A criopreservação de embriões de peixes vem sendo investigada há mais de duas décadas, no entanto todos os protocolos testados até o momento falharam. A utilização de oócitos, mais recentemente, foi relatada como uma alternativa, no entanto, a maioria dos estudos foram realizados utilizando uma única técnica - o congelamento lento controlado - não alcançando nenhum êxito. A vitrificação é um método de criopreservação livre de gelo, apresentando diversas vantagens que podem contribuir para superar algumas das dificuldades relacionadas com a criopreservação de oócitos de peixes. No presente estudo desenvolveu-se um protocolo de vitrificação para folículos ovarianos de zebrafish em estádio III. Uma série de crio-soluções foram formuladas e testadas quanto à sua capacidade de vitrificação empregando diferentes dispositivos (palheta plástica, bloco de vitrificação e fibreplugTM). A toxicidade das soluções de vitrificação foi avaliada através da análise de integridade da membrana dos folículos ovarianos utilizando coloração com trypan blue. Além disso, foi investigado o efeito do protocolo de vitrificação sobre os folículos em nível sub-celular, através da medição da concentração de ATP citoplasmático e da distribuição e atividade mitocondrial, utilizando sonda fluorescente JC-1 e microscopia confocal. Após a vitrificação, os folículos ovarianos apresentaram integridade de membrana de 59,9 ± 18,4% quando o fibreplug e a solução V16 (1.5 M metanol + 4.5 M propileno glicol) foram empregados. Quando vitrificados em V2 (1.5 M metanol + 5.5 M DMSO) a integridade de membrana diminuiu para 42,0 ± 21,0%. Observou-se que os folículos localizados no meio do fragmento foram mais protegidos de injúrias apresentando satisfatória aparência quanto a sua morfologia mesmo 2 h após o aquecimento. A integridade mitocondrial das células da camada da granulosa foi claramente prejudicada pelo protocolo de vitrificação e o nível de ATP nos folículos diminuiu significativamente (P < 0,05) após o aquecimento. A vitrificação de folículos ovarianos de zebrafish em estádio III e seu efeito em nível de subcelular são relatados aqui pela primeira vez. As informações obtidas a partir deste estudo serão muito úteis para guiar o desenvolvimento e otimização de um protocolo para a criopreservação de oócitos de peixes no futuro. / Cryopreservation of fish embryos has been under investigation for over two decades; however every protocol tested so far has failed. The use of oocytes has more recently been reported as an alternative, nevertheless most of the studies were carried out using a single technique - controlled slow cooling - and success also remains elusive. Vitrification is an ice-free cryopreservation method which offers several advantages that may contribute to overcome some of the difficulties involved with fish oocytes cryopreservation. In the present study we developed a vitrification protocol for stage III zebrafish ovarian follicles in ovarian tissue fragments. A series of cryo-solutions were designed and tested for their vitrifying ability using different devices (plastic straw, vitrification block and fibreplugTM). Toxicity of vitrification solutions was evaluated by assessing membrane integrity with trypan blue staining. In addition, we investigated the effect of vitrification protocol on the follicles at sub-cellular level by measuring the cytoplasmic ATP content and the mitochondrial distribution and activity using JC-1 probe and confocal microscopy. After vitrification, ovarian follicles showed membrane integrity of 59.9 ± 18.4% when fibreplug and V16 (1.5 M methanol + 4.5 M propylene glycol) solution were employed. When vitrified in V2 (1.5 M methanol + 5.5 M DMSO) the membrane integrity decreased to 42.0 ± 21.0%. We observed that follicles located in the middle of the fragments were more protected from injuries and some of them showed satisfactory morphological appearance even two hours post-warming. Mitochondria integrity of granulosa cells layer was clearly damaged by the vitrification protocol and ATP level in the follicles declined significantly (P < 0.05) after warming. Vitrification of stage III zebrafish follicles in ovarian tissue fragments and its effect at sub-cellular level is reported here for the first time. Information gained from this study will be very useful to guide development of a successful protocol for cryopreservation of fish oocytes in the future.

A criopreservação de embriões de peixes vem sendo investigada há mais de duas décadas, no entanto todos os protocolos testados até o momento falharam. A utilização de oócitos, mais recentemente, foi relatada como uma alternativa, no entanto, a maioria dos estudos foram realizados utilizando uma única técnica - o congelamento lento controlado - não alcançando nenhum êxito. A vitrificação é um método de criopreservação livre de gelo, apresentando diversas vantagens que podem contribuir para superar algumas das dificuldades relacionadas com a criopreservação de oócitos de peixes. No presente estudo desenvolveu-se um protocolo de vitrificação para folículos ovarianos de zebrafish em estádio III. Uma série de crio-soluções foram formuladas e testadas quanto à sua capacidade de vitrificação empregando diferentes dispositivos (palheta plástica, bloco de vitrificação e fibreplugTM). A toxicidade das soluções de vitrificação foi avaliada através da análise de integridade da membrana dos folículos ovarianos utilizando coloração com trypan blue. Além disso, foi investigado o efeito do protocolo de vitrificação sobre os folículos em nível sub-celular, através da medição da concentração de ATP citoplasmático e da distribuição e atividade mitocondrial, utilizando sonda fluorescente JC-1 e microscopia confocal. Após a vitrificação, os folículos ovarianos apresentaram integridade de membrana de 59,9 ± 18,4% quando o fibreplug e a solução V16 (1.5 M metanol + 4.5 M propileno glicol) foram empregados. Quando vitrificados em V2 (1.5 M metanol + 5.5 M DMSO) a integridade de membrana diminuiu para 42,0 ± 21,0%. Observou-se que os folículos localizados no meio do fragmento foram mais protegidos de injúrias apresentando satisfatória aparência quanto a sua morfologia mesmo 2 h após o aquecimento. A integridade mitocondrial das células da camada da granulosa foi claramente prejudicada pelo protocolo de vitrificação e o nível de ATP nos folículos diminuiu significativamente (P < 0,05) após o aquecimento. A vitrificação de folículos ovarianos de zebrafish em estádio III e seu efeito em nível de subcelular são relatados aqui pela primeira vez. As informações obtidas a partir deste estudo serão muito úteis para guiar o desenvolvimento e otimização de um protocolo para a criopreservação de oócitos de peixes no futuro. / Cryopreservation of fish embryos has been under investigation for over two decades; however every protocol tested so far has failed. The use of oocytes has more recently been reported as an alternative, nevertheless most of the studies were carried out using a single technique - controlled slow cooling - and success also remains elusive. Vitrification is an ice-free cryopreservation method which offers several advantages that may contribute to overcome some of the difficulties involved with fish oocytes cryopreservation. In the present study we developed a vitrification protocol for stage III zebrafish ovarian follicles in ovarian tissue fragments. A series of cryo-solutions were designed and tested for their vitrifying ability using different devices (plastic straw, vitrification block and fibreplugTM). Toxicity of vitrification solutions was evaluated by assessing membrane integrity with trypan blue staining. In addition, we investigated the effect of vitrification protocol on the follicles at sub-cellular level by measuring the cytoplasmic ATP content and the mitochondrial distribution and activity using JC-1 probe and confocal microscopy. After vitrification, ovarian follicles showed membrane integrity of 59.9 ± 18.4% when fibreplug and V16 (1.5 M methanol + 4.5 M propylene glycol) solution were employed. When vitrified in V2 (1.5 M methanol + 5.5 M DMSO) the membrane integrity decreased to 42.0 ± 21.0%. We observed that follicles located in the middle of the fragments were more protected from injuries and some of them showed satisfactory morphological appearance even two hours post-warming. Mitochondria integrity of granulosa cells layer was clearly damaged by the vitrification protocol and ATP level in the follicles declined significantly (P < 0.05) after warming. Vitrification of stage III zebrafish follicles in ovarian tissue fragments and its effect at sub-cellular level is reported here for the first time. Information gained from this study will be very useful to guide development of a successful protocol for cryopreservation of fish oocytes in the future.

A criopreservação de embriões de peixes vem sendo investigada há mais de duas décadas, no entanto todos os protocolos testados até o momento falharam. A utilização de oócitos, mais recentemente, foi relatada como uma alternativa, no entanto, a maioria dos estudos foram realizados utilizando uma única técnica - o congelamento lento controlado - não alcançando nenhum êxito. A vitrificação é um método de criopreservação livre de gelo, apresentando diversas vantagens que podem contribuir para superar algumas das dificuldades relacionadas com a criopreservação de oócitos de peixes. No presente estudo desenvolveu-se um protocolo de vitrificação para folículos ovarianos de zebrafish em estádio III. Uma série de crio-soluções foram formuladas e testadas quanto à sua capacidade de vitrificação empregando diferentes dispositivos (palheta plástica, bloco de vitrificação e fibreplugTM). A toxicidade das soluções de vitrificação foi avaliada através da análise de integridade da membrana dos folículos ovarianos utilizando coloração com trypan blue. Além disso, foi investigado o efeito do protocolo de vitrificação sobre os folículos em nível sub-celular, através da medição da concentração de ATP citoplasmático e da distribuição e atividade mitocondrial, utilizando sonda fluorescente JC-1 e microscopia confocal. Após a vitrificação, os folículos ovarianos apresentaram integridade de membrana de 59,9 ± 18,4% quando o fibreplug e a solução V16 (1.5 M metanol + 4.5 M propileno glicol) foram empregados. Quando vitrificados em V2 (1.5 M metanol + 5.5 M DMSO) a integridade de membrana diminuiu para 42,0 ± 21,0%. Observou-se que os folículos localizados no meio do fragmento foram mais protegidos de injúrias apresentando satisfatória aparência quanto a sua morfologia mesmo 2 h após o aquecimento. A integridade mitocondrial das células da camada da granulosa foi claramente prejudicada pelo protocolo de vitrificação e o nível de ATP nos folículos diminuiu significativamente (P < 0,05) após o aquecimento. A vitrificação de folículos ovarianos de zebrafish em estádio III e seu efeito em nível de subcelular são relatados aqui pela primeira vez. As informações obtidas a partir deste estudo serão muito úteis para guiar o desenvolvimento e otimização de um protocolo para a criopreservação de oócitos de peixes no futuro. / Cryopreservation of fish embryos has been under investigation for over two decades; however every protocol tested so far has failed. The use of oocytes has more recently been reported as an alternative, nevertheless most of the studies were carried out using a single technique - controlled slow cooling - and success also remains elusive. Vitrification is an ice-free cryopreservation method which offers several advantages that may contribute to overcome some of the difficulties involved with fish oocytes cryopreservation. In the present study we developed a vitrification protocol for stage III zebrafish ovarian follicles in ovarian tissue fragments. A series of cryo-solutions were designed and tested for their vitrifying ability using different devices (plastic straw, vitrification block and fibreplugTM). Toxicity of vitrification solutions was evaluated by assessing membrane integrity with trypan blue staining. In addition, we investigated the effect of vitrification protocol on the follicles at sub-cellular level by measuring the cytoplasmic ATP content and the mitochondrial distribution and activity using JC-1 probe and confocal microscopy. After vitrification, ovarian follicles showed membrane integrity of 59.9 ± 18.4% when fibreplug and V16 (1.5 M methanol + 4.5 M propylene glycol) solution were employed. When vitrified in V2 (1.5 M methanol + 5.5 M DMSO) the membrane integrity decreased to 42.0 ± 21.0%. We observed that follicles located in the middle of the fragments were more protected from injuries and some of them showed satisfactory morphological appearance even two hours post-warming. Mitochondria integrity of granulosa cells layer was clearly damaged by the vitrification protocol and ATP level in the follicles declined significantly (P < 0.05) after warming. Vitrification of stage III zebrafish follicles in ovarian tissue fragments and its effect at sub-cellular level is reported here for the first time. Information gained from this study will be very useful to guide development of a successful protocol for cryopreservation of fish oocytes in the future.

Cette thèse s’inscrit dans le cadre du projet CRB-Anim (Centre de Ressources Biologiques d’Animaux Domestiques) dont le but est de constituer une cryobanque nationale et d’améliorer les techniques de cryoconservation. Aujourd’hui, les ressources biologiques de type reproductif (embryons, sperme, ovocytes) et de type somatique (fibroblastes et cellules souches pluripotentes) sont conservées dans des milieux contenant des produits d’origine animale (POA). L’utilisation actuelle des POA (sérums, lait, jaune d’œuf) pose des problématiques sanitaires (risque de contamination) et scientifiques (manque de reproductibilité liée à la variabilité de composition des POA). Cette étude a pour objectif d’évaluer l’effet d’un milieu de préservation synthétique, chimiquement défini, breveté pour la congélation de cellules de sang de cordon (STEMALPHA.CRYO3) sur la cryoconservation de sperme ovin et bovin, et de cellules souches pluripotentes de lapin. Pour cela, une approche biologique (étude in vitro et in vivo sur le terrain), alliée à une approche physique (étude des cinétiques de refroidissement et caractérisation des propriétés thermodynamiques des milieux de congélation) ont été mis en place.Nos résultats montrent l’intérêt de l’utilisation du STEMALPHA.CRYO3, en tant que substituant aux sérums, dans les solutions de cryoconservation des cellules souches pluripotentes. Néanmoins, notre étude indique que ce produit n’est pas efficace pour protéger le sperme lors de la congélation. Cette thèse confirme l’intérêt de standardiser les procédures de cryoconservation afin d’assurer la qualité des ressources biologiques pour les cryobanques et les échanges internationaux / Nowadays, reproductive (embryos, sperm, oocytes) and somatic (fibroblasts and pluripotent stem cells) resources are cryopreserved in media containing animal-derived products (serum, egg yolk, milk). Using these products raises sanitary (risk of contamination) as well as scientific concerns (reproducibility limits due to the variability of their composition). This study aims to replace animal derived-product in assessing the effect of a synthetic and chemically defined medium, STEMALPHA.CRY03® (Stem Alpha, France), on the cryopreservation of ovine and bovine sperm, and on rabbit pluripotent stem cells. First, a physical approach permitted to study the cooling rates and the characterization of thermodynamic properties of the freezing media. The differential scanning calorimetry allowed us to define their phase transition temperatures (crystallization temperature, melting temperature and enthalpy variation of crystallization, proportional to the amount of crystallized ice). Second, a biological approach was used for the cryopreservation of bovine and ovine sperm, as well as rabbit pluripotent stem cells. Flow cytometry and computer- assisted sperm analyses showed that STEMALPHA.CRY03® impaired bovine sperm, compared to a medium containing animal derived-product. These last results were confirmed in ovine species. Nevertheless, artificial insemination by laparoscopy (n = 270 ewes) counteracts this impairment and allowed an average pregnancy rate of 70 %. Moreover, without any additive in the freezing medium, a similar pregnancy rate was obtained. The study of pluripotent gene expression profile, and analyses of viability and growth rates for the cryopreservation of rabbit pluripotent stem cells confirmed that synthetic media, STEMALPHA.CRY03® (with 4, 5 or 10 % of cryoprotectant) and CryoStor® CS10 (containing 10 % of cryoprotectant) were more efficient than serum-based media. We demonstrate that it is possible to cryopreserve sperm cells and pluripotent stem cells in synthetic and chemically defined media. 0ur results confirmed the interest of a standardized approach for cryopreservation procedures of genetic resources in mammals. This work meets the needs of cryobanking activities (quality policy) and of the regulation development within the framework of international trade

Les milieux de cryopréservation d'embryons contiennent généralement des produits d'origine animale, qui présentent des inconvénients majeurs : une composition variable et insuffisamment définie, et un risque de transmission d'agents pathogènes. La substitution de ces produits par des composés synthétiques chimiquement définis pourrait contribuer à l’amélioration des procédures de cryopréservation d’embryons, en réduisant la variabilité de composition des milieux, et le risque de contamination des ressources conservées.L’objectif de ce travail était d’évaluer l’effet du remplacement de l’albumine sérique bovine utilisée dans les milieux de congélation lente ou de vitrification d’embryons cunicoles et ovins par un milieu synthétique formulé à base d’acide hyaluronique (STEM ALPHA.Cryo3 – « CRYO3 »). Dans un premier temps, les propriétés thermodynamiques des substituts potentiels ont été évaluées à l’aide de la calorimétrie différentielle à balayage. Parallèlement, nous avons optimisé les différents outils expérimentaux dont nous avions besoin pour cette étude. Nous avons adapté un protocole d’évaluation de l'activité mitochondriale (JC-1) pour complémenter l'évaluation morphologique in vitro des embryons de lapin, et nous avons évalué l’efficacité de différents protocoles de superovulation sur la production d’embryons chez la brebis. Dans un second temps, nous avons procédé à la substitution de l’albumine sérique bovine (BSA) utilisée dans des milieux de congélation lente et de vitrification d’embryons cunicoles et ovins par du CRYO3. Une approche in vitro a été utilisée pour les protocoles de congélation et de vitrification, puis complétée par une approche in vivo pour les protocoles de vitrification.Nos résultats confirment que la BSA peut être efficacement remplacée par le CRYO3 dans des protocoles de cryoconservation d‘embryons de lapin et d’embryons ovins, qu’il s’agisse de congélation lente ou de vitrification / Embryo cryopreservation media usually contain animal-derived products, such as bovine serum albumin (BSA). These products present two major disadvantages: an undefined variable composition and a risk of pathogen transmission. The substitution of animal products of embryo cryopreservation media by synthetical products may improve procedure standardization (by avoiding variability in media composition) and avoid sanitary concerns inherent to animal-derived products.We aimed to evaluate the effect of replacing BSA in rabbit and ovine embryo slow freezing and vitrification media with a synthetic animal products free medium composed of synthetic hyaluronic acid: STEM ALPHA.Cryo3 (« CRYO3 »).During the first part, we evaluated the substitution candidates through a thermodynamic approach, using differential scanning calorimetry. In paralel, we adapted a mitochondrial activity evaluation protocol (JC-1) to rabbit embryo, which allowed us to complement morphological in vitro evaluation, and evaluated ewe superovulation protocols.During the second part, we used a biological approach to evaluate the replacement of BSA with synthetical products (containing CRYO3) in rabbit and ovine embryo slow freezing and vitrification media, using in vitro (slow freezing and vitrification) and in vivo (vitrification) evaluation methods.Our results seem to demonstrate that the chemically defined substitute CRYO3 can successfully replace BSA during rabbit embryo and ovine embryo cryopreservation (slow-freezing and vitrification)