A evolução da resistência de insetos a culturas que expressam proteínas derivadas de Bacillus thuringiensis (Bt) é o maior desafio para a manutenção dessa biotecnologia em programas de manejo integrado de pragas. Diante do risco de evolução de resistência de Helicoverpa armigera (Hübner) à soja MON87701 × MON89788 foi realizada uma análise de risco levando em consideração o conjunto de fatores que influenciam no processo de seleção. Portanto, os objetivos do presente estudo foram a de caracterizar a suscetibidade à proteína Cry1Ac em populações de H. armigera e H. zea, caracterizar a eficácia da soja MON87701 × MON89788, bem como a adequação do produto ao conceito de alta dose para H. armigera e H. zea, avaliar a frequência dos alelos que conferem resistência à proteína Cry1Ac em populações de H. armigera, identificar a preferência hospedeira de H. armigera e H. zea em diferentes culturas e paisagens agrícolas e avaliar os parâmetros biológicos e demográficos de H. armigera e H. zea em diferentes hospedeiros. A espécie H. zea foi aproximadamente 60 vezes mais tolerante à proteína Cry1Ac que H. armigera. Além disso, baixa variabilidade na suscetibilidade à Cry1Ac foi verificada em populações de H. armigera coletadas em diferentes regiões do Brasil, o que pode ser explicada pela recente introdução dessa espécie no continente americano. A soja MON87701 × MON89788 resultou em mortalidade completa de H. armigera durante todo o ciclo da cultura, enquanto que para H. zea não foi verificado 100% de mortalidade sob condições de laboratório em bioensaios de cinco dias de duração, apesar dos altos níveis de mortalidade encontrados. Uma baixa frequência (frequência estimada = 0,0011) de alelos que conferem resistência à soja MON87701 × MON89788 em populações de campo de H. armigera foi estimada pelo método de F2 screen. A avaliação da tabela de vida em laboratório demonstrou que H. armigera tem altos níveis de desenvolvimento e a reprodução nas principais culturas das regiões dos Cerrados, sendo a cultura do algodão a que resulta nos maiores valores de crescimento populacional e menor tempo entre gerações. Por outro lado, H. zea se mostrou menos polífaga, se estabelecendo até a fase adulta e gerando descendentes apenas em milho e milheto. A ocorrência das duas espécies no campo corrobora com as informações encontradas na tabela de vida, na qual H. armigera foi encontrada em grande parte as culturas da soja e algodão, e em menor frequência à cultura do milho, enquanto que H. zea apresentou comportamento funcionalmente monófago no campo, associada apenas à cultura do milho. Os parâmetros toxicológicos da soja MON87701 × MON89788 associada à alta suscetibilidade de H. armigera à proteína Cry1Ac e à baixa frequência inicial de alelos que conferem resistência se adéquam aos preceitos da estratégia de alta dose/refúgio. A manutenção das áreas de refúgio com plantas não-Bt, de acordo com as recomendações, é essencial para retardar o processo de seleção de resistência de populações de H. armigera à soja MON87701 × MON89788 no Brasil. / Insect resistance to crops expressing proteins derived from Bacillus thuringiensis proteins (Bt) impose the biggest challenge to maintaining the value of this biotechnology in integrated pest management programs. To support a resistance to Helicoverpa armigera (Hübner) to soybean MON87701 × MON89788 was carried out a risk analysis taking into account all factors that influence the selection process. Therefore, the objectives of this study were to characterize the suscetibidade the Cry1Ac protein in H. armigera populations and H. zea, characterize the effectiveness of soybean MON 87701 × MON 89788, as well as the suitability of the product to the concept of high dose H. armigera and H. zea, evaluate the frequency of alleles that confer resistance to Cry1Ac protein in H. armigera populations from different regions of agricultural production, understand the host preference of H. armigera and H. zea in different crops in and agricultural landscapes and evaluate the biological and demographic parameters of H. armigera and H. zea on different hosts. The species H. zea was approximately 60 times more tolerant to Cry1Ac protein than H. armigera. Low variability on susceptibility to Cry1Ac was found among field H. armigera populations, what can be explained by the recent introduction of this species into America. MON 87701 × MON 89788 soybean resulted in complete mortality of H. armigera throughout the crop cycle, while incomplete mortality was found for H. zea using leaf disc bioassays, although high levels of mortality were found. A low resistance allele frequency (estimated frequency = 0.0011) to MON 87701 × MON 89788 soybean was estimated by using the F2 screen methodology. The assessment of the Life Table parameters in laboratory demonstrated the main row crops such as cotton, soybean and maize are suitable for the development and reproduction of H. armigera, wherein cotton resulted in higher values of population growth parameter and shorter times between generations. Conversely, H. zea was less polyphagous in which only corn and millet were suitable hosts. Field occurrence of both species was consistent with laboratory studies. H. amigera was mostly found in soybean and cotton, and rarely on corn, while H. zea was found mainly on maize. Overall, toxicological aspects of MON87701 × MON89788 soybean associated with high susceptibility of H. armigera to Cry1Ac protein and low initial resistance allele frequency fit properly to the highdose/ refuge strategy to delay resistance evolution. Therefore, maintenance of compliance with the refuge recommendation is essential to delay the evolution of resistance in H. armigera to MON87701 × MON89788 soybean in Brazil.

A evolução da resistência de insetos a culturas que expressam proteínas derivadas de Bacillus thuringiensis (Bt) é o maior desafio para a manutenção dessa biotecnologia em programas de manejo integrado de pragas. Diante do risco de evolução de resistência de Helicoverpa armigera (Hübner) à soja MON87701 × MON89788 foi realizada uma análise de risco levando em consideração o conjunto de fatores que influenciam no processo de seleção. Portanto, os objetivos do presente estudo foram a de caracterizar a suscetibidade à proteína Cry1Ac em populações de H. armigera e H. zea, caracterizar a eficácia da soja MON87701 × MON89788, bem como a adequação do produto ao conceito de alta dose para H. armigera e H. zea, avaliar a frequência dos alelos que conferem resistência à proteína Cry1Ac em populações de H. armigera, identificar a preferência hospedeira de H. armigera e H. zea em diferentes culturas e paisagens agrícolas e avaliar os parâmetros biológicos e demográficos de H. armigera e H. zea em diferentes hospedeiros. A espécie H. zea foi aproximadamente 60 vezes mais tolerante à proteína Cry1Ac que H. armigera. Além disso, baixa variabilidade na suscetibilidade à Cry1Ac foi verificada em populações de H. armigera coletadas em diferentes regiões do Brasil, o que pode ser explicada pela recente introdução dessa espécie no continente americano. A soja MON87701 × MON89788 resultou em mortalidade completa de H. armigera durante todo o ciclo da cultura, enquanto que para H. zea não foi verificado 100% de mortalidade sob condições de laboratório em bioensaios de cinco dias de duração, apesar dos altos níveis de mortalidade encontrados. Uma baixa frequência (frequência estimada = 0,0011) de alelos que conferem resistência à soja MON87701 × MON89788 em populações de campo de H. armigera foi estimada pelo método de F2 screen. A avaliação da tabela de vida em laboratório demonstrou que H. armigera tem altos níveis de desenvolvimento e a reprodução nas principais culturas das regiões dos Cerrados, sendo a cultura do algodão a que resulta nos maiores valores de crescimento populacional e menor tempo entre gerações. Por outro lado, H. zea se mostrou menos polífaga, se estabelecendo até a fase adulta e gerando descendentes apenas em milho e milheto. A ocorrência das duas espécies no campo corrobora com as informações encontradas na tabela de vida, na qual H. armigera foi encontrada em grande parte as culturas da soja e algodão, e em menor frequência à cultura do milho, enquanto que H. zea apresentou comportamento funcionalmente monófago no campo, associada apenas à cultura do milho. Os parâmetros toxicológicos da soja MON87701 × MON89788 associada à alta suscetibilidade de H. armigera à proteína Cry1Ac e à baixa frequência inicial de alelos que conferem resistência se adéquam aos preceitos da estratégia de alta dose/refúgio. A manutenção das áreas de refúgio com plantas não-Bt, de acordo com as recomendações, é essencial para retardar o processo de seleção de resistência de populações de H. armigera à soja MON87701 × MON89788 no Brasil. / Insect resistance to crops expressing proteins derived from Bacillus thuringiensis proteins (Bt) impose the biggest challenge to maintaining the value of this biotechnology in integrated pest management programs. To support a resistance to Helicoverpa armigera (Hübner) to soybean MON87701 × MON89788 was carried out a risk analysis taking into account all factors that influence the selection process. Therefore, the objectives of this study were to characterize the suscetibidade the Cry1Ac protein in H. armigera populations and H. zea, characterize the effectiveness of soybean MON 87701 × MON 89788, as well as the suitability of the product to the concept of high dose H. armigera and H. zea, evaluate the frequency of alleles that confer resistance to Cry1Ac protein in H. armigera populations from different regions of agricultural production, understand the host preference of H. armigera and H. zea in different crops in and agricultural landscapes and evaluate the biological and demographic parameters of H. armigera and H. zea on different hosts. The species H. zea was approximately 60 times more tolerant to Cry1Ac protein than H. armigera. Low variability on susceptibility to Cry1Ac was found among field H. armigera populations, what can be explained by the recent introduction of this species into America. MON 87701 × MON 89788 soybean resulted in complete mortality of H. armigera throughout the crop cycle, while incomplete mortality was found for H. zea using leaf disc bioassays, although high levels of mortality were found. A low resistance allele frequency (estimated frequency = 0.0011) to MON 87701 × MON 89788 soybean was estimated by using the F2 screen methodology. The assessment of the Life Table parameters in laboratory demonstrated the main row crops such as cotton, soybean and maize are suitable for the development and reproduction of H. armigera, wherein cotton resulted in higher values of population growth parameter and shorter times between generations. Conversely, H. zea was less polyphagous in which only corn and millet were suitable hosts. Field occurrence of both species was consistent with laboratory studies. H. amigera was mostly found in soybean and cotton, and rarely on corn, while H. zea was found mainly on maize. Overall, toxicological aspects of MON87701 × MON89788 soybean associated with high susceptibility of H. armigera to Cry1Ac protein and low initial resistance allele frequency fit properly to the highdose/ refuge strategy to delay resistance evolution. Therefore, maintenance of compliance with the refuge recommendation is essential to delay the evolution of resistance in H. armigera to MON87701 × MON89788 soybean in Brazil.

Bt é uma bactéria formadora da proteína Cry1Ac, tóxica a lepidópteros. Plantas geneticamente modificadas expressam essa toxina. O objetivo deste trabalho foi isolamento e identificação de bactérias do solo de algodão transgênico e convencional potencialmente biodegradadoras dessa proteína. Estudou-se a dinâmica de crescimento das bactérias em meios com a proteína Cry1Ac ou glucose, a biodegradação, os genes apr, npr e sub. Em solo de algodão convencional a contagem foi menor; para algodão transgênico foi maior. Seis bactérias foram identificadas. O crescimento da bactéria B. pumilus foi maior em meio com a proteína Cry1Ac que glucose e a bactéria G. rubripertincta em meio contendo glucose teve o crescimento maior do que com a proteína Cry1Ac. Foi verificada a biodegradação da proteína pelas bactérias Bp e Gr. Os genes apr e sub foram detectados em solo de planta transgênica e o gene npr não. / Bacillus thuringiensis is a bacterium that forms the Cry1Ac protein, toxic to lepidopteran. Genetically modify plants expressing this toxin. The objective of this work was the isolation and identification bacteria from soil cultivated with transgenic cotton and conventional with potential degradation of this protein. We studied the dynamics growth from bacteria in media with the Cry1Ac protein or glucose, the biodegradation genes apr, npr and sub. In soil of conventional cotton, count was lower, for Bt cotton were higher. Six strains were identified. The growth bacterium B. pumilus was higher in medium with the Cry1Ac protein than bacteria with glucose and G. rubripertincta in medium containing glucose had higher growth than the Cry1Ac protein. Were verified Cry1Ac protein degradation by the bacteria Bp and Gr. Genes apr and sub were detected in soil with transgenic plant and the gene npr were not.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Atualmente sÃo liberadas para comercializaÃÃo no mercado agrobiotecnolÃgico brasileiro, pelo menos, 12 variedades de algodÃo expressando proteÃnas Cry de Bacillus thruringiensis (Bt) para conferir resistÃncia ao ataque de insetos. Contudo, essas proteÃnas sÃo ativas contra lepidÃpteros, enquanto que a principal praga da cotonicultura brasileira à um coleÃptero, o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis). Neste contexto, tÃm-se feito um grande esforÃo na busca por novas molÃculas Cry ativas contra coleÃpteros. Utilizando tÃcnicas de evoluÃÃo molecular dirigida in vitro, foi desenvolvida a proteÃna mutante Cry8Ka5, que à vÃrias vezes mais tÃxica contra o bicudo do que a proteÃna original, Cry8Ka1, inicialmente descoberta. Dada a sua atividade promissora contra coleÃpteros, Cry8Ka5 està sendo utilizada para o desenvolvimento de um novo algodÃo Bt, bem como de outras culturas Bt de importÃncia econÃmica. No entanto, como parte das exigÃncias legais para a liberaÃÃo comercial de uma planta transgÃnica, essa proteÃna recombinante deve ser testada quanto a sua biosseguranÃa alimentar (BA) a fim de detectar potenciais efeitos alergÃnicos, tÃxicos e/ou antimetabÃlicos. Assim, este trabalho objetivou realizar uma ampla avaliaÃÃo de BA da proteÃna mutante Cry8Ka5 e da proteÃna Cry1Ac, jà incorporada em vÃrias culturas Bt comercializadas. A Ãltima foi utilizada como proteÃna controle ou teste dependendo do ineditismo da abordagem empregada em cada seÃÃo do trabalho. Nesse Ãmbito, a avaliaÃÃo de BA proposta cobriu desde as exigÃncias legais atà a execuÃÃo de metodologias, atà entÃo, nunca propostas para avaliaÃÃo de seguranÃa de consumo de produtos de Bt. Para tanto, este trabalho estruturou-se em quatro capÃtulos. O CapÃtulo 1 objetivou realizar uma revisÃo da literatura acerca do estado da arte das plantas Bt e proteÃnas Cry, bem como fornecer um entendimento geral sobre os conceitos e a legislaÃÃo vigente em BA de plantas GM. Jà o CapÃtulo 2 objetivou avaliar a BA da entomotoxina mutante Cry8Ka5 atravÃs do mÃtodo de duas etapas baseado em pesos de evidÃncia que, por sua vez, atende a todas as recomendaÃÃes da CTNBio. Neste caso, a proteÃna Cry1Ac foi utilizada como controle experimental, pois abordagens similares jà foram realizadas com essa molÃcula. Baseando-se nos mÃtodos oficiais, à possÃvel concluir que nÃo à esperado qualquer risco associado ao consumo da proteÃna Cry8Ka5 devido aos seguintes resultados encontrados: 1. Produtos Bt mostraram ter longo histÃrico de uso seguro; 2. A proteÃna Cry8Ka5 nÃo mostrou similaridade significativa de sua sequÃncia de aminoÃcidos primÃria com proteÃnas alergÃnicas, tÃxicas e/ou antinutricionais; 3. As proteÃnas Cry mostraram possuir modo de aÃÃo bastante compreendido e elevada especificidade contra insetos; 4. Cry8Ka5 foi altamente susceptÃvel à digestÃo em fluÃdo gÃstrico simulado; 5. A proteÃna Cry8Ka5 nÃo causou efeitos adversos relevantes em camundongos (5.000 mg de proteÃna/Kg de peso corpÃreo, via oral, dose Ãnica). Por sua vez, o CapÃtulo 3 objetivou avaliar a proteÃna Cry8Ka5 e a Cry1Ac quanto aos seus efeitos cito- e genotÃxicos em uma sÃrie de testes clÃssicos e alternativos, alÃm de pesquisar seus efeitos antimicrobianos. As proteÃnas nÃo causaram efeitos cito- ou genotÃxicos em linfÃcitos humanos (ambas com CI50 > 1.000 Âg/mL em todos os testes), nÃo promoveram hemÃlise em suspensÃes de eritrÃcitos de humanos (tipos A, B, AB e O), de coelho e rato (ambas com CI50 > 1.000 Âg/mL para todas as espÃcies), enquanto somente a Cry8Ka5 causou alteraÃÃes na topografia de membrana celular de eritrÃcitos humanos do tipo O, na concentraÃÃo de 1.000 Âg/mL, detectadas via microscopia de forÃa atÃmica. AlÃm disso, as proteÃnas Cry8Ka5 e Cry1Ac nÃo apresentaram citotoxicidade elevada contra naÃplios de Artemia sp. (CL50 > 700 e > 1000 Âg/mL, respectivamente) e nÃo inibiram o crescimento de quatro cepas de bactÃrias e quatro de leveduras (ambas com CIM > 1.000 Âg/mL para todos os microrganismos testados). Por fim, o CapÃtulo 4 objetivou avaliar os efeitos das proteÃnas Cry8Ka5 e Cry1Ac e de um âpoolâ de peptÃdeos de cada uma (Cry8Ka5-pep e Cry1Ac-pep, respectivamente), obtidos por digestÃo sequencial in vitro, sobre o perfil de expressÃo gÃnica de cÃlulas de carcinoma de mama MCF-7 e de carcinoma de cÃlon Caco-2, ambas de origem humana. Nenhuma das amostras testadas causou alteraÃÃes no perfil de expressÃo gÃnica das cÃlulas Caco-2 diferenciadas (utilizadas como um modelo de epitÃlio intestinal humano), mesmo quando testadas em alta concentraÃÃo (100 Âg/mL). Nos testes de exposiÃÃo com cÃlulas MCF-7 indiferenciadas, apenas a proteÃna Cry1Ac causou alteraÃÃes significativas no padrÃo de expressÃo gÃnica. Contudo, esse efeito nÃo foi detectado apÃs tratamento dessas cÃlulas com a amostra digerida de Cry1Ac (Cry1Ac-pep), que, por sua vez, mimetiza melhor as condiÃÃes reais de exposiÃÃo Ãs molÃculas Cry. As abordagens experimentais utilizadas nos trÃs Ãltimos capÃtulos mostraram-se bastante Ãteis e, apÃs tudo que foi exposto, foi possÃvel confirmar o carÃter inÃcuo da proteÃna Cry1Ac, bem como concluir que a proteÃna Cry8Ka5 à uma ferramenta biotecnolÃgica segura para o desenvolvimento de plantas de algodÃo Bt para conferir resistÃncia ao ataque do bicudo-do-algodoeiro. / Currently at least 12 varieties of cotton expressing Cry proteins from Bacillus thruringiensis (Bt) are released for sale in Brazil to confer resistance to insect attack. However, these proteins are active against lepidopteran, whereas the major pest of Brazilian cotton is a beetle, the cotton boll weevil (Anthonomus grandis). In this context, great efforts have been dedicated in the search for new Cry molecules active against coleopteran. Using techniques of in vitro directed molecular evolution, the Cry8Ka5 mutant protein was developed, which is several times more toxic against the boll weevil than the original protein, Cry8Ka1, initially discovered. Given its promising activity against coleopteran, Cry8Ka5 is being used for the development of a new Bt cotton, as well as of other Bt crops of economic importance. However, as part of legal requirements for the commercial release of a transgenic plant, the recombinant products should be tested for their food safety (FS) in order to detect potential allergenic, toxic and antimetabolic effects. This study aimed to perform a comprehensive FS assessment of the Cry8Ka5 mutant protein and of the Cry1Ac protein, already incorporated in several commercialized Bt crops. The latter was used as a protein control or test depending on the originality of the approach used in each section of this work. The FS evaluation performed covered not only the legal requirements but also the implementation of methodologies hitherto never proposed to assess the safety of consumption of Bt. For that, this study was structured in four chapters. Chapter 1 aimed to conduct a literature review on the state of the art of Bt plants and Cry proteins, as well as provide a general understanding of the concepts and current legislation in GM plants FS. Chapter 2 aimed to evaluate the FS of Cry8Ka5 mutant entomotoxin through the two-step method based on weights of evidence that, in turn, meets the recommendations of CTNBio. In this section, the Cry1Ac protein was used as experimental control, since similar approaches have already been performed with this molecule. Based on official methods, we conclude that it is not expected any risk associated with consumption of protein Cry8Ka5 due to the following results found: 1. Bt products were shown to have a long history of safe use, 2. The protein showed no significant similarity in its primary amino acid sequence with known allergenic, toxic and/or antinutritional proteins; 3. The mode of action and high specificity against insects of Cry proteins are well known; 4. Cry8Ka5 was highly susceptible to digestion in simulated gastric fluid; 5. The protein Cry8Ka5 caused no significant adverse effects in mice (5,000 mg protein/kg body weight, orally, single dose). Chapter 3 aimed to evaluate the Cry8Ka5 and Cry1Ac proteins as to their cyto- and genotoxicity in a serie of conventional and alternative tests as well as antimicrobial effects. The proteins did not cause cyto- or genotoxic effects in human lymphocytes (both with IC50 > 1,000 Âg/mL in all tests), did not cause hemolysis in human (types A, B, AB and O), rabbit and rat (both with IC50 > 1,000 Âg/mL for all species) rythrocytes, but only Cry8Ka5 caused changes in the topography of the cell membrane of human O type erythrocytes at a concentration of 1,000 Âg/mL, detected by atomic force microscopy. Furthermore, the Cry8Ka5 and Cry1Ac proteins showed no cytotoxicity against Artemia sp. nauplii (LC50 > 700 and >1000 Âg/mL, respectively), and did not inhibit the growth of four strains of bacteria and four of yeasts (both with MIC > 1,000 Âg/mL for all microrganisms tested). Finally, Chapter 4 aimed to evaluate the effects of Cry8Ka5 and Cry1Ac proteins and of a "pool" of peptides of each one (Cry8Ka5-pep and Cry1Ac-pep, respectively), obtained by in vitro sequential digestion, on the gene expression profile of MCF-7 breast carcinoma cells and Caco-2 colon carcinoma cells, both human. No sample caused changes in the gene expression profile of differentiated Caco-2 cells (used as a model for human intestinal epithelium), even when tested at high concentration (100 Âg/mL). In the exposure tests with undifferentiated MCF-7 cells, only Cry1Ac (at 100 Âg/mL) caused significant changes in the gene expression pattern. However, this effect was not detected after treatment of these cells with the sample digested of Cry1Ac Cry1Ac-pep), which, in turn, better mimic actual conditions of exposure to Cry molecules. The experimental approaches used in the last three chapters were quite useful and, after all the above, it was possible to confirm the harmless nature of the Cry1Ac protein and conclude that the Cry8Ka5 protein is a safe biotechnological tool for the development of Bt cotton plants to confer resistance against the cotton boll weevil attack.

Bt é uma bactéria formadora da proteína Cry1Ac, tóxica a lepidópteros. Plantas geneticamente modificadas expressam essa toxina. O objetivo deste trabalho foi isolamento e identificação de bactérias do solo de algodão transgênico e convencional potencialmente biodegradadoras dessa proteína. Estudou-se a dinâmica de crescimento das bactérias em meios com a proteína Cry1Ac ou glucose, a biodegradação, os genes apr, npr e sub. Em solo de algodão convencional a contagem foi menor; para algodão transgênico foi maior. Seis bactérias foram identificadas. O crescimento da bactéria B. pumilus foi maior em meio com a proteína Cry1Ac que glucose e a bactéria G. rubripertincta em meio contendo glucose teve o crescimento maior do que com a proteína Cry1Ac. Foi verificada a biodegradação da proteína pelas bactérias Bp e Gr. Os genes apr e sub foram detectados em solo de planta transgênica e o gene npr não. / Bacillus thuringiensis is a bacterium that forms the Cry1Ac protein, toxic to lepidopteran. Genetically modify plants expressing this toxin. The objective of this work was the isolation and identification bacteria from soil cultivated with transgenic cotton and conventional with potential degradation of this protein. We studied the dynamics growth from bacteria in media with the Cry1Ac protein or glucose, the biodegradation genes apr, npr and sub. In soil of conventional cotton, count was lower, for Bt cotton were higher. Six strains were identified. The growth bacterium B. pumilus was higher in medium with the Cry1Ac protein than bacteria with glucose and G. rubripertincta in medium containing glucose had higher growth than the Cry1Ac protein. Were verified Cry1Ac protein degradation by the bacteria Bp and Gr. Genes apr and sub were detected in soil with transgenic plant and the gene npr were not.

Global large-scale adoption of Bt transgenic crops has provided effective management of key insect pests and have greatly reduced insecticide use. However, some field populations of several insect species have evolved resistance to Bt crops in the field, which threatens the continuing success of Bt crops. The cotton bollworm (Helicoverpa zea) is among the first pest reported to have field-evolved resistance to Cry1Ac and Cry2Ab, but the underlying mechanisms remain largely unknown. To determine the current resistance status of the field populations of H. zea and to elucidate the mechanisms of Bt resistance in this pest, I conducted a series of experiments including bioassays of field populations as well as biochemical and molecular comparisons of midgut proteases and putative Cry1Ac receptors between Cry1Ac-susceptible and -resistant strains. Diet incorporation bioassays of six field populations of H. zea collected from Tifton, Georgia USA in 2008 and 2009 indicated that, comparing to LAB-S, a susceptible laboratory strain, all six field populations were significantly resistant to Cry1Ac toxin and one of three field strains was significantly resistant to Cry2Ab toxin. Across the five populations, survival on leaf-discs producing Cry1Ac was positively correlated to the lethal concentration that kills 50% of the population (LC₅₀) for Cry1Ac from diet bioassays. These results support previous findings of field-evolved resistance to Bt crops in H. zea and suggest an overall increase in resistance to Cry1Ac from 2002 to 2009.One of the six field population, which was designed as GA and had 55-fold resistance to Cry1Ac, was further selected with Cry1Ac in the laboratory to generate a more resistant strain, which was designated as GA-R and had 560-fold resistance to Cry1Ac. Total protease activity of the midgut extracts from GA-R and GA strains is significantly lower than that from the susceptible laboratory strain LAB-S. Among the proteases contributing to the total activity, trypsin-like and chymotrypsin-like activities of GA-R and GA midgut extracts are significantly lower than that from the susceptible strain, while no difference in elastase-like activity is evident. Decreased proteolytic activity was correlated to the decreased Cry1Ac activation rate of midgut extracts of the GA-R and GA strains. Cytotoxicity assays with H. zea midgut cells show that the product of Cry1Ac protoxin digested with GA-R and GA midgut extracts has significantly lower cytotoxicity when compared with that digested with the susceptible strain midgut extracts. Transcriptional analysis of a limited number of protease genes did not identify specific proteases involved in the decline in Cry1Ac activation in GA-R and GA. These results indicate that the decreased Cry1Ac activation rate by midgut proteases is involved in the field originated Cry1Ac resistance in the H. zea GA-R and GA strains. I also compared the cDNA sequences and expression levels of the putative Cry1Ac receptors cadherin, aminopeptidase 1 (APN1), alkaline phosphatase 2 (ALP2) and ATP-binding cassette subfamily C member 2 (ABCC2) in LAB-S and GA-R. No indels (insertions and deletions) were found in the cDNA sequences of the resistant alleles of the four receptors, relative to those of the susceptible alleles. While there were no amino acid point mutations in the resistant alleles of ALP2 and ABCC2, we found 2 and 14 consistent amino acid point mutations in the resistant alleles of cadherin and APN1, respectively. However, neither cadherin nor APN1 point mutations were genetically linked to Cry1Ac resistance in GA-R. Quantitative RT-PCR analysis revealed no differences in the transcripts of the four receptors between the two strains. Taken together, these results indicate that the four receptors are not involved in Cry1Ac resistance in the GA-R strain of H. zea.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:25:18Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-22Bitstream added on 2014-06-13T18:47:49Z : No. of bitstreams: 1 funichello_m_me_jabo.pdf: 341179 bytes, checksum: a0bafa4e42029536b71b4b43944467f2 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Este trabalho teve como objetivos estudar os parâmetros biológicos de Aphis gossypii nas cultivares comerciais NuOPAL (Bollgard I) e DeltaOPAL, assim como do predador Cycloneda sanguinea, tendo como presa pulgões criados na cultivar transgênica NuOPAL e na sua isolinha DeltaOPAL. Os experimentos foram realizados em laboratório sob condições controladas de temperatura (25 ± 1º C), umidade relativa (70 ± 10%) e fotofase (12 horas), e em casa de vegetação da FCAV/UNESP, em Jaboticabal, SP. No experimento da biologia do pulgão a duração dos estádios ninfais e fase ninfal, duração do período reprodutivo, pós-reprodutivo, longevidade das fêmeas e número total de ninfas por fêmea, não apresentaram diferenças significativas, assim como os parâmetros de fertilidade. A cultivar transgênica NuOPAL não afetou a biologia de A. gossypii em relação a sua isolinha não-Bt. No experimento da biologia de C. sanguinea alimentadas com A. gossypii, a duração da fase larval foi menor quando alimentadas com pulgões criados na cultivar NuOPAL, enquanto a longevidade dos adultos e o período reprodutivo foram maiores. A fertilidade das fêmeas e viabilidade de ovos também foram menores / The objective of this work was to study the biological parameters of Aphis gossypii in NuOPAL cultivars (Bollgard I) and DeltaOPAL, as well as the predator Cycloneda sanguinea with the aphid prey reared on transgenic cultivar NuOPAL and its isoline DeltaOPAL. The experiments were performed in the laboratory under controlled temperature (25 ± 1 º C), humidity (70 ± 10%) and photophase (12 hours) and a greenhouse of FCAV / UNESP, Jaboticabal, SP. In the experiment of the biology of aphids the duration of nymphal phases, duration of reproductive period, post-reproductive longevity of females and total number of nymphs per female, showed no significant differences, as well as the parameters of fertility. The cultivar NuOPAL transgenic cultivar not affect the biology of A. gossypii in relation to its non-Bt isoline. In the experiment of the biology of C. sanguinea fed aphids A. gossypii the larval period was shorter when fed aphids reared on the cultivar NuOPAL, while the longevity of adults and the reproductive period were higher. The female fertility and egg viability were also lower

Submitted by DANIELA DE LIMA VIANA null (danielaviana28@gmail.com) on 2018-03-12T18:58:25Z No. of bitstreams: 1 Tese_Daniela_de_Lima_Viana.pdf: 1718435 bytes, checksum: fb23294ce65ac4d0c05140ed95a1d66d (MD5) / Approved for entry into archive by Neli Silvia Pereira null (nelisps@fcav.unesp.br) on 2018-03-13T13:15:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 viana_dl_dr_jabo.pdf: 1718435 bytes, checksum: fb23294ce65ac4d0c05140ed95a1d66d (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-13T13:15:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 viana_dl_dr_jabo.pdf: 1718435 bytes, checksum: fb23294ce65ac4d0c05140ed95a1d66d (MD5) Previous issue date: 2018-02-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O cenário agrícola no Centro Oeste conta com os chamados sistemas de produção, nos quais os cultivos ocorrem de forma constante e sucessiva durante um mesmo ano agrícola. No entanto, isso tem propiciado problemas cada vez mais frequentes relacionados a alguns grupos de pragas, dentre eles os lepidópteros. Espécies como Chrysodeixis includens e o complexo de Spodoptera vem crescendo de importância, causando prejuízos, principalmente em culturas como a soja e o algodoeiro. Dentre os métodos mais utilizados para o controle de insetos-praga no Brasil, destaca-se o uso de OGM, a partir da inserção de genes da bactéria Bacillus thuringiensis (Bt), com expressão de proteínas com ações inseticidas. Entretanto, um dos grandes problemas é a seleção de populações de pragas resistentes aos cultivos Bt devido ao uso contínuo e inadequado da tecnologia. Diante disso, os objetivos do presente estudo foram avaliar os efeitos de cultivares Bt de soja e algodoeiro, que expressam proteínas inseticidas Cry, sobre os aspectos biológicos de C. includens em laboratório, como também avaliar a dinâmica populacional e a infestação natural de lagartas de C. includens e de Spodoptera spp. em condições de campo, no estado do Mato Grosso. Para o estudo dos aspectos biológicos, utilizou-se lagartas neonatas que foram alimentadas com folhas das cultivares de soja e algodoeiro não Bt e Bt de diferentes tecnologias. Os experimentos de campo foram realizados em área experimental do IMAmt na safra 2016/2017, utilizando cultivares de soja e algodoeiro não Bt e Bt com expressão de diferentes proteínas Cry. As cultivares de soja Bt, que expressam a proteína Cry1Ac, afetam os parâmetros biológicos de C. includens, controlando de maneira eficiente, tanto em laboratório quanto em campo. Em relação às lagartas de Spodoptera spp. observou-se que as cultivares de soja Bt não controlam eficientemente esses lepidópteros. A cultivar de algodoeiro que expressa a proteína Cry1Ac, causa pouco efeito sobre as lagartas de C. includens, não apresentando controle satisfatório, tanto nos aspectos biológicos observados em laboratório quanto na infestação em campo, se comportando de forma similar à cultivar de algodoeiro não Bt. As cultivares de algodoeiro Bt piramidadas, Cry1Ac+Cry1F, Cry1Ac+Cry2Ab2 e Cry1Ab+Cry2Ae, apresentaram controle de C. includens, afetando a sobrevivência de lagartas pequenas em laboratório e campo. Por outro lado, a piramidação de cultivares por si só não é suficiente, por exemplo, para as lagartas de Spodoptera spp. Nos eventos de algodão Bt em campo, verificou-se que as cultivares que expressam as proteínas Cry1Ac e Cry1Ac+Cry1F, não suprimem suas infestações, enquanto que nas cultivares piramidadas que expressam Cry1Ac+Cry2Ab2 e Cry1Ab+Cry2Ae a supressão foi considerada eficiente. / The agricultural scenario in the brazilian midwest counts on the socalled production systems, in which crops occur constantly and successively during the same agricultural year. However, this has caused increasingly frequent problems related to some groups of pests, among them the Lepidoptera. Species such as Chrysodeixis includens and the Spodoptera complex have been increasing in importance, causing damage, especially in crops such as soybean and cotton. Among the most used methods for the control of insect pests in Brazil, the use of GMOs, from the insertion of genes of the bacterium Bacillus thuringiensis (Bt), with expression of proteins with insecticidal actions, stands out. However, one of the major problems is the selection of populations of pests resistant to Bt crops due to the continuous and inadequate use of the technology. The objectives of the present study were to evaluate the effects of Bt cultivars of soybean and cotton, which express insecticidal Cry proteins, on the biological aspects of C. includens in the laboratory, as well as to evaluate the population dynamics and the natural infestation of caterpillars C. includens and Spodoptera spp. under field conditions, in the state of Mato Grosso. For the study of the biological aspects, we used caterpillars that were fed with leaves of the cultivars of soybean and non-Bt and Bt cotton of different technologies. Field experiments were carried out in the experimental area of the IMAmt in the 2016/2017 season, using soybean and cotton cultivars non-Bt and Bt with different Cry protein expression. Soybean Bt cultivars, which express the Cry1Ac protein, affect the biological parameters of C. includens, efficiently controlling both in the laboratory and in the field. In relation to the caterpillars of Spodoptera spp., it was observed that Bt soybean cultivars do not efficiently control these lepidoptera. The cotton cultivar that expresses the Cry1Ac protein causes little effect on the caterpillars of C. includens, not showing satisfactory control, both in the biological aspects observed in the laboratory and in the infestation in the field, behaving in a similar way to the cultivar of non-Bt cotton. Cotton Bt cultivars, Cry1Ac+Cry1F, Cry1Ac+Cry2Ab2 and Cry1Ab+Cry2Ae, showed control of C. includens, affecting the survival of small caterpillars in the laboratory and in the field. On the other hand, the pyramiding of cultivars alone is not sufficient, for example, for the caterpillars of Spodoptera spp. In the field cotton Bt events, it was found that cultivars expressing the Cry1Ac and Cry1Ac+Cry1F proteins do not suppress their infestations, whereas in pyrite cultivars expressing Cry1Ac+Cry2Ab2 and Cry1Ab+Cry2Ae suppression was considered efficient.

Submitted by ONIEL JEREMIAS AGUIRRE GIL null (oaguirretm@outlook.com) on 2016-11-18T19:43:27Z No. of bitstreams: 1 Tese_Versão_definitiva_PDF.pdf: 2376464 bytes, checksum: 98c10cbf6c2dc00d45f713eb74c82f7f (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-11-24T15:13:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 gil_oj_dr_jabo.pdf: 2376464 bytes, checksum: 98c10cbf6c2dc00d45f713eb74c82f7f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-24T15:13:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 gil_oj_dr_jabo.pdf: 2376464 bytes, checksum: 98c10cbf6c2dc00d45f713eb74c82f7f (MD5) Previous issue date: 2016-11-04 / Outra / Microcharops anticarsiae é um eficiente parasitoide da lagarta-dasoja Anticarsia gemmatalis que, também, parasita lagartas de outras espécies como Chrysodeixis includens e Spodoptera eridania. O objetivo do trabalho foi (1) determinar o ínstar larval de A. gemmatalis preferencialmente parasitado por M. anticarsiae a partir de lagartas coletadas em campo, (2) determinar o efeito de criações sucessivas de M. anticarsiae nos parâmetros biológicos do parasitoide e (3) determinar o efeito da soja transgênica sobre a longevidade de adultos do parasitoide. Os experimentos foram conduzidos nos anos agrícolas de 2014/15 e 2015/16 na FCAV/UNESP, Jaboticabal, SP, Brasil. Para a coleta das lagartas em campo, foram semeadas duas áreas de soja transgênica, uma tolerante ao herbicida glifosato e a outra resistente a insetos. Os resultados indicam que (1) M. anticarsiae preferiu parasitar lagartas de A. gemmatalis de primeiro e segundo ínstar em soja tolerante ao glifosato em campo, (2) não houve diferenças nos parâmetros biológicos de M. anticarsiae criado durante três gerações sucessivas em laboratório e (3) a longevidade total de M. anticarsiae e a longevidade de fêmeas foi mais longa em soja tolerante ao glifosato e a longevidade dos machos foi mais curta em ambas as sojas, tolerante ao glifosato e resistente a insetos. Finalmente, conclui-se que M. anticarsiae parasita lagartas de A. gemmatalis de primeiro e segundo ínstar em campo, que os parâmetros biológicos de M. anticarsiae não são afetados quando criados durante três gerações em laboratório e que a soja resistente a insetos afeta negativamente a longevidade dos machos de M. anticarsiae. / Microcharops anticarsiae is an efficient parasitoid of Anticarsiagemmatalis and also parasitizes larvae of other species such as Chrysodeixis includens and Spodoptera eridania. This work aimed to (1) determine the larval ínstar of A. gemmatalis preferentially parasitized by M. anticarsiae from larvae collected in the field, (2) determine the effect of successive laboratory rearings of M. anticarsiae in the biological parameters of the parasitoid, and (3) determine the effect of transgenic soybean in the longevity of adults of the parasitoid. the experiments were carried out in the seasons 2014/2015 and 2015/2016 in the FCAV/UNESP, Jaboticabal, SP, Brasil. Two areas were sown with transgenic soybean, the first one tolerant to glyphosate and the second one resistant to insects. The results indicate that (1) M. anticarsiae preferred to parasitize A. gemmatalis larvae on the first and second larval ínstar in soybean tolerant to glyphosate in the field, (2) there were not differences in the biological parameters of M. anticarsiae reared during three successive laboratory rearings, and (3) the longevity total of M. anticarsiae and longevity of females was longer in soybean tolerant to glyphosate and the longevity of males was shorter in soybean tolerant to glyphosate and resistant to insects. Finally, we conclude that M. anticarsiae parasitize first and second ínstar larvae of A. gemmatalis in the field, the biological parameters of M. anticarsiae are not affected when reared during three generations in the laboratory, and the soybean resistant to insects affects negatively the longevity of males M. anticarsiae.

Orientador: Antonio Carlos Busoli / Banca: Arlindo Leal Boiça Júnior / Banca: Marcos Doniseti Michelotto / Resumo: Este trabalho teve como objetivos estudar os parâmetros biológicos de Aphis gossypii nas cultivares comerciais NuOPAL (Bollgard I) e DeltaOPAL, assim como do predador Cycloneda sanguinea, tendo como presa pulgões criados na cultivar transgênica NuOPAL e na sua isolinha DeltaOPAL. Os experimentos foram realizados em laboratório sob condições controladas de temperatura (25 ± 1º C), umidade relativa (70 ± 10%) e fotofase (12 horas), e em casa de vegetação da FCAV/UNESP, em Jaboticabal, SP. No experimento da biologia do pulgão a duração dos estádios ninfais e fase ninfal, duração do período reprodutivo, pós-reprodutivo, longevidade das fêmeas e número total de ninfas por fêmea, não apresentaram diferenças significativas, assim como os parâmetros de fertilidade. A cultivar transgênica NuOPAL não afetou a biologia de A. gossypii em relação a sua isolinha não-Bt. No experimento da biologia de C. sanguinea alimentadas com A. gossypii, a duração da fase larval foi menor quando alimentadas com pulgões criados na cultivar NuOPAL, enquanto a longevidade dos adultos e o período reprodutivo foram maiores. A fertilidade das fêmeas e viabilidade de ovos também foram menores / Abstract: The objective of this work was to study the biological parameters of Aphis gossypii in NuOPAL cultivars (Bollgard I) and DeltaOPAL, as well as the predator Cycloneda sanguinea with the aphid prey reared on transgenic cultivar NuOPAL and its isoline DeltaOPAL. The experiments were performed in the laboratory under controlled temperature (25 ± 1 º C), humidity (70 ± 10%) and photophase (12 hours) and a greenhouse of FCAV / UNESP, Jaboticabal, SP. In the experiment of the biology of aphids the duration of nymphal phases, duration of reproductive period, post-reproductive longevity of females and total number of nymphs per female, showed no significant differences, as well as the parameters of fertility. The cultivar NuOPAL transgenic cultivar not affect the biology of A. gossypii in relation to its non-Bt isoline. In the experiment of the biology of C. sanguinea fed aphids A. gossypii the larval period was shorter when fed aphids reared on the cultivar NuOPAL, while the longevity of adults and the reproductive period were higher. The female fertility and egg viability were also lower / Mestre