Titre de l'écran-titre (visionné le 31 juillet 2023) / Au cours des deux dernières décennies, les tissus adipeux ont été de plus en plus reconnus pour leurs propriétés endocrines, c'est-à-dire leur capacité à sécréter un certain nombre d'adipocytokines qui peuvent exercer des effets locaux et/ou systémiques. En plus de ces peptides hormonaux, les tissus adipeux sont depuis longtemps reconnus comme des sites importants de transformation et d'action des hormones stéroïdiennes. La présente thèse se concentre principalement sur deux enzymes stéroïdogéniques exprimées dans les tissus adipeux, à savoir: l'aldocétoréductase 1C1 (AKR1C1) et la 17β-hydroxystéroïde déshydrogénase de type 2 (17β-HSD2). La première enzyme transforme la progestérone en un métabolite inactif : la 20α-progestérone. La seconde transforme la testostérone et l'estradiol en androstènedione et en estrone respectivement. Le projet est basé sur l'étude d'échantillons de tissu adipeux humains obtenus de diverses sources. Quatre objectifs spécifiques sont proposés: 1- Caractériser l'activité et l'expression des aldocétoréductases 1C dans les tissus abdominaux chez la femme; 2- Caractériser l'expression et l'activité de l'aldocétoréductase 1C1 (AKR1C1) en fonction de l'obésité abdominale dans les dépôts adipeux abdominaux chez la femme; 3- Caractériser la relation entre les taux de progestérone circulante et l'adiposité chez l'homme; 4- Caractériser l'activité et l'expression de la 17β-HSD2 dans les tissus adipeux abdominaux chez la femme. Ces travaux nous ont permis de mieux comprendre les liens entre l'homéostasie hormonale et l'obésité chez l'homme et la femme, par l'intermédiaire de travaux qui considèrent l'importance de la transformation locale des hormones par les enzymes stéroïdogéniques selon les principes de l'intracrinologie. À la lumière de nos résultats, il serait pertinent de continuer à considérer l'importance des différents dépôts adipeux et de poursuivre leurs études de manière indépendante et interdépendante afin de caractériser leur développement fonctionnel et organisationnel, leur régulation et impact sur les autres organes. Ces études auront pour finalité une meilleure compréhension globale de l'impact du tissu adipeux sur la santé de l'humain. / Over the past two decades, adipose tissue has been increasingly recognized for its endocrine properties, i.e., its ability to secrete a number of adipocytokines that can exert local and/or systemic effects. In addition to these hormonal peptides, adipose tissue has long been recognized as important sites of steroid hormone processing and action. This thesis focuses mainly on two steroidogenic enzymes expressed in adipose tissue, namely: aldoketoreductase 1C1 (AKR1C1) and 17β-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 (17β-HSD2). The former enzyme converts progesterone to an inactive metabolite. 20α-progesterone and the second convert testosterone and estradiol to androstenedione and estrone, respectively. The project is based on the study of human adipose tissue samples obtained from various sources. Four specific objectives are proposed: 1- To characterize the activity and expression of 1C aldoketoreductases in female abdominal tissues; 2- To characterize the expression and activity of aldoketoreductase 1C1 (AKR1C1) in relation to abdominal obesity in abdominal fat deposits in women; 3- To characterize the relationship between circulating progesterone levels and adiposity in men; 4- To characterize the activity and expression of 17β-HSD2 in abdominal adipose tissue in women. This work has allowed us to better understand the links between hormonal homeostasis and obesity in men and women, by considering the importance of local processing of hormones by steroidogenic enzymes according to the principles of intracrinology. In light of our results, it would be relevant to keep on considering the importance of the different adipose depots and further study them independently and interdependently in order to characterize their functional and organizational development, their regulation and impact on other organs. These studies will lead to a better global understanding of the impact of adipose tissue on human health.

La 17β-hydroxystéroïde déshydrogénase humaine de type 7 (17β-HSD7) a une double fonction dans la cholestérologénèse et la stéroïdogénèse, et qui est impliquée à la fois dans la formation d’estradiol (E2) à partir de l’estrone (E1), et dans la dégradation de la dihydrotestostérone (DHT) en un œstrogène faible (3β-diol). Cependant, sa fonction dans le cancer du sein dépendant des œstrogènes (positif aux récepteurs oestrogéniques (RE+) n’a pas toujours été claire. L’E2 stimule la croissance des cellules cancéreuses du sein (CCS; cellules MCF-7) via les RE tandis que la DHT a un effet antiprolifératif via le récepteur des androgènes. Mes études in vitro, in vivo et de protéomique, ont apporté les résultats suivants : (1) L’inhibition de la 17β-HSD7 par un inhibiteur spécifique (INH7) dans les CCS a entrainé une baisse de l’E2, une augmentation de la DHT, une interruption du cycle cellulaire et une régulation négative de cette enzyme. De plus, l’INH7 a permis de réduire des tumeurs xénogreffes qui a été accompagnées d’une diminution de l’E2 et une augmentation de la DHT sériques. (2) L’INH7 a modulé des protéines impliquant différents processus biologiques. L’INH7 a supprimé l’expression de la protéine 78 régulée par le glucose (Grp78) et de fait a augmenté l’apoptose des CCS envers le Letrozole, un inhibiteur de l’aromatase. (3) Les interactions entre les CCS et les fibroblastes tumoraux montrent que la 17β-HSD7 était l’enzyme la plus régulée dans les CCS tandis que l’aromatase était l’enzyme les plus régulées dans les fibroblastes. De telles régulations ont mené à une augmentation de la conversion de l’E2 à partir de ses précurseurs, et a ainsi encouragé la prolifération cellulaire des CCS. Si l’augmentation de la prolifération cellulaire est bloquée par le Letrozole des résultats plus significatifs ont été observés par l’INH7 qui bloque la dégradation de la DHT. (4) L’analyse des données intégratives basée sur The Cancer Genome Atlas (TCGA) confirme l’amplification significative du gène HSD17B7 dans les divers cancers du sein comparé à des tissus mammaires sains. Ainsi, nous pensons que la 17β-HSD7 devrait être une nouvelle cible thérapeutique des cancers RE+ du sein. / Human 17β-hydroxysteroid dehydrogenase type 7 (17β-HSD7) displays a dual function in cholesterogenesis and steroidogenesis. In steroidogenesis, it is both involved in the formation of the estradiol (E2) from estrone (E1) and in the degradation of dihydroterstosterone (DHT) into weak estrogen 5α-androstane-3β, 17β-diol (3β-diol). However, its function in estrogen dependent breast cancer (estrogen receptor positive, ER+) has been unclear for many years. E2 stimulates breast cancer cells (BCCs, MCF-7 cells) growth via estrogen receptor (ER) whereas DHT displays anti-proliferative effects via androgen receptor (AR). In the present thesis, the function of 17β-HSD7 in ER+ breast cancer was studied with in vitro, in vivo, proteomics and three dimensional (3D) co-culture model and results were described: (1) Inhibition of 17β-HSD7 by its selective inhibitor (INH7) in BCCs induced significant lower E2, higher DHT, cell cycle arresting and negative regulating of the same enzyme. Such inhibition induced significant shrinkage of xenograft tumors accompanied by decreased E2 and elevated DHT in plasma. (2) Inhibition of 17β-HSD7modulated 104 proteins involved in different biological processes. INH7 especially suppresses the expression of glucose regulated protein 78 (GRP78) and consequently enhanced apoptosis of MCF-7 towards aromatase inhibitor. (3) The interactions between BCCs and tumor fibroblast modulate steroidogenic enzymes. 17β-HSD7 was the most modulated enzyme in MCF-7 cells whereas aromatase was the most regulated enzyme in fibroblast (Hs578Bst). Such regulations led to an increasing of E2 conversion from precursors and promoted MCF-7 cells’ proliferation. The increased cell proliferation was blocked by aromatase inhibitor in 3D co-culture system, but more significant results were observed with INH7 which blocked DHT degradation. (4) Integrative data analysis with The Cancer Genome Atlas (TCGA) confirmed the significant amplification of 17β-HSD7 in various breast cancers compared to normal breast tissue. Thus, in the present thesis, 17β-HSD7 was characterized as a novel therapeutic target for estrogen dependent breast cancer in postmenopausal women.

Au Canada et partout dans le monde, le cancer du sein est un enjeu de taille en santé publique. L'exposition élevée à l'estradiol (E2) est considérée comme un facteur de risque majeur du cancer du sein. La synthèse de cette hormone est catalysée par la 17β-hydroxystéroïde déshydrogénase (17β-HSD), en particulier la 17β-HSD de type 1 (17β-HSD1) qui utilise le NADPH comme cofacteur et catalyse la conversion de l'estrone (E1) en E2. Le signal d'E2 est médié par le récepteur d'estrogène, une fois ce dernier activé par E2, on constate une stimulation de la croissance et de la prolifération cellulaire. Différents inhibiteurs sont utilisés en clinique pour bloquer la synthèse finale d'E2. Cependant aucun inhibiteur de la 17β-HSD1 n'est encore utilisé en clinique malgré l'importance de cette enzyme dans la conversion de l'E1 en E2. Ceci est certainement dû au fait que les inhibiteurs de la 17β-HSD1 sont des dérivés d'E2 d'où la difficulté d'éliminer complètement l'activité estrogénique non desirée. Dans nos travaux, nous avons tenté d'inhiber l'activité ou l'expression de la 17β-HSD1 pour étudier son effet sur la régulation du profil protéique et génomique, sur le cycle cellulaire et sur l'invasion cellulaire des cellules cancéreuses MCF7 et T47D. Nos résultats montrent que l'inhibition de la 17β-HSD1 module l'expression de diverses protéines impliquées dans la prolifération cellulaire tels que la tumor protein D54, dans le cycle cellulaire tels que la 14-3-3 epsilon et la tumor protein D53, et dans l'invasion cellulaire tels que la nm23. Aussi, l'inhibition de la 17β-HSD1 dans les cellules T47D régule l'expression des gènes impliqués dans le transport (RANBP3L, APOD), la liaison d'ADN (HIST1H2BM), le traitement de l'antigène et la présentation de l'antigène de peptide ou de polysaccharide par l'intermédiaire du CMH de classe II (HLA- DQA2), la régulation transcriptionnelle (TP63) et dans l'adhérence cellulaire (CD36). Au niveau des deux lignées cellulaires utilisées T47D et MCF7, l'inhibition de la 17β-HSD1 diminue la prolifération cellulaire, la formation d'E2, l'invasion et la migration cellulaire et mène aussi à l'arrêt du cycle cellulaire en phase G0/G1. Nos résultats montrent l'importance majeure de l'inhibition de la 17β-HSD1 dans un contexte de cancer du sein estrogéno-dépendant. Le cancer du sein est aussi une pathologie génétique associée à des modifications quantitatives et /ou iv qualitatives des gènes tels que le gène codant pour la tropomyosine (Tm). Il a été démontré que l'expression de la Tm1 est perdue dans les cellules cancéreuses métastatiques du sein. Mon deuxième projet de recherche consistait à étudier l'effet de la phosphorylation de la tropomyosine 1 alpha sur la prolifération, l'adhérence, la formation de colonies et la migration des cellules cancéreuses du sein MDA-MB231. Pour cet effet des transfectants MDA-MB231 stables exprimant soit la Tm-1α sauvage, soit la Tm-1α mutante non-phosphorylable (Ser283Ala) ou encore la Tm-1α mutante pseudophosphorylée (Ser283Glu) ont été générés. Nos résultats montrent que les cellules exprimant la forme phosphomimétique (pseudo-phosphorylée) de la Tm1 S283E/Tm1 sont caractérisées par une adhérence accrue au substrat. Aussi, la migration transendothéliale et la migration dans un essai de cicatrisation de ces cellules est réduite par rapport aux cellules parentales ou ceux exprimant la forme non-phosphorylable de la Tm1 (S283A). En outre, nous avons constaté que les cellules exprimant les mutants S283A forment plus de colonies en agar mou que ceux exprimant les mutants S283E, montrant ainsi que la phosphorylation de la Tm1 sur la Ser283 contribue à ses propriétés anti-tumorales.

OBJECTIF: Déterminer si un régime de Bicalutamide et de Dutasteride est d’efficacité similaire à un régime standard pour la cytoréduction prostatique avant une curiethérapie prostatique par implants permanents et comparer la toxicité de ces deux régimes. MÉTHODE Les patients avec un adénocarcinome de la prostate traités par curiethérapie prostatique ayant un volume prostatique initial de plus de 50 cc ont été randomisés soit à un régime de Bicalutamide 50 mg die, de Dutasteride 0.5 mg die et de tamoxifen 10 mg die pour prévenir la gynécomastie (Groupe expérimental = GE) versus un agoniste de la LHRH (dose de 3 mois) avec du Bicalutamide 50 mg die pour 1 mois (Groupe contrôle = GC). Le volume prostatique total (VPT) a été mesuré à la randomisation (t1) et environ 2.5 mois après le début du traitement de cytoréduction (t2). La curiethérapie par implant permanent d’I-125 à été réalisé environ 3 mois après la randomisation. Le changement de VPT relatif en % à été comparé entre les groupes. Des questionnaires EPIC (Expanded Prostate Index Composite) ont été complétés au t1, t2, ainsi qu’à 6 semaines (t3), 3 mois (t4) et 6 mois (t5) post-curiethérapie. Le profil de changement des scores sexuels et hormonaux du questionnaire EPIC a été évalué de façon qualitative. RÉSULTATS Les premiers 11 patients randomisés dans l’étude ont été analysés (GE n=5, GC ; n=6). Les caractéristiques de base entre les deux groups étaient similaires. Tous les patients présentaient des caractéristiques de cancer de prostate de bas risque (APS< 10, Stade clinique ≤T2a et un score de Gleason ≤6). Le VPT médian au t1 était de 51,00 cc dans le GE et de 55,56 cc dans le GC. Les diminutions médianes entre le volume t1 et le volume t2 en absolu étaient de 18,46 cc dans le GE et de 24,61 cc dans le GC (valeur-p au test exact de Wilcoxon 0,03). Pour ce qui est de la médiane de changement relatif de volume entre t1 et le volume au t2, celles-ci étaient de 36,44 % dans le GE et de 40,83 % dans le GC (valeur-p 0,25). Tous les 11 patients ont pu subir la curiethérapie sans interférence de l’arche pubienne et avec des paramètres dosimétriques acceptables. Les médianes de scores de fonction sexuelle et de sommaire hormonal semblent qualitativement démontrer un meilleur profil au sein du GE. DISCUSSION Cette analyse exploratoire n’a pas la puissance suffisante pour permettre de rejeter ou d’affirmer une hypothèse de non-infériorité du régime expérimental du point de vue de la cytoréduction prostatique. Toutefois, ce régime a permis à tous les patients de subir la curiethérapie sans interférence de l’arche pubienne et avec des paramètres dosimétriques acceptables. Le Bicalutamide et le Dutasteride ont aussi démontré un profil de toxicité favorable. Les résultats de cette analyse précoce justifient donc de continuer à randomiser des patients au sein de cette étude mais ne permettent pas de tirer des conclusions définitives en raison de la petite taille d’échantillon. / OBJECTIVE: To determine if a regimen of Bicalutamide and Dutasteride is of similar efficacy compared to a standard regimen for prostate cytoreduction prior to permanent implant prostate brachytherapy and to compare toxicity for both of these regimens MATERIALS AND METHODS Patients with an adenocarcinoma of the prostate treated with permanent implant brachytherapy having an initial total prostate volume of 50 cc or more were randomized to either Bicalutamide 50 mg daily, Dutasteride 0.5 mg daily and Tamoxifen 10 mg daily (Experimental group = EG) or an LHRH agonist (3 month dose) and Bicalutamide 50 mg daily for one month (Control Group = CG). Total prostate volume (TPV) was evaluated at time of randomization (t1) and approximately 2.5 months after the start of cytoreductive therapy (t2). Permanent implant I-125 brachytherapy was completed 3 months after randomization. Relative TPV change in % and absolute TPV change in cc were compared between groups. Expanded Prostate Index Composite questionnaires were completed by patients at t1, t2, as well as at 6 weeks (t3), 3 months (t4), and 6 months (t5). Profile changes in EPIC sexual and hormonal domains were evaluated qualitatively. RESULTS The first 11 patients registered for the study were analyzed (EG n=5; CG n=6) Baseline parameters were similar between groups. All patients had low risk characteristics (PSA < 10, Clinical stage ≤T2a and Gleason score ≤6). Median baseline TPV was 51.00 cc in EG and 55.56 in CG. Median reduction in absolute TPV was 18.46 cc in EG and 24.61 in CG (Wilcoxon exact test p=0.03). As for median relative change in TPV, this was 36.44 % in EG and 24.61 cc in CG (p=0.25). All 11 patients were able to undergo brachytherapy without pubic arch interference and with acceptable dosimetric parameters. Median EPIC of both sexual and hormonal domains of the EPIC questionnaire seemed to favor the EG over time. DISCUSSION This early exploratory analysis does not have sufficient power to reject or accept the hypothesis of non-inferiority the experimental regimen for prostate volume reduction. Nonetheless, this regimen allowed brachytherapy without pubic arch interference and with acceptable dosimetric parameters. The experimental regimen of Bicalutamide and Dutasteride also seemed to show a favorable toxicity profile. The results of this early analysis thus justify continued randomization for the study but do not allow definitive conclusions due to small sample size.

L’estradiol (E2) accélère la maturation pulmonaire et la 17β-hydroxystéroïde déshydrogénase de type 2 (17ßHSD2) inactive les estrogènes et les androgènes. L’expression de la 17ßHSD2 fluctue et culmine dans le poumon foetal murin au jour gestationnel 17,5. Les fluctuations de la 17ßHSD2 pulmonaire pourraient être associées aux niveaux de E2 foetal. La 17ßHSD2 placentaire pourrait alors réguler E2 foetal et maternel. Cette étude établit s’il existe une corrélation entre E2 foetal et la 17βHSD2 pulmonaire et compare les ratios (E2 foetal/ E2 maternel) avec l’expression de la 17βHSD2 placentaire. E2 fut dosé par spectrométrie de masse et l’ARNm de la 17βHSD2 fut mesuré par QPCR. Aucune corrélation entre E2 foetal et la 17ßHSD2 pulmonaire n’existe. Les ratios de E2 ne corrèlent pas avec la 17ßHSD2 placentaire. Ces résultats suggèrent un contrôle local de la 17ßHSD2 dans les poumons foetaux tandis que les ratios E2 pourraient être régulés par la 17βHSD1 placentaire. / Estradiol (E2) exerts a positive effect on fetal lung maturation. The 17 beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 (17ßHSD2) inactivates estrogens and androgens. 17ßHSD2 also presents a peak and an inter-litter variation of expression at gestational day 17.5 in the murine fetal lung. The variability of the pulmonary 17ßHSD2 mRNA levels could be explained by variations in fetal E2 levels. The placental 17ßHSD2 could regulate fetal and maternal E2. This study determined if a correlation exists between fetal E2 levels and pulmonary 17βHSD2 mRNA levels. A comparison was also made between E2 ratios (fetal / maternal) and the placental 17βHSD2 mRNA levels. E2 was measured by gas chromatography-mass spectrometry and 17βHSD2 was determined by quantitative PCR. There is no correlation between levels of fetal E2 and pulmonary 17ßHSD2 mRNA. Ratios of E2 levels do not correlate with placental 17ßHSD2 mRNA. These results suggest a local control of 17ßHSD2 mRNA levels in fetal lungs. Ratios of E2 could be regulated by the placental 17βHSD1.

Le cycle de Krebs occupe une place centrale dans le métabolisme cellulaire et est le point de jonction de nombreuses voies essentielles. Depuis le début des années 2000, un lien a été démontré entre l’apparition de certains cancers et des mutations affectant des gènes codant pour des enzymes du cycle de Krebs, i.e., la succinate déshydrogénase, la fumarase ou les iso-enzymes 1 et 2 de l'isocitrate déshydrogénase (IDH). Les mutations des gènes IDH sont présentes dans 15 à 20 % des leucémies myéloïdes aigues (LAM) et jusqu'à 80 % dans certains gliomes. Ces mutations affectent le site actif des enzymes et elles induisent une néo-fonction enzymatique qui se traduit par la production et l'accumulation d'un oncométabolite : le stéréoisomère D du 2-hydroxyglutarate (D-2-HG) responsable de dérégulations énergétiques et épigénétiques au sein de la cellule. Afin de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu entre ces anomalies et la pathologie humaine, mon travail de thèse a impliqué le développement de différentes méthodes analytiques : - tout d'abord une méthode robuste de séparation et de quantification des stéréoisomères D et L par dérivation chirale du 2-HG, ceci en GC tandem MS, - également par GC tandem MS, des méthodes métabolomiques ciblées à haute spécificité pour l'analyse de plus de 120 composés d'intérêt clinique, - des méthodes analytiques à haute résolution et non-ciblées (masse exacte; n=360 composés) adaptées à l'étude de cellules, - et des méthodes d'étude de flux métaboliques sur culture cellulaire basées sur l'analyse des dérivés de traceurs marqués aux isotopes stables. Le développement de ces méthodes m'a permis d'obtenir les résultats suivants. J'ai démontré l'importance du D-2-HG comme marqueur de la présence de mutations IDH1/2 dans une large cohorte de patients leucémiques, à la fois pour le diagnostic et pour le suivi des patients sous traitement. Notre étude pilote a conduit à utiliser ce paramètre en pratique hospitalière courante dans le laboratoire de chimie analytique de l'institut Gustave Roussy (IGR; Villejuif). L'étude de profils métaboliques associés aux mutations affectant les enzymes IDH2 et succinate déshydrogénase nous a permis d'identifier des mécanismes compensatoires du dysfonctionnement du cycle de Krebs, par exemple la sur-activation de la pyruvate carboxylase. Nous avons par ailleurs montré que ces mécanismes ne sont que partiellement efficaces; ils pourraient ainsi servir de cibles thérapeutiques. Une mutation du gène IDH2 (R140Q) est retrouvée chez des patients atteint de LAM et chez des patients possédant une acidurie D-2-hydroxyglutarique, maladie héréditaire du métabolisme extrêmement rare. Un inhibiteur spécifique de l'enzyme IDH2 possédant la mutation R140Q est actuellement testé comme traitement dans un essai clinique à l'IGR pour les patients leucémiques. Nous avons étudié les effets de ce composé sur des fibroblastes de notre patient atteint d'acidurie D-2-hydroxyglutarique. Nous avons confirmé ses effets sur l'enzyme IDH et observé des effets secondaires sur le métabolisme des lipides et du cycle de Krebs, à la fois dans les fibroblastes témoin et du patient. Cet inhibiteur étant connu pour avoir des effets sur la différenciation cellulaire, nos résultats pourraient permettre d'expliquer les mécanismes impliqués. Ce travail a apporté de nouveaux outils pour l'exploration des maladies métaboliques traditionnelles ainsi que de certains types de cancers, et il met en avant de nouvelles illustrations de la puissance de l'approche métabolique pour identifier des points d'intervention et de surveillance thérapeutique personnalisée des patients ("théranostique"). / The Krebs cycle has a central role in cellular metabolism and is at the junction of many essential pathways. Since 2000, a link has been shown between the development of particular cancers and mutations affecting genes coding for several Krebs cycle enzymes, i.e., succinate dehydrogenase, fumarase or iso-enzymes 1 and 2 of the isocitrate dehydrogenase (IDH). The IDH mutations are found in 15 to 20 % of acute myeloid leukemias and up to 80% of specific gliomas. These mutations affect the enzyme active site and are responsible for an neomorphic activity that is the production and accumulation of a putative oncometabolite : the D stereoisomer of the 2-hydroxyglutarate (D-2-HG) which is linked to energetic and epigenetic deregulations in the cell. To better understand the mechanisms between these abnormalities and human pathology, my PhD work involved the development of different analytical tools : - First of all, a robust method of separation and quantification of the stereoisomers D and L by chiral derivatization of the 2-HG, in tandem mass spectrometry, - GC tandem MS was also used to develop targeted metabolomic methods with high specificity for the analysis of more than 120 compounds of clinical interest, - An analytical non-targeted method using high mass resolution (exact mass; n=360 compounds) adapted to the study of fibroblast cells, - and finally, methods for the study of metabolic flux in culture cell based on derivatives of stable labeled tracers. The development of these methods led to the following results. I highlight the importance of the D-2-HG as a biomarker of the presence of IDH1/2 mutations in a large cohort of leukemic patients, for the diagnostic and the follow-up of patients under treatment. Our pilot study was the starting point for routine usage of this test in the clinical setting at the Institut Gustave Roussy (IGR; Villejuif). The study of metabolic profiles related to the mutations affecting IDH enzymes and succinate dehydrogenase allowed us to identify compensatory mechanisms of the dysfunction of the Krebs cycle, notably, the overactivation of pyruvate carboxylase. Moreover, we have shown that because these mechanisms are only partially efficient; they have potential to provide therapeutic targets. An IDH2(R140Q) mutation is shared between patients with AML and patients with D-2-hydroxyglutaric aciduria, a very rare hereditary disease of the metabolism. A specific inhibitor of the IDH2 enzyme mutant for R140Q is currently used in a clinical trial at the IGR institute. We studied the effects of this compound in fibroblasts of our aciduria patient. We confirmed the expected effect in the IDH enzyme and also observed moderate off-target effects concerning the lipid and the Krebs cycle metabolism, both in control and patient fibroblasts. Because this inhibitor is known to have effects in the cellular differentiation, our results could explain the underlying mechanisms. This work provides new tools for the exploration of traditional inherited metabolic diseases, as well as particular cancers, and illustrates the power of the metabolic approach to identify therapeutic targets and for the personalized monitoring of patients ("theranostics").

Le cycle de Krebs occupe une place centrale dans le métabolisme cellulaire et est le point de jonction de nombreuses voies essentielles. Depuis le début des années 2000, un lien a été démontré entre l’apparition de certains cancers et des mutations affectant des gènes codant pour des enzymes du cycle de Krebs, i.e., la succinate déshydrogénase, la fumarase ou les iso-enzymes 1 et 2 de l'isocitrate déshydrogénase (IDH). Les mutations des gènes IDH sont présentes dans 15 à 20 % des leucémies myéloïdes aigues (LAM) et jusqu'à 80 % dans certains gliomes. Ces mutations affectent le site actif des enzymes et elles induisent une néo-fonction enzymatique qui se traduit par la production et l'accumulation d'un oncométabolite : le stéréoisomère D du 2-hydroxyglutarate (D-2-HG) responsable de dérégulations énergétiques et épigénétiques au sein de la cellule. Afin de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu entre ces anomalies et la pathologie humaine, mon travail de thèse a impliqué le développement de différentes méthodes analytiques : - tout d'abord une méthode robuste de séparation et de quantification des stéréoisomères D et L par dérivation chirale du 2-HG, ceci en GC tandem MS, - également par GC tandem MS, des méthodes métabolomiques ciblées à haute spécificité pour l'analyse de plus de 120 composés d'intérêt clinique, - des méthodes analytiques à haute résolution et non-ciblées (masse exacte; n=360 composés) adaptées à l'étude de cellules, - et des méthodes d'étude de flux métaboliques sur culture cellulaire basées sur l'analyse des dérivés de traceurs marqués aux isotopes stables. Le développement de ces méthodes m'a permis d'obtenir les résultats suivants. J'ai démontré l'importance du D-2-HG comme marqueur de la présence de mutations IDH1/2 dans une large cohorte de patients leucémiques, à la fois pour le diagnostic et pour le suivi des patients sous traitement. Notre étude pilote a conduit à utiliser ce paramètre en pratique hospitalière courante dans le laboratoire de chimie analytique de l'institut Gustave Roussy (IGR; Villejuif). L'étude de profils métaboliques associés aux mutations affectant les enzymes IDH2 et succinate déshydrogénase nous a permis d'identifier des mécanismes compensatoires du dysfonctionnement du cycle de Krebs, par exemple la sur-activation de la pyruvate carboxylase. Nous avons par ailleurs montré que ces mécanismes ne sont que partiellement efficaces; ils pourraient ainsi servir de cibles thérapeutiques. Une mutation du gène IDH2 (R140Q) est retrouvée chez des patients atteint de LAM et chez des patients possédant une acidurie D-2-hydroxyglutarique, maladie héréditaire du métabolisme extrêmement rare. Un inhibiteur spécifique de l'enzyme IDH2 possédant la mutation R140Q est actuellement testé comme traitement dans un essai clinique à l'IGR pour les patients leucémiques. Nous avons étudié les effets de ce composé sur des fibroblastes de notre patient atteint d'acidurie D-2-hydroxyglutarique. Nous avons confirmé ses effets sur l'enzyme IDH et observé des effets secondaires sur le métabolisme des lipides et du cycle de Krebs, à la fois dans les fibroblastes témoin et du patient. Cet inhibiteur étant connu pour avoir des effets sur la différenciation cellulaire, nos résultats pourraient permettre d'expliquer les mécanismes impliqués. Ce travail a apporté de nouveaux outils pour l'exploration des maladies métaboliques traditionnelles ainsi que de certains types de cancers, et il met en avant de nouvelles illustrations de la puissance de l'approche métabolique pour identifier des points d'intervention et de surveillance thérapeutique personnalisée des patients ("théranostique"). / The Krebs cycle has a central role in cellular metabolism and is at the junction of many essential pathways. Since 2000, a link has been shown between the development of particular cancers and mutations affecting genes coding for several Krebs cycle enzymes, i.e., succinate dehydrogenase, fumarase or iso-enzymes 1 and 2 of the isocitrate dehydrogenase (IDH). The IDH mutations are found in 15 to 20 % of acute myeloid leukemias and up to 80% of specific gliomas. These mutations affect the enzyme active site and are responsible for an neomorphic activity that is the production and accumulation of a putative oncometabolite : the D stereoisomer of the 2-hydroxyglutarate (D-2-HG) which is linked to energetic and epigenetic deregulations in the cell. To better understand the mechanisms between these abnormalities and human pathology, my PhD work involved the development of different analytical tools : - First of all, a robust method of separation and quantification of the stereoisomers D and L by chiral derivatization of the 2-HG, in tandem mass spectrometry, - GC tandem MS was also used to develop targeted metabolomic methods with high specificity for the analysis of more than 120 compounds of clinical interest, - An analytical non-targeted method using high mass resolution (exact mass; n=360 compounds) adapted to the study of fibroblast cells, - and finally, methods for the study of metabolic flux in culture cell based on derivatives of stable labeled tracers. The development of these methods led to the following results. I highlight the importance of the D-2-HG as a biomarker of the presence of IDH1/2 mutations in a large cohort of leukemic patients, for the diagnostic and the follow-up of patients under treatment. Our pilot study was the starting point for routine usage of this test in the clinical setting at the Institut Gustave Roussy (IGR; Villejuif). The study of metabolic profiles related to the mutations affecting IDH enzymes and succinate dehydrogenase allowed us to identify compensatory mechanisms of the dysfunction of the Krebs cycle, notably, the overactivation of pyruvate carboxylase. Moreover, we have shown that because these mechanisms are only partially efficient; they have potential to provide therapeutic targets. An IDH2(R140Q) mutation is shared between patients with AML and patients with D-2-hydroxyglutaric aciduria, a very rare hereditary disease of the metabolism. A specific inhibitor of the IDH2 enzyme mutant for R140Q is currently used in a clinical trial at the IGR institute. We studied the effects of this compound in fibroblasts of our aciduria patient. We confirmed the expected effect in the IDH enzyme and also observed moderate off-target effects concerning the lipid and the Krebs cycle metabolism, both in control and patient fibroblasts. Because this inhibitor is known to have effects in the cellular differentiation, our results could explain the underlying mechanisms. This work provides new tools for the exploration of traditional inherited metabolic diseases, as well as particular cancers, and illustrates the power of the metabolic approach to identify therapeutic targets and for the personalized monitoring of patients ("theranostics").

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Cette thèse décrit différentes stratégies pour co-immobiliser au sein d'un film sol-gel une déhydrogénase, le cofacteur NAD+/NADH et un système pour régénérer électrochimiquement ce cofacteur. L'immobilisation de la déshydrogénase dans la matrice sol-gel a été obtenue en utilisant un polyélectrolyte positivement chargé comme additif dans le sol de départ. Le film peut être déposé par les procédés d'évaporation ou d'électrogénération, permettant alors la fonctionnalisation d'électrodes d'or macroporeuses. La diaphorase a également pu être co-encapsulée pour la régénération du cofacteur NAD+. L'immobilisation du cofacteur a ensuite été obtenue par couplage chimique du NAD+ avec le groupement époxy du glycidoxypropylsilane avant formation du film. Plusieurs stratégies d'immobilisation du médiateur électrochimique ont alors été étudiées avec succès. Les espèces de type ferrocène ou des complexes d'osmium(III) peuvent être incorporées dans la matrice sol-gel par encapsulation de polymères portant ces médiateurs (Fc-PEI et polymère d'osmium) ou par co-condensation avec un ferrocène fonctionnalisé par un groupement silane. Finalement d'autres stratégies ont été étudiées basées sur la fonctionnalisation de nanotubes de carbone par un traitement micro-onde, par électropolymérisation du vert de méthylène, ou par recouvrement par un polymère de type acrylate portant des complexes d'osmium(III). L'électrogénération d'une couche mince sol-gel servant à immobiliser les protéines et le cofacteur à la surface des nanotubes fonctionnalisés par le polymère d'osmium(III) a alors permis d'observer une réponse électrocatalytique de stabilité remarquable. / In this thesis, the research work was focused on designing functional layers based on silica sol-gel thin films to co-immobilize dehydrogenase, cofactor and electron mediator to get the most highly active systems. Immobilization of dehydrogenase in an active form in a sol-gel matrix was obtained by using a positively-charged polyelectrolyte as additive in the starting sol. The optimal sol can be deposited by evaporation or by electrodeposition and was successfully deposited in macroporous electrodes. The immobilization of the cofactor was investigated by simple entrapment, adsorption to carbon nanotube (CNTs), encapsulation of NAD+ chemically attached to dextran(NAD-dextran), and by in-situ coupling with glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPS). The last approach allowed stable immobilization of the cofactor. Several mediators (Fc-PEI, Fc-Silane or Osmium polymer) were successfully co-immobilized with dehydrogenase and cofactor in the sol-gel matrix deposited by drop-coating. However, such co-immobilization did not operate in the electrogenerated sol-gel films. The strategies based on CNTs for mediator immobilization were finally developed. They include (1) micro-wave treatment (MWCNTs-µW), (2) electrochemical deposition of poly(methylene green) (MWCNTs-PMG), and (3) wrapping by osmium(III) polymer (MWCNTs-Os). MWCNTs-Os has been the only system that was successfully combined with sol-gel electrodeposition for co-immobilization of dehydrogenase and cofactor.

La réduction de l’expression de deux gènes codant pour la L-galactono-lactone-1,4-déshydrogénase (GalLDH) et de la GDP-D-mannose-3’,5’-épimérase (GME), enzymes de la voie de biosynthèse de l’ascorbate, a permis de mieux comprendre le rôle physiologique de ces enzymes chez la tomate. D’une part, l’étude de la GalLDH a mis en évidence la régulation complexe du métabolisme de l’ascorbate et la fonction essentielle de cette protéine au sein de la chaîne de transport des électrons au niveau mitochondrial. D’autre part, ce travail a révélé le rôle central de la GME à la fois pour la biosynthèse de l’ascorbate et la biosynthèse des polysaccharides pariétaux, notamment les mannanes et le rhamnogalacturonane II. Chez les plantes sous-exprimant la GME, nous avons pu noter l’incidence de perturbations de la structure pariétale sur les propriétés mécaniques des tiges et des fruits ainsi que sur la fécondation. Ces modifications ont notamment engendré une fragilité accrue des tiges et une stérilité partielle. La GME est donc déterminante pour la qualité nutritionnelle et organoleptique du fruit de tomate. Enfin, dans le cadre d’une approche de biologie intégrative, nos résultats associés aux données issues de plantes sous-exprimant des gènes codant pour des enzymes de la voie de recyclage de l’ascorbate chez la tomate ouvrent des perspectives originales pour l’approfondissement des connaissances sur la régulation et sur l’intégration du métabolisme de l’ascorbate dans le fonctionnement de la cellule. / Down-regulation of two genes encoding the L-galactono-1,4-lactone dehydrogenase (GalLDH) and the GDP-D-mannose-3',5'-epimerase (GME), enzymes of ascorbate biosynthesis pathway, led to a better understanding of the physiological role of these enzymes in tomato plants. On one hand, the study of GalLDH highlighted the complex regulation of ascorbate metabolism and the essential function of this protein in mitochondrial electron transport chain. Moreover, this work revealed the central role of the GME for both the ascorbate biosynthesis and the biosynthesis of cell wall polysaccharides, including mannans and rhamnogalacturonan II. In the GME-silenced plants, we found that modifications of the cell wall structure change the mechanical properties of stems and fruit as well as the fertilization. These changes led to an increase of stem fragility and to an increase of sterility. Therefore, GME plays a crucial role regarding the nutritional and organoleptic quality of tomato fruit. Finally, within the context of a systems biology approach, our results associated to datas obtained with plants silenced for recycling pathway related genes lead to the prospect to unravel the knowledges on the regulation and the integration of ascorbate metabolism in cell functions.