The influence of immunosuppressive drugs on neural stem/progenitor cell fate in vitro.

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The influence of immunosuppressive drugs on neural stem/progenitor cell fate in vitro.

Einleitung Der Einsatz von Stammzellen als Grundlage neuer therapeutischer Strategien wird bereits seit über 25 Jahren intensiv erforscht. Stammzellen sind in der Lage, in verschiedene funktionale Zelltypen auszudifferenzieren und verfügen über ein enormes Proliferationspotential (NAM et al. 2015). Ausgehend von den Fähigkeiten von Stammzellen sehen Forscher und Kliniker erstmals eine realistische Möglichkeit, kurative Therapieoptionen für Erkrankungen zu entwickeln, die bisher als schwer behandelbar oder sogar unheilbar angesehen wurden. Davon könnten insbesondere Patienten chronisch-degenerativer neurologischer und zerebrovaskulärer Erkrankungen, einschließlich der großen Anzahl an Schlaganfallopfern, profitieren. Schlaganfälle repräsentieren eine der häufigsten Todesursachen in der westlichen Welt (LOPEZ et al. 2006). Ein Drittel der betroffenen Patienten verstirbt innerhalb eines Jahres, während etwa 40% von dauerhaften Behinderungen betroffen sind (MOZAFFARIAN et al. 2015). Trotz intensiver Forschung existieren neben der systemischen Thrombolyse, die auf einen engen Zeitraum von maximal 4,5 Stunden nach dem Akutereignis beschränkt ist, keine zugelassenen Therapieoptionen (HACKE et al. 2008, SAVER et al. 2009). Zelltherapeutische Strategien zur Behandlung des Schlaganfalls werden daher als besonders vielversprechend angesehen (ANDRES et al. 2011). Neben den bereits gesicherten Erkenntnissen zur stammzelltherapeutischen Sicherheit und Wirksamkeit aus Studien unter Einsatz gängiger Nagermodellen (BLISS et al. 2006, JOO et al. 2013) wird insbesondere die Überprüfung der Wirksamkeit an geeigneten Großtiermodellen gefordert, die die Situation des menschlichen Schlaganfallpatienten möglichst realistisch wiedergeben sollen (SAVITZ et al. 2011). Eine Voraussetzung für die erfolgreiche Testung eines zelltherapeutischen Ansatzes in einem Großtiermodell mit fokaler zerebraler Ischämie besteht darin, ein langfristiges Überleben xenogener Zelltransplantate durch ein geeignetes Immunsuppressionsprotokoll zu erreichen. Die Notwendigkeit einer Immunsuppression besteht darin, dass sowohl allo- als auch xenogene Transplantate eine Immunantwort beim Empfänger auslösen und somit zu einer Abstoßungsreaktion führen können (JANEWAY 2002). Die Anwendung von immunsuppressiven Medikamenten geht dabei aber häufig mit Nebenwirkungen einher. Insbesondere beim Schaf existiert jedoch nur eine limitierte Datenlage zu immunsuppressiven Protokollen und deren Nebenwirkungen. Ziele der Untersuchung Das Ziel der vorliegenden Studie bestand darin, eine xenogene Transplantation von fetalen humanen neuralen Progenitorzellen (fhNPZ) in einem gesunden Schafsmodell durchzuführen, um die Wirksamkeit in Hinblick auf das Transplantatüberleben und die Nebenwirkungen einer Immunsuppression mittels Cyclosporin A (CsA) zu untersuchen. Materialien und Methoden Hierfür wurden je 5 Schafe in zwei Gruppen über einen Zeitraum von 64 Tagen immunsupprimiert (iCsA: 3 mg CsA/kg 2x tägl. bis einschließlich Tag 36, danach 3 mg CsA/kg 1x tägl. jeden 3. Tag; kCsA: kontinuierlich 3 mg CsA/kg 2x tägl.), während eine Kontrollgruppe (Kon) von ebenfalls 5 Tieren keine Immunsuppression erhielt. Am Versuchstag 22 wurde den Schafen eisenmarkierte fhNPZ (Eisenkonzentration: 3,0 mM, ca. 200.000 Zellen pro Transplantationsposition) stereotaktisch in das gesunde Gehirn transplantiert. Aufgrund der Eisenmarkierung der Stammzellen konnten diese an den Versuchstagen 23, 36 und 64 mittels 3,0 MRT-Aufnahmen in vivo überwacht und anschließend ex vivo das Überleben der fhNPZ im Schafhirn 42 Tage nach Transplantation histologisch untersucht werden. Für die Untersuchungen zu Wirkspiegeln und Nebenwirkungen von CsA im Schaf wurden den Versuchstieren innerhalb des Versuchszeitraums regelmäßig Blutproben entnommen und am Versuchsende eine pathologische und histologische Untersuchung von Leber und Nieren durchgeführt. Ergebnisse Bei den durchgeführten Untersuchungen konnte festgestellt werden, dass die CsA-Wirkspiegel im Blut bei der kCsA (424,0 ± 135,0 ng/ml) signifikant höher waren im Vergleich zur iCsA (198,5 ± 155,9 ng/ml). Diese Unterschiede besaßen jedoch keinen Einfluss auf das Langzeitüberleben der transplantierten fhNPZ. In keiner der drei Versuchsgruppen konnten vitale Zellen 42 Tage nach der Transplantation aufgefunden werden. Die Untersuchung der Nebenwirkungen von CsA ergab, dass die Langzeitgabe von CsA Anzeichen für einen hämatologischen Einfluss zeigt. Ebenso konnte sowohl eine hepatotoxische, als auch eine nephrotoxische Wirkung von CsA beim Schaf nachgewiesen werden. Schlussfolgerungen Schlussfolgernd kann zusammengefasst werden, dass die Gabe von 3 mg CsA/kg 2x tägl. nicht suffizient einer Abstoßungsreaktion xenogener ins Schafhirn transplantierter fhNPZ entgegenwirkt. Für das Ziel einer suffizienten zelltherapeutischen Anwendung im Schaf nach einem Schlaganfall sind somit weitere Untersuchungen zu einer wirksamen Immunsuppression beim Schaf und zu einem verbesserten Transplantatüberleben notwendig. Desweiteren konnten klinische und pathologische Nebenwirkungen beim Schaf durch die Langzeitgabe des Immunsuppressivums CsA festgestellt werden.:INHALTSVERZEICHNIS .................................................................................................................... I ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ....................................................................................................... VI 1 EINLEITUNG .............................................................................................................................. 1 2 LITERATURÜBERSICHT ......................................................................................................... 2 2.1 Klassifikation von Stammzellen ......................................................................................... 2 2.2 Tierexperimentelle Stammzelltherapie beim Schlaganfall .............................................. 5 2.2.1 Hintergrund der translationalen Forschung am Tiermodell ............................................... 5 2.2.2 Tiermodelle der fokalen zerebralen Ischämie .................................................................... 6 2.2.3 Das Schaf als Großtiermodell ............................................................................................ 7 2.2.4 Transplantation fhNPZ als zelltherapeutischer Ansatz nach fokaler zerebraler Ischämie . 8 2.2.4.1 Die In-vivo-Überwachung von in Schafhirne transplantierten fhNPZ .......................... 9 2.2.4.2 Der immunhistochemische Nachweis vitaler humaner Zellen ex vivo im Schafhirn .. 11 2.3 Immunsuppression nach der Transplantation von Stammzellen .................................. 12 2.3.1 Wirkmechanismen des angeborenen und erworbenen Immunsystems ........................... 12 2.3.2 Immunantwort nach Transplantation ............................................................................... 12 2.3.3 Wirkstoffklassen von Immunsuppressiva ........................................................................ 14 2.3.4 Cyclosporin A .................................................................................................................. 16 2.3.4.1 Wirkmechanismus von Cyclosporin A ........................................................................ 16 2.3.4.2 Pharmakokinetik und Metabolisierung von Cyclosporin A ........................................ 16 2.3.4.3 Applikation und Dosierung von Cyclosporin A .......................................................... 17 2.3.4.4 Nebenwirkungen und Toxizität von Cyclosporin A .................................................... 17 2.3.4.5 Anwendung von Cyclosporin A in der tierexperimentellen Forschung ...................... 18 2.4 Fragestellung und Versuchsziele der Dissertation .......................................................... 19 3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN ............................................................................... 20 3.1 Zellkultur ............................................................................................................................ 20 3.1.1 Zellkulturmedien und Zusammensetzung ........................................................................ 20 3.1.2 Auftauen und Aussaat der Zellen .................................................................................... 20 3.1.3 Ablösen der Zellen ........................................................................................................... 21 3.1.4 Zellzählung mittels Trypanblautest ................................................................................. 21 3.1.5 Passagieren der Zellen ..................................................................................................... 21 3.1.6 Eisenmarkierung der Zellen ............................................................................................. 22 3.1.7 Proliferations- und Vitalitätstests .................................................................................... 22 3.1.8 Ablösen der Zellen für Transplantationsexperimente ...................................................... 22 3.1.9 Mykoplasmentest ............................................................................................................. 23 3.2 Bestimmung der T2 NMR-Relaxationszeit ...................................................................... 23 3.3 Gelphantome ....................................................................................................................... 24 3.3.1 Herstellung und Ausgießen .............................................................................................. 24 3.3.2 Anfertigen von In-vitro-MRT-Aufnahmen zum Nachweis der eisenmarkierten fhNPZ . 25 3.4 Versuchstiere ...................................................................................................................... 26 3.4.1 Tierhaltung ....................................................................................................................... 26 3.4.2 Versuchstiere im tierexperimentellen Versuch ................................................................ 26 3.4.2.1 Tierärztliche Untersuchung der Vitalparameter .......................................................... 26 3.4.2.2 Durchführung des neurologischen Untersuchungsgangs ............................................. 27 3.4.2.3 Blutprobenentnahme, Versand und Detektiermethode ................................................ 27 3.5 Versuchsaufbau und Durchführung ................................................................................ 28 3.5.1 Anästhesie ........................................................................................................................ 29 3.5.2 Schmerzmittelregime und Infektionsprophylaxe ............................................................. 30 3.5.3 Implantation des Portsystems .......................................................................................... 31 3.5.4 Applikation von CsA ....................................................................................................... 32 3.5.4.1 Herstellung der Infusionslösung .................................................................................. 32 3.5.4.2 Applikation über das Portsystem ................................................................................. 33 3.5.5 Stammzelltransplantation ................................................................................................. 33 3.5.5.1 Anfertigen von MRT-Aufnahmen im 1,5 T MRT ....................................................... 34 3.5.5.2 Planung der stereotaktischen Zelltransplantation ........................................................ 34 3.5.5.3 Stereotaktische Zelltransplantation .............................................................................. 34 3.5.6 Nachweis der eisenmarkierten Stammzellen im 3,0 T MRT ........................................... 35 3.5.6.1 Methodik zum Nachweis und zur Quantifizierung der eisenmarkierten fhNPZ im Schafhirn ...................................................................................................................... 35 3.5.7 Sektion der Versuchstiere und Probenentnahme ............................................................. 36 3.5.8 Anfertigen der histologischen Gewebeschnitte ................................................................ 36 3.5.8.1 Herstellung der Paraffinschnitte .................................................................................. 37 3.5.8.2 Probenaufarbeitung und Lamellieren der Gehirne ....................................................... 37 3.5.8.3 Herstellung der Gefrierschnitte .................................................................................... 38 3.5.9 Histologische Färbungen ................................................................................................. 38 3.5.9.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung ....................................................................................... 40 3.5.9.2 Berliner Blau-Färbung ................................................................................................. 40 3.5.9.3 Fouchét-Färbung .......................................................................................................... 40 3.5.9.4 Immunmarkierung mit STEM101-DAB und Berliner Blau-Färbung ......................... 40 3.5.9.5 Immunhistologische Markierung mit Iba1-Antikörpern .............................................. 40 3.5.10 Auswertung der histologischen Präparate ........................................................................ 41 3.6 Statistik ............................................................................................................................... 44 4 ERGEBNISSE ............................................................................................................................. 47 4.1 Nachweis eisenmarkierter fhNPZ in vitro via MRT-Aufnahmen .................................. 47 4.1.1 Welche Eisenkonzentration ist für die Markierung der fhNPZ am geeignetsten? ........... 47 4.1.2 Können markierte fhNPZ durch eine T2-gewichtete MRT-Sequenz dargestellt werden? ......................................................................................................................................... 49 4.1.3 Wo liegt das Detektionslimit markierter fhNPZ in einer T2-gewichteten MRT-Sequenz? ......................................................................................................................................... 50 4.2 Der Einfluss des Immunsuppressivums CsA auf das Überleben der transplantierten fhNPZ im Schafhirn .......................................................................................................... 51 4.2.1 Gibt es gruppenspezifische Unterschiede in den CsA-Blutkonzentrationen? ................. 51 4.2.2 Besitzt die Transplantation fhNPZ einen neurologischen Einfluss auf die Sensorik und Motorik? .......................................................................................................................... 54 4.2.3 Was geschieht mit den transplantierten fhNPZ im Zeitverlauf und Gruppenvergleich? . 55 4.2.4 Können vitale fhNPZ 42 Tage nach Transplantation im Schafhirn nachgewiesen werden? ......................................................................................................................................... 56 4.3 Klinische und pathologische Nebenwirkungen von CsA im Schaf ................................ 59 4.3.1 Beeinflusst die CsA-Applikation in vivo klinische Parameter oder Blutwerte beim Schaf? ......................................................................................................................................... 59 4.3.1.1 Auswertung der Körpertemperaturverläufe ................................................................. 59 4.3.1.2 Auswertung der Körpergewichtsverläufe .................................................................... 60 4.3.1.3 Auswertung hämodynamischer Parameter .................................................................. 61 4.3.1.4 Auswertung hämatologischer Blutparameter .............................................................. 62 4.3.1.5 Auswertung leberspezifischer Blutparameter .............................................................. 65 4.3.1.6 Auswertung nierenspezifischer Blutparameter ............................................................ 69 4.3.1.7 Auswertung sonstiger Blutparameter .......................................................................... 70 4.3.2 Können ex vivo toxische Einflüsse von CsA auf das Schaf nachgewiesen werden? ....... 71 4.3.2.1 Makroskopische Auswertung der Sektionsbefunde .................................................... 71 4.3.2.2 Histologische Auswertung Leber und Nieren ............................................................. 73 5 DISKUSSION ............................................................................................................................. 76 5.1 Hintergrund der Arbeit und Versuchsziele ..................................................................... 76 5.2 Bewertung des Studiendesigns und der Versuchsdurchführung .................................. 76 5.2.1 Versuchstiere und Haltungsbedingungen ........................................................................ 76 5.2.2 Studiendesign und das Schaf als Tiermodell ................................................................... 77 5.3 Diskussion der Ergebnisse ................................................................................................. 78 5.3.1 Ein Nachweis eisenmarkierter fhNPZ in vitro via MRT-Aufnahmen ist möglich .......... 78 5.3.1.1 Eine Eisenkonzentration von 3,0 mM ist für die Markierung der fhNPZ am geeignetsten ................................................................................................................. 79 5.3.1.2 Markierte fhNPZ können durch eine T2-gewichtete Sequenz dargestellt werden ...... 80 5.3.1.3 Das Detektionslimit markierter fhNPZ liegt in einer T2-gewichteten MRT-Sequenz bei 50.000 Zellen ......................................................................................................... 81 5.3.2 Die Langzeitgabe des Immunsuppressivums CsA besitzt keinen Einfluss auf das Überleben der transplantierten fhNPZ im immunprivilegierten Gehirn .......................... 81 5.3.2.1 Es gibt gruppenspezifische Unterschiede in den CsA-Blutkonzentrationen ............... 81 5.3.2.2 Die Transplantation von fhNPZ besitzt keinen bedeutenden Einfluss auf die Sensorik und Motorik ................................................................................................................. 83 5.3.2.3 Die transplantierten fhNPZ zeigen Veränderungen in Zeitverlauf und Gruppenvergleich ........................................................................................................ 84 5.3.2.4 Es können keine vitalen fhNPZ 42 Tage nach Transplantation im Schafhirn nachgewiesen werden .................................................................................................. 85 5.3.2.5 Schlussfolgerung zur Immunsuppression mittels CsA nach Stammzelltransplantation ins Schafhirn ................................................................................................................ 87 5.3.3 Die Langzeitgabe von CsA verursacht Anzeichen für pathologische Veränderungen und klinische Symptome beim Schaf ...................................................................................... 88 5.3.3.1 Die Langzeitgabe von CsA beeinflusst klinische Parameter beim Schaf .................... 88 5.3.3.2 Die Langzeitgabe von CsA zeigt wahrscheinlich keine hämodynamische Wirkung .. 89 5.3.3.3 Die Gabe von CsA zeigt Anzeichen für eine hämatologische Wirkung beim Schaf ... 89 5.3.3.4 Die Gabe von CsA zeigt eine hepatotoxische Wirkung beim Schaf ........................... 90 5.3.3.5 Die Gabe von CsA zeigt eine nephrotoxische Wirkung beim Schaf ........................... 93 5.3.3.6 Die Langzeitgabe von CsA beeinflusst weitere unspezifische Blutparameter ............ 95 5.3.3.7 Schlussfolgerungen zu Nebenwirkungen von CsA beim Schaf .................................. 95 5.4 Allgemeine Schlussfolgerung ............................................................................................. 95 5.5 Ausblick ............................................................................................................................... 96 6 ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................................ 97 7 SUMMARY ................................................................................................................................. 99 8 LITERATURVERZEICHNIS ................................................................................................. 101 9 ANHANG ................................................................................................................................... 110 9.1 Ergänzende Tabelle zur Herstellung der Gelphantome ............................................... 110 9.2 Ergänzende Tabellen zur Herstellung histologischer Präparate ................................. 111 9.2.1 Herstellung der Paraffinblöcke ...................................................................................... 111 9.2.2 Histologische Färbungen und Immunhistochemische Methoden .................................. 112 9.3 Ergänzende Tabellen zur Statistik ................................................................................. 116 9.4 Verwendete Referenzwerte ............................................................................................. 118 9.5 Übersicht der ausgewerteten Blutparameter ................................................................ 119 9.6 Übersicht zu tierexperimentellen Einsätzen von Stammzellen in Schlaganfallmodellen ........................................................................................................................................... 122 9.7 Auflistung verwendeter Materialien und Geräte .......................................................... 123 9.8 Abbildungsverzeichnis ..................................................................................................... 129 9.9 Formelverzeichnis ............................................................................................................ 130 9.10 Tabellenverzeichnis ......................................................................................................... 130 10 DANKSAGUNG ....................................................................................................................... 132

La reconnaissance des cellules tumorales par le système immunitaire, appelée immunosurveillance, permet le contrôle de lacroissance des tumeurs voir dans certains cas leur élimination. Cependant, de nombreuses études d’exploration du système immunitaire dans le contrôle de la réponse antitumorale ont mis en évidence des mécanismes complexes d’échappement à cette immunosurveillance,avec par exemple pour les lymphocytes TCD8+ (LT CD8+) principal acteur de cette réponse, un défaut de migration, de reconnaissance des cellules tumorales ou d’activation au sein de la tumeur. Cette inhibition de fonction des LTCD8+, peut être liée à un phénomène appelé exhaustion, lié à l’expression à leur surface de molécules de costimulation inhibitrices telles que PD1, TIM-3, Lag3, CTLA-4. L’interaction de ces récepteurs avec leurs ligands engendre une perte de contrôle de la réponse antitumorale, favorisant alors la progression tumorale. Afin de lever ce phénomène d’exhaustion induit sur les LT CD8+ et restaurer la réponse antitumorale, plusieurs stratégies de traitements, visant à inhiber ces « checkpoints inhibiteurs » ont étédéveloppées. L’effet clé de la ciclosporine-A(CsA) repose sur la modulation de l’activité des lymphocytes T, ce qui explique son rôle dans la prévention du rejet de greffe. Cependant, il reste à déterminer si la CsA exerce d'autres effets sur le système immunitaire.Les évidences scientifiques montrent un effet paradoxal de la faible dosage de cyclosporine-A (fd-CsA). Ces résultats nous ont permis d’émettre l’hypothèse d’un rôle de la fd-CsA dans la modulation de la réponse antitumorale des LT CD8+, Nous avons pu observer à l’inverse, qu’à faible dose de ciclosporine-A, soit une dose équivalente entre 10 et 30 ng/mL, l’expression de PD1 était significativement diminuée à la surface des LT CD8+ activé. En revanche, à cette faible dose, aucun effet significatif sur la diminution d’expression du marqueur d’activation CD69 n’a été observé. Des expériences effectuées in vivo dans le modèle murin de mélanome B16F10 et MCA nous ont par ailleurs permis de montrer une réduction de la croissance tumorale chez les souris traitées par fd-CsA par rapport aux souris non traitées. En utilisant un modèle murin de fibrosarcome MCA, nous avons montré que nous restaurions in vivo une réponse immunitaire antitumorale et qu’un traitement de ces souris par fd-CsA en combinaison avec l’anti PDL-1 permettait une guérison après traitement, alors que l’anti PDL-1 seul n’avait pas d’effet. Cet effet novateur de la fd-CsA permet donc de visualiser de nouvelles stratégies thérapeutiques dans la réponse antitumorale qui pourraient bénéficier aux futurs patientsdiagnostiqués d’un cancer. / The recognition of tumor cells by the immune system, called immunosurveillance, allows the control of tumor growth or in some cases their elimination. However, numerous studies of the immune system in the control of the antitumor response have revealed complex mechanisms by means of which this immunosurveillance can be evaded. Examples of this occurrence are CD8+ T lymphocytes, the main element of this response are defective migration, tumor cell non-recognition or non-activation within the tumor. This inhibition of CD8+ T cell function may be related to a phenomenon called exhaustion, which may be a result of the expression on their surface of inhibitory costimulatory molecules such as PD1, TIM-3, Lag3, CTLA-4. The interaction of these receptors with their ligands causes a loss ofcontrol of the antitumor response, thus promoting tumor progression. To overcome this phenomenon of exhaustion induced in CD8+ T cells and restore the antitumor response, several treatment strategies aimed at inhibiting these "inhibitory checkpoints" have been developed. The key effect of cyclosporin-A (CsA) is modulation of T-cell activity, which explains its role in the prevention of transplantrejection. However, it remains to be determined whether CsA has other effects on the immune system. Preliminary results have allowed us to demonstrate the paradoxical effect of cyclosporin-A (CsA) in the antitumor response. Thus, these unexpected results have allowed us to hypothesize a role for Ld-CsA in modulating the antitumor response of CD8+ Tcells. We observed that Ld-CsA at equivalent dose between 10 and 30 ng/mL, significantly decreased PD1 expression at the activated CD8+ T cell surface. Furthermore, at this lowdose, no significant effect was observed on the expression of the CD69 activation marker. We have also shown that Ld-CsA increases the vaccine response in vivo. In vivo experiments with the murine B16F10 melanoma model and MCA fibrosarcoma have also shown areduction in tumor growth in mice treated with d-CsA compared to untreated mice. More recently, using a mouse model of MCA-OVAfibrosarcoma, we have shown that we can restore the in-vivo antitumor immune response and that the treatment of these mice by Ld-CsAin combination with the anti PDL-1, allowed tumor regression, whereas anti PDL-1 alone had no effect. This novel effect of Ld-CsA allows us therefore to visualize new therapeutic strategies for the antitumor response which may benefit future patients diagnosed with cancer.

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) touche un garçon sur 3500, contraint à l'usage du fauteuil roulant à l'âge de 10 ans, et entraîne le décès à une vingtaine d'années. Cette maladie demeure incurable, et les pistes thérapeutiques envisagées nécessitent d'être validées en amont, dans les modèles murins, puis au stade pré-clinique, dans les modèles canins.L'un d'eux, le chien GRMD (Golden Retriever Muscular Dystrophy), est le plus largement utilisé, et présente l'intérêt de partager, avec le patient qu'il modélise, de nombreuses similitudes génotypiques et phénotypiques. Les différentes fonctions touchées doivent donc pouvoir faire l'objet de mesures objectives et quantitatives, à l'aide d'outils dédiés. Par ailleurs, une problématique inhérente à l'utilisation de ce modèle est sa grande variabilité sur le plan phénotypique.L'objectif du travail mené ici a été de développer des outils d'évaluation du chien GRMD, afin de mieux connaître et maîtriser cette hétérogénéité clinique.La mesure de force de flexion du tarse a permis de démontrer que la force tétanique maximale pouvait être utilisée comme indice d'évaluation à différents stades de la maladie, sans que le déficit de force musculaire puisse être relié à l'atteinte motrice globale. De plus, la relaxation s'est avérée altérée chez les chiens GRMD, en corrélation avec leur atteinte motrice.La locomotion, évaluée par accélérométrie tri-dimensionnelle, a pu montrer des altérations multiples, mesurées par différentes variables. Certaines variables sont altérées de manière précoce, tandis que d'autres anomalies s'installent durant les premiers mois, traduisant l'aggravation de la fonction locomotrice.La dysfonction respiratoire, évaluée par spirométrie en respiration de Tidal, et cinématique diaphragmatique sur images radioscopiques, a également pu être objectivée par différents indices. Une moindre mobilité diaphragmatique, une rétraction caudale du diaphragme, et un effondrement du débit expiratoire en fin d'expiration, s'installent au cours des premiers mois.Afin de contrôler l'hétérogénéité clinique ainsi mesurée, une recherche de marqueurs prédictifs de l'évolution clinique a été menée. Différents indices histologiques et cliniques ont été évalués sur leur valeur pronostique à un stade précoce. La fréquence des cycles locomoteurs à 2 mois et le défaut de relaxation à 4 mois se sont avérés prédictifs de formes accélérées.Enfin, les différents outils mis en place ont été évalués dans le cadre du suivi d'animaux au cours d'un essai thérapeutique, qui a, de plus, permis de disposer d'une population de référence sous traitement immunosuppresseur. Une amélioration fonctionnelle des animaux traités a pu être démontrée par nombre des indices mesurés.Ces résultats démontrent que les outils développés sont utilisables au cours d'essais pré-cliniques, et permettent, malgré l'hétérogénéité clinique qu'ils mesurent, de démontrer un bénéfice fonctionnel. Plus largement, ces données permettent d'optimiser l'utilisation pré-clinique du modèle GRMD. / Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) affects one boy over 3500 at birth. The affected individuals are wheelchair-bound at about 10 years, and death occurs in the early twenties. DMD remains incurable, and therapeutic strategies need to be validated in murine models, and, subsequently, at the preclinical stage, in canine models.Among the existing canine models, the GRMD (Golden Retriever Muscular Dystrophy) dog is the most widely used. The strong genotypic and phenotypic similarities it shares with DMD patients make this model of great interest. The many affected functions must therefore be reliably measured using dedicated tools, providing objective and quantitative evaluation. Moreover, the wide phenotypic heterogeneity peculiar to this model may compromise its use in preclinical studies.The aim of the present work was to develop evaluation tools for the GRMD dog, in order to better know and handle this clinical variability.The measurement of the contraction force generated by tarsal flexion has shown that the maximal tetanic force could be used as an evaluation index, at different stages of the disease. However, no correlation with the global motor impairment could be found. Conversely, the relaxation has shown to be altered in GRMD dogs, and correlated with the motor impairment.The locomotion was evaluated using three-dimensional accelerometry. This method allowed the measurement of several variables, some of which being early impaired, and some others being altered in a more progressive fashion, reflecting the degradation of the locomotor function.The respiratory impairment has been evaluated by diaphragmatic kinematics using radioscopic acquisitions and by Tidal-breathing spirometry. The diaphragm was shown to be less mobile, and to be caudally displaced. The end-expiration flows were decreased. These abnormalities progressed during the first months.In order to better handle the clinical heterogeneity, some markers able to predict the clinical evolution were looked for. The prognostic value of many histological and clinical indexes at an early stage has been evaluated. The stride frequency at the age of 2 months, as well as the relaxation impairment at the age of 4 months succeeded in predicting severe accelerated forms.Finally, the developed tools have been tested in the context of a clinical follow-up during a therapeutic trial. This trial also aimed to provide a reference-group of GRMD dogs treated with immunosuppressive drugs. Several indexes have demonstrated a clinical improvement of the treated animals.These results show that the developed tools are useable during preclinical trials and allow to quantitatively highlight a functional improvement, despite the clinical heterogeneity. More widely, these data will lead to an optimization of the preclinical use of GRMD dogs.

Im ersten Teil der Arbeit (Kapitel 2) wird über den Versuch berichtet, die Steroidtherapie nach erfolgreicher Pankreas- und Nierentransplantation (PTX/NTX) zu beenden, um steroidassoziierte Nebenwirkungen zu reduzieren. Alle 32 in dieser Studie untersuchten Patienten wurden initial mit Anti-T-Zell Globulin (ATG), Tacrolimus (Tac), Mycophenolat Mofetil (MMF) und Steroiden behandelt. Von einem erfolgreichem Absetzten der Steroide wurde ausgegangen, wenn die Steroidtherapie innerhalb der ersten 15 Monate nach PTX/NTX beendet werden konnte. Dieses Ziel konnte bei 72% (23/32) bzw. 56% (18/32) der Patienten 1 bzw. 4 Jahre nach der PTX/NTX erreicht werden. Der häufigste Grund für ein nicht fristgerechtes Absetzen der Steroide waren MMF-assoziierte Nebenwirkungen, die eine Reduktion oder das Absetzen des MMF erforderlich machten, so dass die Steroidtherapie fortgeführt werden musste. Das 1- und 4-Jahres-Patienten-, Pankreastransplantat- und Nierentransplantat- Überleben war mit 100/97/100% und 97/87/91% exzellent, wobei kein Unterschied zwischen Patienten mit fristgerecht und nicht fristgerecht beendeter Steroidtherapie beobachtet wurde. Auch unterschieden sich die Parameter des Glukose- und Fettstoffwechsels nicht zwischen den beiden Patientengruppen. Die akuten Rejektionen erwiesen sich bei den Patienten, bei denen das Steroid nach der PTX/NTX erfolgreich abgesetzt werden konnte, im Vergleich zu den Patienten, bei denen dies nicht der Fall war, häufiger als steroidsensibel und führten häufiger zu einer Normalisierung der Transplantatfunktion. Weitere Vorteile, die in der Gruppe der Patienten mit erfolgreichem Absetzten des Steroids beobachtet wurden, waren eine geringere Inzidenz von CMV-Infektionen trotz Einnahme einer höheren MMF-Dosis und ein niedrigerer arterieller Blutdruck. Operationspflichtige Komplikationen traten in dieser Gruppe jedoch häufiger auf. Diese über einen so langen Nachbeobachtungszeitraum erhobenen Daten zeigen erstmals, dass, bei Anwendung des o. a. immunsuppressiven Schemas, ein großer Teil der PTX/NTX Patienten erfolgreich und langfristig ohne Steroide weiterbehandelt werden konnten. Der Benefit der Beendigung einer Steroidtherapie muss jedoch in größeren, vergleichenden und prospektiven Studien mit langer Laufzeit bestätigt werden. Im zweiten Teil der Arbeit (Kapitel 3) wird ein Vergleich der immunsuppressiven Potenz der Calcineurininhibitoren Ciclosporin-A (CyA) und Tacrolimus (Tac) bei Patienten mit PTX/NTX im Rahmen einer randomisierten, prospektiven multizentrischen Studie vorgenommen. Insgesamt wurden 205 Patienten randomisiert und erhielten entweder CyA oder Tac sowie ATG, MMF und Steroide. Nach einem Jahr befanden sich noch 77% der mit Tac und 47% der mit CyA behandelten Patienten in der Studie (p / The first part (Chapter 2) is focussing on the attempt to withdraw steroids after successful simultaneous pancreas and kidney transplantation (SPK) in order to reduce steroid induced side effects. All 32 SPK-patients of this study received Anti-T Cell-Globulin (ATG), Tacrolimus (Tac), Mycophenolate Mofetil (MMF) and Steroids as initial immunosuppression. Successful steroid withdrawal was defined as cessation of steroids within 15 months after SPK. This aim could be achieved in 72% (23/32) and 56% (18/32) of the patients 1 and 4 years after SPK, respectively. The main reason not to withdraw steroids in time was caused by MMF-associated adverse effects which required a reduction or termination of the MMF therapy, thus preventing the discontinuation of the steroid therapy. On the other hand rejection episodes were the only reason for a resumption of the steroid therapy. The 1- and 4 year survival of patients, pancreas and kidney transplants was 100/97/100% and 97/87/91%, respectively. No difference was observed in patients with and without successful steroid withdrawal concerning patient and transplant survival as well as parameters of the lipid and glucose metabolism. Acute rejection episodes in patients with successful steroid withdrawal were more often steroid sensitive and showed a higher frequency of normalised transplant function as compared to acute rejections in patients under continuing steroid medication. Further advantages which could be observed in the group of patients with successful steroid withdrawal were a lower incidence of CMV-infection despite intake of higher doses of MMF and a lower arterial blood pressure; the frequency of surgical complications, however, was higher in this group. This long term observation showed for the first time that under the above mentioned immunosuppression scheme the majority of SPK patients could be successfully and lastingly withdrawn from steroids. However, the benefits of steroid withdrawal in SPK will need to be confirmed in larger, prospective and comparative studies with long observation periods. In the second part (Chapter 3) of this paper, the immunosuppressive potency of the calcineurininhibitors Ciclosporin A (CyA) and Tacrolimus (Tac) in SPK patients is compared in a randomised prospective multicentre trial for the first time. A total of 205 patients were randomised to receive CyA or Tac along with a combined scheme consisting of ATG, MMF, and steroids. After 1 year, 77% of the Tac- and 47% of the CyA-groups remained in the study (p