Made available in DSpace on 2014-10-09T12:50:53Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:59:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 11109.pdf: 12432310 bytes, checksum: c0a31703a7116daea7b5d40b3ca371f2 (MD5) / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:38:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:04:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 05587.pdf: 8846967 bytes, checksum: 17b7ac7f1b286010165a6ac50ebcf25f (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP / FAPESP:93/04231-1

Sem resumo / Sem abstract

As aminoacil tRNA sintetases (AaRSs) são enzimas essenciais na síntese de proteínas assegurando a correta relação entre os aminoácidos e seus tRNA cognatos. O genoma mitocondrial dos tripanossomatídeos perdeu os genes codificantes dos tRNAs, assim os tRNA mitocondriais são codificados no núcleo e importados do citoplasma. O código genético do kinetoplasto desvia do código genético pela utilização do códon de terminação UGA para a decodificação do códon do triptofano. Um único gene codificando o tRNATrp(CCA) observado no genoma de Leismania é responsável pela incorporação do aminoácido triptofano durante a síntese proteíca na mitocôndria. Para decodificar os dois códons do Trp (UGA e UGG) a base na posição 34 do tRNATrp(CCA) passa por um evento de editoração, convertendo o ribunuclotídeo C34 em U34, produzindo o tRNATrp(UCA) capaz de decodificar o códon UGA. Nesse trabalho foram caracterizadas duas triptofanil tRNA sintetases de Leishmania major. De acordo com experimentos de ?western blotting? e análises ?in silico? das seqüências de aminoácidos, uma enzima tem localização citoplasmática (LmTrpRS1) enquanto a outra mitocondrial (LmTrpRS2). Os mRNAs dos dois genes foram definidos por experimentos de 5? e 3? RT-PCR. As duas enzimas foram clonadas em diversos vetores de expressão procariotos e eucariotos. A LmTrpRS1 foi obtida somente na fração insolúvel, já a LmTrpRS2 foi obtida na fração solúvel quando clonada no vetor de expressão pET28a. Esta porém mostrou-se instável precipitando rapidamente após sua purificação. Os ensaios enzimáticos realizados com a mesma mostraram que ela é capaz de reconhecer os tRNAsTrp editado e não editado. Modelagem molecular por homologia com as duas proteínas foi realizada usando a proteína citoplasmática humana como molde, para estudar a interação entre a proteína e o tRNATrp. Xylella fastidiosa é um bactéria gram negativa limitada ao xilema, responsável por um grande número de doenças economicamente importantes, como a doença de Pierces em videiras, Clorose variegata do Citrus (CVC) e a doença da requeima das folhas em outras plantas incluindo, amendoeira, ameixeira, louro, amoreira e café. Em todos os casos a X. fastidiosa afeta o xylema da planta causando redução na produção de frutos. Nesse trabalho nós mostramos a estrutura da Xylellaína, uma cisteíno protease desse patógeno. A estrutura foi resolvida por dispersão anômala a um único comprimento de onda, utilizando cristais de xylellaína selenometionina substituídos. A estrutura da Xylellaína foi refinada até 1,65 Å de resolução, mostrando enovelamento similar às proteínas da família da papaína, porém algumas características interessantes como uma região N-terminal composta por 38 aminoácidos cobrindo o sulco ativo da enzima, um intrigante ribonucleotídeo encontrado fora do sítio ativo da enzima e um ?loop? semelhante ao ?loop? de oclusão presente na catepsina B. / The aminoacyl tRNA synthetases (aaRSs) are essential enzymes in protein synthesis that ensure the correct match between amino acids and their cognate tRNAs. The mitochondrial (kinetoplast) genome of trypanossomatids lacks tRNA genes, and therefore nucleus-encoded tRNAs are imported from the cytoplasm, the kinetoplast genetic code deviates from the universal code in that UGA instead of UGG encodes for tryptophan. A single nucleus-encoded tRNATrp(CCA) is responsible for Trp insertion during organellar protein synthesis. To decode both Trp codons (UGA and UGG), tRNATrp(CCA) undergoes a single C to U editing event at position 34 of the anticodon yielding to versions of the tRNA in the mitochondria with anticodon CCA and UCA, permitting UGA decoding. This work have characterized two Leishmania major tryptophanyl-tRNA synthetase, acording western blotting experiments and ?in silico? sequence analisis one of cytoplasmatic localization (LmTrpRS1) and another from mitochondria localization (LmTrpRS2). The mature mRNA transcripts for both genes were defined by 5? and 3? RT-PCR. Both enzymes were cloned into several expressions vectors. LmTrpRs1 was obtained as an insoluble protein and LmTrpRs2 expressed into the soluble fraction in pET28a expression system. LmTrpRS2 protein, however, is unstable precipitating shortly after purification. The enzymatic assay showed that this enzyme is able to recognize both tRNATrp. Molecular modeling for LmTrpRS1 and LmTrpRS2 were constructed using the cytoplasmatic human tryptophanyl tRNA synthetase as a model, to study the interaction between proteins and tRNATrp. Xylella fastidiosa is a xylem-limited, gram-negative bacteria responsible for a large number of economically important plant diseases, such as Pierces disease in grapevines, citrus variegated chlorosis (CVC) in sweet oranges and leaf scorch diseases in other plants, including almond, plum, oleander, mulberry and coffee. In all cases, X. fastidiosa infects the plant xylem and impairs fruit production. Here, we report the crystal structure of xylellain, a cystein protease from X. fastidiosa. The structure was solved by single-wavelength anomalous dispersion (SAD) using seleno-methionine containing xylellain crystals. The final structure of Xylellaína was refined against the best native data set (1.65 Å) showing R/Rfree= 17/21. Xylellain shares fold similar to Papain like Family, but contains some interesting features, like a 38 N-terminal tail covering the active site cleft; one intriguing ribonucleotide found outside the active site and one loop that resemble the ocluding loop from cathepsin B.

Este trabalho enquadra-se dentro dos objetivos da engenharia de cristais moleculares para a obtenção de novas formas sólidas que possam apresentar propriedades farmacêuticas aprimoradas, especificamente de um dos fármacos mais utilizados e comercializados na terapia antirretroviral, contra o HIV: lamivudina, β-L-2\',3\'-didesoxi-3\'-tiocitidina (3TC). As formas cristalinas apresentadas correspondem aos sais dos ácidos inorgânicos: bromidrato (3TCH+-Br-), difluoridrato de hidrogênio (3TCH+-F-HF) e nitrato de lamivudina (3TCH+-NO3-). Estes novos sais cristalizaram no grupo espacial não-centrossimétrico P21, com um par iônico por unidade assimétrica. Os sais halogenados (3TCH+-Br- e 3TCH+-F-HF) apresentaram arranjos supramoleculares isoestruturais inclusive com o sal anidro do cloridrato de lamivudina (3TCH+-Cl-), reportado em trabalhos anteriores no nosso grupo de pesquisa, e cuja solubilidade no equilíbrio apresentou um aumento em relação à forma farmacêutica da 3TC. A característica principal dos arranjos cristalinos destes sais está relacionada com o ordenamento supramolecular das unidades catiônicas 3TCH+, a qual é constante, observando-se a formação de vacâncias entre elas ao longo do eixo cristalino a, decorrente da simetria helicoidal característica do grupo espacial. Desta forma, os ânions se acomodam nos interstícios destas vacâncias estabilizando o arranjo cristalino. Entretanto, o sal 3TCH+NO3- apresentou um comportamento conformacional e supramolecular diferente do observado nos sais halogenados. Neste caso observaram-se a formação de fitas helicoidais ao longo do eixo b, as quais vão se acoplando por simetria translacional na direção horizontal no plano [10-1] por meio de ligações de hidrogênio clássicas do tipo N–H•••O entre os fragmentos citosinicos e O–H•••O dos grupos hidroxilas e os ânions nitrato correspondentemente. Portanto, há a formação de planos moleculares em ziguezague, que posteriormente vão se arquitetando paralelamente na direção [1 0 -1] através de interações de curto alcance. Tanto as características conformacionais e supramoleculares, quanto a pureza exibida pelos sais foram também corroboradas com a ajuda de outras técnicas de análise no estado sólido, como a difração de raios X por pó (DRXP), a análise vibracional no infravermelho (IV) e Raman, e a análise térmica: calorimetria exploratória diferencial (DSC), termogravimetria (TG) e microscopia termo-óptica (Hot-stage). Cálculos de single-point em nível da teoria do funcional da densidade (DFT) foram realizados com o intuito de auxiliar na compreensão de algumas interações intermoleculares. Comparações das propriedades estruturais dos sais sintetizados com algumas formas já reportadas da 3TC (por exemplo, a 3TCH-Cl) permitiram inferir possíveis propriedades farmacêuticas. / This work falls within the main goals of crystal engineering, the improvement of pharmaceutical properties, through the design of new solid forms of the lamivudine, β-L-2 ´, 3´-dideoxy-3´-tiocytidine (3TC), one of the most used and marketed drug in the antiretroviral therapy against HIV. The crystalline forms herein presented correspond to inorganic acid salts: Lamivudine hydrobromide (3TCH+-Br-), hydrogen difluoride (3TCH+-F-HF) and nitrate (3TCH+-NO3-). These new salts crystallized in non-centrossymetric space group P21, with an ionic pair per asymmetric unit. The halogenated salts (3TCH+-Br- and 3TCH+-F-HF) exhibited isostructural supramolecular assemblies, similar to the anhydrous salt of lamivudine hydrochloride (3TCH+-Cl-) reported in a previous studies performed in our research group, and whose equilibrium solubility showed an increase when compared with 3TC pharmaceutical form. The main feature of the salt crystalline assemblies is related to the supramolecular ordering of the 3TCH+ cationic units, which is constant, by observing the formation of vacancies between them along the a crystalline axis due to the helical symmetry, characteristic of their space group. In this way, the anions accommodate themselves into the interstices of these vacancies, stabilizing the crystalline assemblies. Meanwhile, the 3TCH+NO3- salt showed a conformational and supramolecular behavior different from that observed in the halogenated salts. In this case it was observed the formation of helical strands along the b axis, which will be engaging by translational symmetry in the horizontal direction in the [10-1] plane through N–H•••O e O–H•••O classical hydrogen bonds, between the cytosine and hydroxyl fragments and the nitrate anions. Therefore, they form molecular zigzag plans which will subsequently architect parallel with the [10-1] direction by short-contact interactions. Both conformational and supramolecular characteristics as well as the purity exhibited by these salts were also supported with the help of other solid state techniques such as X-ray powder diffraction (XRDP), vibrational analysis as Infrared (IR) and Raman spectroscopy and thermal analysis as differential scanning calorimetry (DSC), thermogravimetry (TG) and hot-stage microscopy. Single point theoretical calculations at the level of density functional theory (DFT) were performed in order to assist in the understanding of some intermolecular interactions. Comparison of the structural properties of the synthesized salts with some forms already reported (e.g. 3TCH+-Cl-) allowed to infer some possible pharmaceutical properties.

Propriedades de estado sólido estão diretamente relacionadas ao desempenho de um fármaco. Entre todas as propriedades físicas e químicas dependentes da fase cristalina de um fármaco, estabilidade e solubilidade são as que mais alteram sua biodisponibilidade. Neste sentido, a engenharia de cristais moleculares é uma estratégia para aperfeiçoar as propriedades de estado sólido relacionadas às eficácias dos fármacos. Neste trabalho, nove novas formas cristalinas de fármacos antirretrovirais inibidores nucleosídeos de transcriptase reversa, a saber, lamivudina, zalcitabina e didanosina, foram preparadas e suas estruturas cristalinas foram elucidadas por difração de raios X por monocristal. Parte das modificações cristalinas preparadas foi também caracterizada por microscopia eletrônica de varredura, difração de raios X por pó, espectroscopia vibracional no infravermelho e Raman, calorimetria exploratória diferencial e termogravimetria. As solubilidades aquosas e purezas das modificações cristalinas de lamivudina preparadas como amostras monofásicas foram determinadas por espectrofotometria de absorvância no ultravioleta e cromatografia líquida de alta eficiência, respectivamente. A solubilidade de lamivudina nas modificações cristalinas preparadas pode ser tanto aumentada quanto reduzida quando comparada com a solubilidade da fase cristalina do fármaco incorporada em formulações farmacêuticas. As solubilidades foram também correlacionadas às características estruturais e calorimétricas, o que permitiu o estabelecimento de relações entre estrutura/energia de rede cristalina e propriedade de estado sólido. Ainda, duas modificações cristalinas de lamivudina, em que moléculas do fármaco estão pareadas através de seus fragmentos de citosina, sendo estes pares helicoidalmente sobrepostos, mimetizando uma estrutura polimérica de ácido desoxirribonucléico, revelaram que nucleosídeos têm a informação estrutural necessária para arquitetar duplas hélices de ácidos nucléicos. / Solid state properties are directly related to drug performance. Among all physical and chemical properties dependent on the crystal phase of a drug, stability and solubility are the main ones that alter its bioavailability. In this way, molecular crystal engineering is a strategy to improve solid state properties of drugs related to their efficacies. In this work, nine new crystal forms of antiretroviral nucleoside reverse transcriptase inhibitor drugs, namely, lamivudine, zalcitabina and didanosine, were prepared and their crystal structures were elucidated by single crystal X-ray diffraction. Some of the prepared crystal modifications were also characterized by scanning electron microscopy, powder X-ray diffraction, infrared and Raman vibrational spectroscopy, differential scanning calorimetry and thermogravimetry. The water solubilities and purities of the lamivudine crystal modifications prepared as monophasic samples were determined by ultraviolet absorbance spectrophotometry and high performance liquid chromatography, respectively. The solubility of lamivudine in the prepared crystal modifications can be either increased or decreased when compared to the solubility of the drug crystal phase incorporated into pharmaceutical formulations. The solubilities were also correlated to calorimetric and structural features, which allowed the establishment of relationships between crystal lattice energy/structure and solid state property. In addition, two crystal modifications of lamivudine, in which drug molecules are paired through their cytosine fragments, being these pairs helically stacked, mimicking a polymeric structure of deoxyribonucleic acid, have revealed that nucleosides possess the structural information necessary to assemble double stranded helices of nucleic acids.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A glycosylated lectin (CTL) with specificity for mannose and glucose has been detected and purified from seeds of Centrolobium tomentosum, a legume plant from the Dalbergieae tribe. CTL was isolated by mannose-Sepharose affinity chromatography. The primary structure was determined by tandem mass spectrometry and consists of 245 amino acids and one N-glycosylation site, possessing high similarity with the lectin Platypodium elegans (PELa) and Pterocarpus angolensis (PAL) derived from the same tribe. Two crystal structures of CTL, with monoclinic and tetragonal forms, both complexed with methyl dimanosÃdeo has been solved at 2.25 and 1.9 Ã, respectively, with high similarity. The lectin adopts a typical canonical dimeric organization of legume lectins. The carbohydrate recognition domain (CRD), metal binding site, and glycosylation site have been characterized and the structural basis for interaction with carbohydrate been elucidated. CTL showed acute inflammatory effect in a paw edema model. The protein structure was subjected to ligand screening (dimannosides and trimannoside) by molecular docking, revealing a higher affinity for trimannosides and their interactions were compared with similar lectins, which have the same binding specificity. This is the first report of a crystal structure of a native mannose lectin / specific glucose Dalbergieae tribe with pro-inflammatory activity / Uma lectina glicosilada (CTL) com especificidade a manose e glucose foi detectada e purificada a partir de sementes de Centrolobium Tomentosum, uma leguminosa pertencente à tribo Dalbergieae. CTL foi isolada por cromatografia de afinidade de Sepharose-Manose. A estrutura primÃria foi determinada por espectrometria de massas e consiste em 245 aminoÃcidos e um sitio de ÂNÂ-glicosilaÃÃo, demonstrando similaridade com a lectina de Platypodium elegans (PELa), Pterocarpus angolensis (PAL), dentre outras, oriundas da mesma tribo. Duas estruturas cristalinas de CTL, de formas monoclÃnica e tetragonal, ambas complexadas com metil-dimanosÃdeo, foram resolvidas a 2,25 e 1,9 Ã, respectivamente, apresentando alta similaridade entre si. A lectina mostrou adotar uma organizaÃÃo dimÃrica canÃnica tÃpica de lectinas de leguminosas. O domÃnio de reconhecimento de carboidratos (CRD), local de ligaÃÃo do metal e local de glicosilaÃÃo foram caracterizados e a base estrutural para a interaÃÃo com carboidratos foi elucidado. CTL mostrou efeito inflamatÃrio agudo em um modelo de edema de pata. A estrutura da proteÃna foi submetida a uma anÃlise de interaÃÃes com dimanosÃdeos e trimanosÃdeos por Docking Molecular, revelando sua maior afinidade por trimanosÃdeos e suas interaÃÃes foram comparadas com lectinas similares que possuam a mesma especificidade de ligaÃÃo. Esse à o primeiro relato de estrutura cristalina de uma lectina nativa manose/glucose especÃfica da tribo Dalbergieae com atividade prÃ-inflamatÃria

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