Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:29Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-07-11Bitstream added on 2014-06-13T21:01:14Z : No. of bitstreams: 1 sanches_ea_dr_jabo.pdf: 2259186 bytes, checksum: 4918c5b558ff28f27002661990f850b9 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo do trabalho foi de adaptar metodologias de análises espermáticas e aprimorar o processo de fertilização artificial e condições de estocagem de gametas de surubim-do-paraiba, Steindachneridion parahybae: espécie de peixe criticamente ameaçada de extinção. Para tanto, foram realizados quatro ensaios experimentais: (1) validação de método e avaliação dos parâmetros espermáticos por meio de software livre. (2) determinação da dose inseminante e volume de água empregados na fertilização artificial; (3) estocagem de ovócitos in natura em quatro temperaturas ao longo de 355 minutos; (4) estocagem do sêmen in natura em quatro temperaturas ao longo 112h. Observou-se que o método de análise espermática utilizando o software de código aberto ImageJ/plugin CASA é uma ferramenta eficiente, exata, objetiva e barata, além de possibilitar uma nova perspectiva de análises em peixes nativos. As configurações estabelecidas no presente trabalho poderão servir de base para novos trabalhos relacionados às análises espermáticas do surubim-do-paraíba, bem como de outras espécies. Verificou-se que a quantidade de espermatozóides e o volume de água interferem diretamente no procedimento de fertilização artificial, com melhores resultados na utilização de 5,5×106 espermatozóides ovócito-1 e 1,0mL de água g-1 de ovócitos. Foi observado que a estocagem de ovócitos e sêmen de forma in natura não é recomendada em ambientes com temperaturas superiores a 25ºC e inferiores a 15ºC. Temperaturas intermediárias (15-25ºC) possibilitam melhores condições e prolongam a qualidade dos gametas, entretanto, recomenda-se em procedimentos de fertilização artificial da espécie, a coleta do sêmen antes que os ovócitos. Os resultados obtidos no presente trabalho além de proporcionarem aumento das... / The aim was to adapt methodologies of sperm analysis and to improve the artificial fertilization process and gamete storage conditions of surubim-of-paraiba, Steindachneridion parahybae: critically endangered fish species. So that, four experimental tests were performed: (1) validation of method and evaluation of sperm parameters using free software. (2) determination of the inseminating dose and water volume used in artificial fertilization, (3) storage of fresh oocytes into four temperatures over 355 minutes, (4) storage of fresh semen into four temperatures over 112h. It was observed that the sperm analysis method using open source software ImageJ/plugin CASA is an effective tool, accurate, objective and inexpensive, besides enables a new perspective of the analysis on the native fish. The settings established in this study could serve as a basis for further work related at sperm analysis of surubim-do-paraiba and other species. It was found that sperm quantity and water volume interfere directly in the procedure of artificial fertilization, with improved results on usage of 5.5×106 spermatozoa oocyte-1 and 1.0 ml of water g-1 of oocyte. It was observed that the fresh oocytes and sperm storage is not recommended in environments with temperatures above 25ºC and below 15ºC. Intermediate temperatures (15-25ºC) enable better results and prolong the gametes quality, however, it is recommended in the artificial fertilization procedures the semen collection before the oocytes. The results obtained in this study providing increased rates of fertilization and hatching, besides to allow gametes optimization through of the utilization of controlled manner, and with satisfactory quality for more time after collection. Besides, these results provide a basis for future research, contributing to the... (Complete abstract click electronic access below)

A criopreservação de embriões de peixes vem sendo investigada há mais de duas décadas, no entanto todos os protocolos testados até o momento falharam. A utilização de oócitos, mais recentemente, foi relatada como uma alternativa, no entanto, a maioria dos estudos foram realizados utilizando uma única técnica - o congelamento lento controlado - não alcançando nenhum êxito. A vitrificação é um método de criopreservação livre de gelo, apresentando diversas vantagens que podem contribuir para superar algumas das dificuldades relacionadas com a criopreservação de oócitos de peixes. No presente estudo desenvolveu-se um protocolo de vitrificação para folículos ovarianos de zebrafish em estádio III. Uma série de crio-soluções foram formuladas e testadas quanto à sua capacidade de vitrificação empregando diferentes dispositivos (palheta plástica, bloco de vitrificação e fibreplugTM). A toxicidade das soluções de vitrificação foi avaliada através da análise de integridade da membrana dos folículos ovarianos utilizando coloração com trypan blue. Além disso, foi investigado o efeito do protocolo de vitrificação sobre os folículos em nível sub-celular, através da medição da concentração de ATP citoplasmático e da distribuição e atividade mitocondrial, utilizando sonda fluorescente JC-1 e microscopia confocal. Após a vitrificação, os folículos ovarianos apresentaram integridade de membrana de 59,9 ± 18,4% quando o fibreplug e a solução V16 (1.5 M metanol + 4.5 M propileno glicol) foram empregados. Quando vitrificados em V2 (1.5 M metanol + 5.5 M DMSO) a integridade de membrana diminuiu para 42,0 ± 21,0%. Observou-se que os folículos localizados no meio do fragmento foram mais protegidos de injúrias apresentando satisfatória aparência quanto a sua morfologia mesmo 2 h após o aquecimento. A integridade mitocondrial das células da camada da granulosa foi claramente prejudicada pelo protocolo de vitrificação e o nível de ATP nos folículos diminuiu significativamente (P < 0,05) após o aquecimento. A vitrificação de folículos ovarianos de zebrafish em estádio III e seu efeito em nível de subcelular são relatados aqui pela primeira vez. As informações obtidas a partir deste estudo serão muito úteis para guiar o desenvolvimento e otimização de um protocolo para a criopreservação de oócitos de peixes no futuro. / Cryopreservation of fish embryos has been under investigation for over two decades; however every protocol tested so far has failed. The use of oocytes has more recently been reported as an alternative, nevertheless most of the studies were carried out using a single technique - controlled slow cooling - and success also remains elusive. Vitrification is an ice-free cryopreservation method which offers several advantages that may contribute to overcome some of the difficulties involved with fish oocytes cryopreservation. In the present study we developed a vitrification protocol for stage III zebrafish ovarian follicles in ovarian tissue fragments. A series of cryo-solutions were designed and tested for their vitrifying ability using different devices (plastic straw, vitrification block and fibreplugTM). Toxicity of vitrification solutions was evaluated by assessing membrane integrity with trypan blue staining. In addition, we investigated the effect of vitrification protocol on the follicles at sub-cellular level by measuring the cytoplasmic ATP content and the mitochondrial distribution and activity using JC-1 probe and confocal microscopy. After vitrification, ovarian follicles showed membrane integrity of 59.9 ± 18.4% when fibreplug and V16 (1.5 M methanol + 4.5 M propylene glycol) solution were employed. When vitrified in V2 (1.5 M methanol + 5.5 M DMSO) the membrane integrity decreased to 42.0 ± 21.0%. We observed that follicles located in the middle of the fragments were more protected from injuries and some of them showed satisfactory morphological appearance even two hours post-warming. Mitochondria integrity of granulosa cells layer was clearly damaged by the vitrification protocol and ATP level in the follicles declined significantly (P < 0.05) after warming. Vitrification of stage III zebrafish follicles in ovarian tissue fragments and its effect at sub-cellular level is reported here for the first time. Information gained from this study will be very useful to guide development of a successful protocol for cryopreservation of fish oocytes in the future.

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-09-30Bitstream added on 2015-04-09T12:47:49Z : No. of bitstreams: 1 000813684.pdf: 1375746 bytes, checksum: 5ba3457a79842ca1c540990afe68904e (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / As espécies da subfamília Leptodactylinae apresentam grande diversidade de modos reprodutivos, acompanhada de diferentes estratégias reprodutivas, dentre elas os acasalamentos poliândricos. A análise da morfologia de gônadas e espermatozoides em um contexto filogenético é uma importante ferramenta para se compreender a evolução desta estratégia reprodutiva alternativa em anuros. Assim, neste estudo descrevemos a morfologia e ultraestrutura de espermatozoides de 11 espécies de Leptodactylus e de Lithodytes lineatus, bem como investigamos as relações entre as características das gônadas e espermatozoides em espécies poliândricas e não poliândricas de Leptodactylus, utilizando métodos comparativos filogenéticos. Nossa análise ultraestrutural mostrou que os espermatozoides dos leptodactilíneos são semelhantes aos de outros anuros. As principais diferenças ocorreram na região do complexo acrossomal. Além disso, detectamos dois tipos morfologicamente distintos de espermatozoide, sendo um deles observado em todas as espécies poliândricas analisadas. As espécies poliândricas de Leptodactylus apresentaram maior comprimento e densidade de espermatozoides, além de maior massa relativa de testículo e diâmetro do túbulo seminífero em comparação com as não poliândricas. O teste de correlação de caracteres evolutivos mostrou que estas características, todas com valores acima da média, foram correlacionados com a ocorrência de poliandria no gênero. Dessa forma, nossos resultados sugerem que a competição de esperma em espécies de Leptodactylus exerce importante pressão de seleção, levando, principalmente, a um aumento no tamanho e densidade de espermatozoides e aumento no investimento em gônadas, provavelmente como forma de aumentar o sucesso de fertilização dos machos / Species in the subfamily Leptodactylinae exhibit a great diversity of reproductive modes and adopt different reproductive strategies, including polyandrous matings. The analysis of the gonad and sperm morphology in a phylogenetic context is crucial to understand the evolution of this alternative reproductive strategy in anurans. Here, we describe the sperm morphology and ultraestructure of 11 Leptodactylus species and that of Lithodytes lineatus and investigated the relationship between gonad and sperm morphology in polyandrous and non polyandrous Leptodactylus species using phylogenetic comparative methods. Our analysis revealed that the sperm ultraestructure of the leptodactylines was very similar to that of other anurans. The main differences occurred at the acrosomal complex region. Furthermore, we detected two distinct sperm morphotypes, one of them observed in all polyandrous species analyzed. Polyandrous Leptodactylus species produced larger sperm at higher densities and presented larger relative testes mass and seminiferous tubules compared to non polyandrous species. The correlated character evolution test showed that these gonad and sperm traits, all with values above the mean, correlated with the presence of polyandry in the genus. Thus, our results suggest that the sperm competition is an important selective pressure, leading to an increase in sperm size and density in Leptodactylus males, also increasing gonad mass allocation, probably as a way to increase fertilization success

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:38Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-14Bitstream added on 2014-11-10T11:58:09Z : No. of bitstreams: 1 000777313_20150214.pdf: 550077 bytes, checksum: d8e01ff78c8836d4f7aed4afe688ca49 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-02-18T15:02:15Z: 000777313_20150214.pdf,Bitstream added on 2015-02-18T15:02:48Z : No. of bitstreams: 1 000777313.pdf: 519896 bytes, checksum: f1173172b8a785b6cd1ddbebc6b8e207 (MD5) / O objetivo deste trabalho foi estudar aspectos básicos dos gametas e o desenvolvimento inicial de Astyanax altiparanae, para futura aplicação na área de biotecnologia, incluindo manipulação cromossômica de embriões. No Capítulo I, os ovócitos foram analisados por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e a dose inseminante foi determinada. O sêmen também foi coletado e analisado com sistema de análise computadorizada (CASA). A dose inseminante reduzida encontrada para a espécie foi explicada pela morfologia dos ovócitos através de análise em MEV, que revelou vilosidades que cercam a micrópila relacionadas à orientação do esperma para a fecundação. No capítulo II, vários parâmetros relacionados com a fertilização foram descritos, incluindo a extrusão do segundo corpúsculo polar, a fusão dos pronúcleos e a formação do cone de fertilização. Além disso, o efeito de três temperaturas (22°C, 26°C e 30°C) sobre os estádios de desenvolvimento foi determinado. A extrusão do segundo corpúsculo polar ocorreu em 4-6 minutos pós-fertilização (mpf), e os pronúcleos fundiram-se com 8-10 mpf. O espermatozoide apresentou uma cabeça esférica, peça intermediária e flagelo. Como esperado, as temperaturas mais elevadas deram origem a um desenvolvimento e incubação mais rápidos. As informações obtidas neste estudo irão abrir novas possibilidades no campo da manipulação cromossômica de embriões, incluindo poliploidia, quimerismo, transgenia e outras técnicas / The aim of this study was to study basic aspects of gametes and early development of yellowtail tetra Astyanax altiparanae, for future application in biotechnology including chromosome and embryo manipulation. In Chapter I, the oocytes were analyzed by Scanning Electron Microscopy (SEM) and the insemination dose was determined. Semen was also collected and analyzed using a Computer Assisted Sperm Analysis (CASA). Such a reduced inseminating dose was explained by oocyte morphology because SEM analysis revealed villosities surrounding the micropyle that is related to the sperm guidance for fertilization. In addition, the duration of sperm motility was longer in comparison to most teleosts, what may improve fertilization ability. In Chapter II, several parameters related with fertilization were described, including the second polar body extrusion, fusion of the pronuclei and the formation of the fertilization cone. Moreover, the effect of three temperatures (22°C, 26°C and 30°C) on developmental stages was determined. 2nd polar body was extruded at 4-6 minutes post fertilization (mpf), and the pronuclei were formed at 8-10 mpf. The sperm showed a spherical head, midpiece and flagellum. As expected, higher temperatures gave rise to faster development and hatching. The information obtained in this study will open new possibilities in the field of chromosome and embryo manipulation including poliploidy, chimerism, transgenesis and other techniques

A criopreservação de embriões de peixes vem sendo investigada há mais de duas décadas, no entanto todos os protocolos testados até o momento falharam. A utilização de oócitos, mais recentemente, foi relatada como uma alternativa, no entanto, a maioria dos estudos foram realizados utilizando uma única técnica - o congelamento lento controlado - não alcançando nenhum êxito. A vitrificação é um método de criopreservação livre de gelo, apresentando diversas vantagens que podem contribuir para superar algumas das dificuldades relacionadas com a criopreservação de oócitos de peixes. No presente estudo desenvolveu-se um protocolo de vitrificação para folículos ovarianos de zebrafish em estádio III. Uma série de crio-soluções foram formuladas e testadas quanto à sua capacidade de vitrificação empregando diferentes dispositivos (palheta plástica, bloco de vitrificação e fibreplugTM). A toxicidade das soluções de vitrificação foi avaliada através da análise de integridade da membrana dos folículos ovarianos utilizando coloração com trypan blue. Além disso, foi investigado o efeito do protocolo de vitrificação sobre os folículos em nível sub-celular, através da medição da concentração de ATP citoplasmático e da distribuição e atividade mitocondrial, utilizando sonda fluorescente JC-1 e microscopia confocal. Após a vitrificação, os folículos ovarianos apresentaram integridade de membrana de 59,9 ± 18,4% quando o fibreplug e a solução V16 (1.5 M metanol + 4.5 M propileno glicol) foram empregados. Quando vitrificados em V2 (1.5 M metanol + 5.5 M DMSO) a integridade de membrana diminuiu para 42,0 ± 21,0%. Observou-se que os folículos localizados no meio do fragmento foram mais protegidos de injúrias apresentando satisfatória aparência quanto a sua morfologia mesmo 2 h após o aquecimento. A integridade mitocondrial das células da camada da granulosa foi claramente prejudicada pelo protocolo de vitrificação e o nível de ATP nos folículos diminuiu significativamente (P < 0,05) após o aquecimento. A vitrificação de folículos ovarianos de zebrafish em estádio III e seu efeito em nível de subcelular são relatados aqui pela primeira vez. As informações obtidas a partir deste estudo serão muito úteis para guiar o desenvolvimento e otimização de um protocolo para a criopreservação de oócitos de peixes no futuro. / Cryopreservation of fish embryos has been under investigation for over two decades; however every protocol tested so far has failed. The use of oocytes has more recently been reported as an alternative, nevertheless most of the studies were carried out using a single technique - controlled slow cooling - and success also remains elusive. Vitrification is an ice-free cryopreservation method which offers several advantages that may contribute to overcome some of the difficulties involved with fish oocytes cryopreservation. In the present study we developed a vitrification protocol for stage III zebrafish ovarian follicles in ovarian tissue fragments. A series of cryo-solutions were designed and tested for their vitrifying ability using different devices (plastic straw, vitrification block and fibreplugTM). Toxicity of vitrification solutions was evaluated by assessing membrane integrity with trypan blue staining. In addition, we investigated the effect of vitrification protocol on the follicles at sub-cellular level by measuring the cytoplasmic ATP content and the mitochondrial distribution and activity using JC-1 probe and confocal microscopy. After vitrification, ovarian follicles showed membrane integrity of 59.9 ± 18.4% when fibreplug and V16 (1.5 M methanol + 4.5 M propylene glycol) solution were employed. When vitrified in V2 (1.5 M methanol + 5.5 M DMSO) the membrane integrity decreased to 42.0 ± 21.0%. We observed that follicles located in the middle of the fragments were more protected from injuries and some of them showed satisfactory morphological appearance even two hours post-warming. Mitochondria integrity of granulosa cells layer was clearly damaged by the vitrification protocol and ATP level in the follicles declined significantly (P < 0.05) after warming. Vitrification of stage III zebrafish follicles in ovarian tissue fragments and its effect at sub-cellular level is reported here for the first time. Information gained from this study will be very useful to guide development of a successful protocol for cryopreservation of fish oocytes in the future.

A criopreservação de embriões de peixes vem sendo investigada há mais de duas décadas, no entanto todos os protocolos testados até o momento falharam. A utilização de oócitos, mais recentemente, foi relatada como uma alternativa, no entanto, a maioria dos estudos foram realizados utilizando uma única técnica - o congelamento lento controlado - não alcançando nenhum êxito. A vitrificação é um método de criopreservação livre de gelo, apresentando diversas vantagens que podem contribuir para superar algumas das dificuldades relacionadas com a criopreservação de oócitos de peixes. No presente estudo desenvolveu-se um protocolo de vitrificação para folículos ovarianos de zebrafish em estádio III. Uma série de crio-soluções foram formuladas e testadas quanto à sua capacidade de vitrificação empregando diferentes dispositivos (palheta plástica, bloco de vitrificação e fibreplugTM). A toxicidade das soluções de vitrificação foi avaliada através da análise de integridade da membrana dos folículos ovarianos utilizando coloração com trypan blue. Além disso, foi investigado o efeito do protocolo de vitrificação sobre os folículos em nível sub-celular, através da medição da concentração de ATP citoplasmático e da distribuição e atividade mitocondrial, utilizando sonda fluorescente JC-1 e microscopia confocal. Após a vitrificação, os folículos ovarianos apresentaram integridade de membrana de 59,9 ± 18,4% quando o fibreplug e a solução V16 (1.5 M metanol + 4.5 M propileno glicol) foram empregados. Quando vitrificados em V2 (1.5 M metanol + 5.5 M DMSO) a integridade de membrana diminuiu para 42,0 ± 21,0%. Observou-se que os folículos localizados no meio do fragmento foram mais protegidos de injúrias apresentando satisfatória aparência quanto a sua morfologia mesmo 2 h após o aquecimento. A integridade mitocondrial das células da camada da granulosa foi claramente prejudicada pelo protocolo de vitrificação e o nível de ATP nos folículos diminuiu significativamente (P < 0,05) após o aquecimento. A vitrificação de folículos ovarianos de zebrafish em estádio III e seu efeito em nível de subcelular são relatados aqui pela primeira vez. As informações obtidas a partir deste estudo serão muito úteis para guiar o desenvolvimento e otimização de um protocolo para a criopreservação de oócitos de peixes no futuro. / Cryopreservation of fish embryos has been under investigation for over two decades; however every protocol tested so far has failed. The use of oocytes has more recently been reported as an alternative, nevertheless most of the studies were carried out using a single technique - controlled slow cooling - and success also remains elusive. Vitrification is an ice-free cryopreservation method which offers several advantages that may contribute to overcome some of the difficulties involved with fish oocytes cryopreservation. In the present study we developed a vitrification protocol for stage III zebrafish ovarian follicles in ovarian tissue fragments. A series of cryo-solutions were designed and tested for their vitrifying ability using different devices (plastic straw, vitrification block and fibreplugTM). Toxicity of vitrification solutions was evaluated by assessing membrane integrity with trypan blue staining. In addition, we investigated the effect of vitrification protocol on the follicles at sub-cellular level by measuring the cytoplasmic ATP content and the mitochondrial distribution and activity using JC-1 probe and confocal microscopy. After vitrification, ovarian follicles showed membrane integrity of 59.9 ± 18.4% when fibreplug and V16 (1.5 M methanol + 4.5 M propylene glycol) solution were employed. When vitrified in V2 (1.5 M methanol + 5.5 M DMSO) the membrane integrity decreased to 42.0 ± 21.0%. We observed that follicles located in the middle of the fragments were more protected from injuries and some of them showed satisfactory morphological appearance even two hours post-warming. Mitochondria integrity of granulosa cells layer was clearly damaged by the vitrification protocol and ATP level in the follicles declined significantly (P < 0.05) after warming. Vitrification of stage III zebrafish follicles in ovarian tissue fragments and its effect at sub-cellular level is reported here for the first time. Information gained from this study will be very useful to guide development of a successful protocol for cryopreservation of fish oocytes in the future.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_carine_dahl_corcini.pdf: 732454 bytes, checksum: 17c0395123a3b5438e40b167f5247599 (MD5) Previous issue date: 2010-06-25 / The knowledge of the reproductive potential of a male has economical and reproductive importance, especially if he is used in artificial insemination programs. The conventional assays for evaluating seminal quality do not have the capacity of measuring the fertilizing potential of a sample, they only indicate if it is within the acceptable parameters for insemination, according to the Brazilian College of Animal Reproduction. Into this context, the in vitro sperm penetration assay presents itself as an alternative laboratorial test to categorize fertile males regarding their fecundation capacity, since they mimic in vitro what happens in vivo. However, this assay has its use limited by the difficulty of execution and by the utilization of high cost equipment. The present work aimed to find a new biological model to study male reproductive aspects and to evaluate alternatives to simplify and to decrease costs of the assay execution: use of the chicken egg inner perivitelline layer (IPVL) penetration assay and its association with in vitro and in vivo parameters; use of BTS as incubation media for the in vitro penetration assay, and female gametes cryopreservation using different methods. It was concluded that: 1) Calomys laucha can be used as a biological model; 2) it is possible to use the inner perivitelline layer as a substrate in assays to predict fertility of Calomys laucha males; 3) the IPVL has receptors that allow swine sperm binding, therefore presents potential for use in male fertility diagnostic tests; 4) it is possible to use BTS as incubation media for the in vitro penetration assay, in oocytes or in IPVL, and in water-bath without CO2, and 5) the cryopreservation of ovaries at -20ºC or the refrigeration of oocytes in PBS at 5ºC before the execution of the in vitro oocyte penetration assay, using mTBM media, is an alternative to the use of fresh oocytes in tests to predict swine semen fertility. / O conhecimento do potencial reprodutivo de um macho é de importância econômica e reprodutiva, principalmente se ele é utilizado em programa de inseminação artificial. Os testes convencionais que avaliam a qualidade seminal não possuem a capacidade de medir o potencial fertilizante de uma amostra e, apenas indicam se a mesma se encontra dentro dos parâmetros aceitáveis para a inseminação segundo o Colégio Brasileiro de Reprodução Animal. O teste de penetração espermática in vitro, aparece neste contexto como um teste laboratorial alternativo para categorizar os machos férteis, quanto a sua capacidade de fecundação, pois mimetizam in vitro o que acontece in vivo. No entanto, este teste tem seu uso limitado por ser de difícil execução e por utilizar equipamentos de alto custo. O presente trabalho objetivou encontrar um novo modelo biológico para estudos sobre aspectos reprodutivos de machos e avaliar alternativas para simplificar e diminuir custos para execução do teste: utilização do teste de penetração na membrana perivitelina interna do ovo da galinha (IPVL) e sua associação com parâmetros in vitro e in vivo; utiilização do BTS como meio de incubação do teste de penetração in vitro e utilização de diferentes maneiras de criopreservação de gametas femininos. Foi concluído que: 1) Calomys laucha pode ser utilizado como modelo biológico; 2) é possível utilizar a membrana perivitelina interna como substrato de teste para predizer a fertilidade de machos Calomys laucha; 3) a IPVL possui receptores que permitiram a ligação do espermatozóide suíno, apresentando potencial para ser utilizada em diagnóstico de fertilidade de machos; 4) é viável utilizar BTS como meio para realização do teste de penetração in vitro em ovócito ou IPVL, em banho-maria sem a presença de CO2 e 5) o congelamento de ovários a -20ºC ou o acondicionamento a 5º C dos ovócitos em PBS para realizar o teste de penetração ovocitária in vitro, utilizando o meio mTBM, é uma alternativa para predizer a fertilidade de sêmen suíno.