameters, laboratorial and hematological with benefits mainly in the recovery of the mitigation and decrease of the member edema in the animals that received the antiophidic serum associated to the frozen fresh plasma when compared to the animals that received only the antiophidic serum. / Acidentes ofídicos acarretam um problema médico relevante em nosso país devido às altas toxicidades e letalidades dos venenos. Cerca de 8% dos acidentes estão relacionados ao gênero Crotalus estando em segundo lugar no número de acidentes e em primeiro em relação ao índice de óbito. O estudo teve como objetivo avaliar e comparar a indução da intoxicação experimental e terapia por veneno crotálico em cães, com uso de soro antiofídico isolado ou associado a plasma congelado. Os cães foram divididos em dois grupos sendo: Grupo VS: animais inoculados com veneno crotálico e tratados com soro antiofídico botrópico-crotalico; Grupo VSP: animais inoculados com veneno crotálico, tratados com soro antiofídico e plasma fresco congelado. Os animais foram submetidos à avaliação clínica e hemograma. Foram observados nos dois grupos, edema no local de inoculação do veneno e sedação com recuperação mais precoce nos animais do grupo VSP, presença de reflexo pupilar a luz, midríase, claudicação, paralisia flácida da musculatura, ptose mandibular, aumento da frequência respiratória, diminuição no número de eritrócitos, hemoglobina e hematócrito, diminuição no número de linfócitos, aumento no número de neutrófilos, leucócitos, incoagulabilidade sanguínea e aumento no tempo de protrombina e tromboplastina parcial ativada com recuperação mais precoce nos animais do grupo VSP. Conclui-se que a dose de veneno crotálico usada na intoxicação experimental de cães foi suficiente de produzir alterações nos parâmetros clínicos, laboratoriais com benefícios principalmente na recuperação da sedação e diminuição do edema de membro nos animais que receberam o soro antiofídico associado ao plasma fresco congelado quando comparado aos que receberam somente o soro antiofídico.

Made available in DSpace on 2016-07-18T17:53:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao.pdf: 176084 bytes, checksum: ba3ed3d023a44786d6afb86a343a98e0 (MD5) Previous issue date: 2010-08-27 / Accidents ofidic cart a relevant medical problem in our country due to the high toxicity and lethality of the poisons. About 8% of the accidents they are related to the gender Crotalus being in second place in the number of accidents and in first in relation to the death index. The study had as objective evaluates and to compare the effectiveness of the therapy of the intoxication for poison crotalic in dogs, with use of antiophidic serum isolated or associated the frozen plasma. The dogs were divided in two groups being: Group VS: animals inoculated with poison crotalic and treaties with antiophidic serum bothropic-crotalic; Group VSP: animals inoculated with poison crotalic, treaties with antiophidic serum and plasma frozen fresh. The animals were submitted the clinical evaluation and laboratorial. It was observed us of the two groups edema in the place of inoculation of the poison and mitigation with more precocious recovery in the animals of the group VSP, presence of reflex pupillary the light, dilated pupils, lameness, flaccid paralysis of the musculature, mandibular ptose, increase of the breathing frequency, decrease in the erythrocyte number, hemoglobin and hematocrit, decrease in the number of lymphocytes, increase in the neutrophil number, leukocytes, sanguine incoagulability and increase in the time of protrombina and partial tromboplastina activated with more precocious recovery in the animals of the group VSP. In conclusion the dose of poison crotalic used in the experimental intoxication of dogs was capable to produce alterations in the clinical parameters, laboratorial and hematological with benefits mainly in the recovery of the mitigation and decrease of the member edema in the animals that received the antiophidic serum associated to the frozen fresh plasma when compared to the animals that received only the antiophidic serum. / Acidentes ofídicos acarretam um problema médico relevante em nosso país devido às altas toxicidades e letalidades dos venenos. Cerca de 8% dos acidentes estão relacionados ao gênero Crotalus estando em segundo lugar no número de acidentes e em primeiro em relação ao índice de óbito. O estudo teve como objetivo avaliar e comparar a indução da intoxicação experimental e terapia por veneno crotálico em cães, com uso de soro antiofídico isolado ou associado a plasma congelado. Os cães foram divididos em dois grupos sendo: Grupo VS: animais inoculados com veneno crotálico e tratados com soro antiofídico botrópico-crotalico; Grupo VSP: animais inoculados com veneno crotálico, tratados com soro antiofídico e plasma fresco congelado. Os animais foram submetidos à avaliação clínica e hemograma. Foram observados nos dois grupos, edema no local de inoculação do veneno e sedação com recuperação mais precoce nos animais do grupo VSP, presença de reflexo pupilar a luz, midríase, claudicação, paralisia flácida da musculatura, ptose mandibular, aumento da frequência respiratória, diminuição no número de eritrócitos, hemoglobina e hematócrito, diminuição no número de linfócitos, aumento no número de neutrófilos, leucócitos, incoagulabilidade sanguínea e aumento no tempo de protrombina e tromboplastina parcial ativada com recuperação mais precoce nos animais do grupo VSP. Conclui-se que a dose de veneno crotálico usada na intoxicação experimental de cães foi suficiente de produzir alterações nos parâmetros clínicos, laboratoriais com benefícios principalmente na recuperação da sedação e diminuição do edema de membro nos animais que receberam o soro antiofídico associado ao plasma fresco congelado quando comparado aos que receberam somente o soro antiofídico.

Estudos anteriores demonstraram que o veneno de Crotalus durissus terrificus (VCdt) apresenta ação antiinflamatória prolongada, bem como inibe o espraiamento e a atividade fagocítica de macrófagos peritoneais, sendo a crotoxina (CTX), o principal componente do VCdt, a responsável por esses efeitos. Em relação aos neutrófilos, demonstrou-se que o VCdt inibe, in vitro e in vivo, a fagocitose por essas células, porém o componente do VCdt responsável por esse efeito não foi identificado. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi identificar o componente responsável pelo efeito inibitório do VCdt sobre a fagocitose por neutrófilos, bem como investigar os possíveis mecanismos envolvidos nessa ação. Além disso, foi também objetivo desse estudo investigar o efeito do VCdt e da CTX sobre a atividade microbicida e a produção de espécies reativas do oxigênio por essas células. Inicialmente, foi avaliado o efeito in vitro dos três picos do VCdt, obtidos durante a purificação da CTX (pico I; pico II, que corresponde a CTX, e pico III), sobre a atividade fagocítica de neutrófilos. A incubação dos neutrófilos com a CTX ou com os picos I ou III, em diferentes concentrações (0,02; 0,04; 0,08; 0,16 ou 0,32 ug/mL), mostrou que somente o pico II inibiu essa atividade, demonstrando que a CTX é o componente do VCdt responsável pelo seu efeito inibitório sobre a fagocitose por neutrófilos. Uma vez realizada essa identificação, foi investigado o efeito in vivo da CTX sobre essa função. O tratamento dos animais com a CTX (0,1 mg/kg), 2 horas, 1, 4 ou 14 dias antes ou 1 hora após a administração de carragenina inibiu a fagocitose por neutrófilos, o que demonstra que esta toxina, além do efeito direto, apresenta efeito sistêmico sobre a atividade fagocítica dessas células. Esses resultados mostraram também que a CTX apresenta efeito inibitório prolongado sobre a atividade fagocítica de neutrófilos. Ainda, com o objetivo de elucidar os possíveis mecanismos envolvidos nesse efeito inibitório foram realizados ensaios imunocitoquímicos para avaliar a reorganização do citoesqueleto. A incubação dos neutrófilos com o VCdt (0,5 ug/mL) ou com a CTX (0,08 ug/mL), bem como o tratamento dos animais com o VCdt (0,18 mg/kg) ou a CTX (0,1 mg/kg), 2 horas antes da administração de carragenina, inibiram a fosforilação de resíduos de tirosina e a polimerização da actina. Em relação ao efeito do VCdt e da CTX sobre outra função dos neutrófilos, foi investigado, em ensaios in vitro e in vivo, a atividade microbicida e a produção de espécies reativas do oxigênio por essas células. A incubação dos neutrófilos com o VCdt (0,125; 0,25; 0,5; 1,0 ou 2,0 ug/mL) ou a CTX (0,02; 0,04; 0,08; 0,16 ou 0,32 ug/mL), bem como o tratamento dos animais com o VCdt (0,18 mg/kg) ou a CTX (0,1 mg/kg), 2 horas antes da administração de carragenina, não alteraram a atividade microbicida e a produção de ânion superóxido, peróxido de hidrogênio e ácido hipocloroso. Em conclusão, a CTX é o componente do VCdt responsável por inibir a fagocitose por neutrófilos e um dos mecanismos envolvidos neste efeito é a inibição da fosforilação de proteínas sinalizadoras e a conseqüente polimerização de actina, importante evento para o início da formação do fagossoma e a completa internalização da partícula. Por outro lado, o VCdt e a CTX não alteram a atividade microbicida e a produção de espécies reativas do oxigênio por neutrófilos. Dessa forma, considerando-se o papel fundamental dessas células na inflamação, este estudo amplia os conhecimentos das ações moduladoras da CTX sobre a resposta inflamatória e, ainda, contribui para a elucidação dos mecanismos envolvidos nestas ações, particularmente, a inibição do processo de fagocitose por neutrófilos. / Previous studies showed that Crotalus durissus terrificus snake venom (CdtV) has long-lasting anti-inflammatory properties and inhibits the spreading and the phagocytic activity of peritoneal macrophages. Crotoxin (CTX), the main component of CdtV, is responsible for these effects. In addition, CdtV inhibits, in vitro and in vivo, the phagocytic activity of neutrophils, but the component of the venom responsible for this effect was not identified. In this way, the aim of this study was to investigate the CdtV component responsible for the inhibitory effect on phagocytosis by neutrophils, as well as to investigate possible mechanisms involved on this effect. Besides, the aim of this study was also to investigate the effect of CdtV and CTX on the microbicidal activity and the production of reactive oxygen species by neutrophils. Initialy, it was avaliated the in vitro effect of the three peaks of CdtV, obtained during CTX purification (peak I, peak II that corresponds to CTX and peak III), on phagocytosis by neutrophils. The incubation of the cells with CTX, peak I or peak III, at different concentrations (0.02, 0.04, 0.08, 0.16 or 0.32 ug/mL), showed that just peak II inhibited this activity, so CTX is the CdtV component responsible for the inhibitory effect on phagocytosis by neutrophils. Once realized this identification, it was investigated the in vivo effect of CTX on the same neutrophil function. Treating animals with CTX (0.1 mg/kg), 2 hours, 1, 4 or 14 days before or 1 hour after the administration of carrageenan inhibited the phagocytic activity of neutrophils, which demonstrates that this toxin, in addition to the direct effect, has systemic effect on phagocytosis by neutrophils. These results also show that CTX has a long-lasting inhibitory effect on the phagocytic activity of these cells. Further, to elucidate possible mechanisms involved on this inhibitoty effect, immunocytochemical assays was realized to evaluate the reorganization of the cytoskeleton. The incubation of the neutrophils with CdtV (0.5 ug/mL) or CTX (0.08 ug/mL), as well as the treatment of the animals with CdtV (0.18 mg/kg) or CTX (0.1 mg/kg), 2 hours before the carrageenan injection, inhibited the phosphorilation of tyrosine residues and actin polymerization. Regarding the effect of CdtV and CTX in other neutrophil function, it was investigated, in vitro and in vivo, the microbicidal activity and the production of reactive oxygen species by neutrophils. The incubation of the cells with CdtV (0.125, 0.25, 0.5, 1.0 or 2.0 ug/mL) or CTX (0.02, 0.04, 0.08, 0.16 or 0.32 ug/mL), as well as the treatment of the animals with CdtV (0.18 mg/kg) or CTX (0.1 mg/kg), 2 hours before the carragennan injection, did not alter the microbicidal activity or the production of superoxide, hydrogen peroxide and hypochlorous acid. In conclusion, CTX is the CdtV component responsible for the inhibitory effect on phagocytosis by neutrophils and a mechanism involved on this effect is the inhibition of phosphorilation of signaling proteins and the consequent actin polymerization, an important event for the phagosome formation and the complete internalization of the particle. On the other hand, CdtV and CTX did not alter the microbicidal activity or the production of reactive oxygen species. Thus, considering the essential role of these cells in inflammation, this study extends the knowledge of the actions of CTX on modulating the inflammatory response and also contributes to the elucidation of the mechanisms involved in these actions, particularly the inhibition of phagocytosis by neutrophils.

Células dendríticas (DCs) participam tanto da geração da resposta imune adaptativa como na manutenção da tolerância. O veneno da cascavel Crotalus durissus terrificus, sua principal toxina, crotoxina (CTX) e sua subunidade CB (fosfolipase A2), apresentam efeito supressor sobre o sistema imunológico. Neste trabalho foi avaliado o efeito da CTX e CB sobre a ativação/função das DCs e consequente indução de resposta adaptativa específica anti-Ovalbumina (OVA). Primeiramente, foi verificada a eficiência do processo de maturação das DCs incubadas com OVA associada ao LPS. Os resultados obtidos nesse modelo in vitro mostraram que a CTX e CB inibiram a maturação das DCs estimuladas com OVA + LPS, caracterizada por menor expressão de moléculas coestimuladoras, MHC-II e secreção de citocinas pró-inflamatórias. Em contraste, a CTX e CB induziram maior expressão de ICOS-L, PDL1/2 nas DCs incubadas com OVA + LPS assim como a expressão de RNAm para IL-10 e TGF-β. Além disso, ambas as toxinas foram capazes de aumentar a expressão de PDL1, mas não de ICOS-L ou PDL-2 em DCs. Com relação ao mecanismo envolvido no efeito da CTX e CB sobre as DCs, os resultados mostraram o envolvimento dos receptores peptídeo-formil (FPRs) e a via da 5-Lipoxigenase nesse processo. Sobre a imunidade adaptativa, os resultados mostraram menor proliferação de células TCD3+ ou TCD4+ obtidas de animais imunizados com OVA quando co-cultivadas com DCs incubadas com ConA ou OVA + LPS na presença de CTX ou CB. A diferenciação de células Th1 e Th2 foi inibida pela adição de CTX ou CB nas co-culturas com DCs estimuladas com LPS. No entanto, verificou-se aumento da população Treg nas co-culturas de células CD4+ e DCs incubadas com LPS + CTX ou CB em comparação com DCs estimuladas somente com LPS. A CTX e CB inibiram a diferenciação de células CD4+ Tbet+ e CD4+Gata3+ nas co-culturas de TCD4+ purificados de animais DO 11.10 com DCs estimuladas com OVA + LPS. No entanto, apenas a CTX foi capaz de induzir aumento da porcentagem de células CD4+CD25+FoxP3+. Em experimentos in vivo, foi observada menor proliferação e secreção de IL-2 e IFN nas culturas de células de camundongos imunizados com OVA que receberam CTX ou CB quando estimuladas com OVA em comparação com o observado nas culturas de células de camundongos imunizados com OVA. CTX e CB administradas in vivo em camundongos imunizados com OVA também inibiram a porcentagem de células CD4+IFN+, CD4+IL-4+ e promoveram aumento da população CD4+IL-10+ em comparação com o obtido em camundongos imunizados somente com a OVA. Em relação à imunidade humoral, a produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-OVA também foi inibida em camundongos imunizados com OVA que receberam a CTX ou CB. Além disso, a reação de hipersensibilidade do tipo tardio foi suprimida somente em camundongos imunizados com OVA e que receberam a CTX. Estes dados demonstram que a CTX e CB exercem efeito regulador sobre o sistema imune inato e adaptativo e os FPRs bem como a via da 5-lipoxigenase estão envolvidos nessa ação imunomoduladora. / Dendritic cells (DCs) are involved in both the generation of the adaptive immune response and maintenance of the tolerance. The Crotalus durissus terrificus rattlesnake venom, its main toxin, crotoxin (CTX) and CB (phospholipase A2) subunit have suppressive effect on the immune system. In this work it was analyzed the effect of CTX and its CB subunit on the activation/function of DCs and consequent induction of anti-ovalbumin immune response. Firstly, the efficiency of the DCs maturation incubated with OVA associated with LPS was verified. Following, the results obtained in this in vitro model showed that CTX and CB inhibited the maturation of DCs stimulated with OVA + LPS, characterized by lower expression of costimulatory, MHC-II molecules on DCs as well as secretion of proinflammatory cytokines. In contrast, CTX and CB induced an enhancement of ICOS-L, PDL1/2 expression on DCs incubated with OVA, +LPS as well as the expression of IL-10 and TGF-ß RNAm. In addition, both toxins were able to increase the expression of PDL1, but not ICOS-L or PDL-2, on DCs. Regarding the mechanism involved in the effect of CTX and CB on DCs, the results showed the involvement of the formyl-peptide receptors (FPRs) and the 5-Lipoxygenase pathway in this process. On adaptive immunity, the results showed lower proliferation of TCD3+ or TCD4+ cells obtained from mice immunized with OVA when co-cultured with DCs incubated with ConA or OVA + LPS in the presence of CTX or CB. The differentiation of Th1 and Th2 cells were inhibited by the addition of CTX or CB in co-cultures with DCs stimulated with LPS. However, it was verified increased Treg population in co-culture of CD4+cells and DCs incubated with LPS plus CTX or CB compared with DCs LPS-stimulated. CTX and CB inhibited the differentiation of of CD4+Tbet+ and CD4+Gata 3+ cells in co-cultures of TCD4+ purified from DO11.10 mice with DCs stimulated with OVA + LPS. However, only CTX was able to increase the percentage of CD4+CD25+FoxP3+ cells. In in vivo experiments, it was observed lower proliferation and IL-2 and IFN secretions in cell cultures of mice immunized with OVA that received CTX or CB incubated with OVA compared with those observed in cell culture of OVA-immunized mice. The administration of CTX and CB in vivo in mice immunized with OVA also inhibited the percentage of CD4+IFN+, CD4+IL-4+ cells and increased the CD4+IL-10+ population compared with those observed in mice immunized with OVA. In relation to the humoral immunity, the production of anti-OVA IgG1 and IgG2a antibodies was also inhibited in mice immunized with OVA that received CTX or CB. In addition, the delayed hypersensitivity reaction (DTH) was also diminished in mice immunized with OVA that received the CTX. These data demonstrate that CTX and CB exert regulatory effect on innate and adaptive immune system and that FPRs as well as the 5-lipoxygenase pathway are involved in this immunomodulatory activity.