Deux familles d'aldéhyde déshydrogénases (ALDH) phylogénétiquement et structuralement distinctes catalysent l'oxydation des aldéhydes : les ALDH phosphorylantes et les ALDH non phosphorylantes. Ces enzymes jouent un rôle essentiel au niveau cellulaire en intervenant au niveau du métabolisme et dans des processus de détoxication. En 2003, la résolution de la structure tridimensionnelle de l'enzyme bifonctionnelle 4-hydroxy-2-cétovalérate aldolase/acétaldéhyde déshydrogénase (DmpFG) de Pseudomonas sp. CF600 a permis l'identification d'une nouvelle famille d'ALDH : la sous-unité DmpF étant structuralement apparentée aux ALDH phosphorylantes alors qu'elle présente une activité de type non phosphorylante CoA-dépendante. Par la caractérisation enzymatique et structurale des orthologues MhpEF issus d'Escherichia coli et de Thermomonospora curvata, nos travaux montrent que les paramètres cinétiques de MhpF ne dépendent pas de son état oligomérique, ce qui est cas unique pour les ALDH. De plus, la résolution des structures cristallographiques de l'enzyme complexée avec du NAD+ ou du CoA, couplée à la structure en solution de la forme apoenzyme obtenue par SAXS montrent que le Rossmann fold s'accomode de la présence des cofacteurs par un vaste changement conformationnel. Enfin, l'étude du mécanisme catalytique et la résolution de la structure thioacylenzyme permettent d'identifierla MhpF comme étant un hybride des deux familles d'ALDH caractérisées jusqu'à présent / Two phylogenetically and structurally unrelated families of NAD(P)-dependent aldehyde dehydrogenases (ALDH) catalyze the oxidation of aldehydes into activated or non-activated acids. These enzymes are known to be involved in many biological functions such as cellular differentiation, central metabolism, or detoxification pathways. The crystal structure of the bifunctional enzyme, 4-hydroxy-2-ketovalerate aldolase (DmpG)/acetaldehyde dehydrogenase (DpmF) from Pseudomonas sp. CF600, leads to the identification of a new ALDH family. The DmpF subunit exhibits a non-phosphorylating CoA-dependent aldehyde dehydrogenase activity while its structure belongs to the phosphorylating ALDH superfamily. The kinetics of the MhpEF orthologs from Escherichia coli and Thermomonospora curvata show that the kinetic parameters of MhpF do not depend of its oligomeric state, which is unique for an ALDH. In addition, the crystal structures of the enzyme with NAD+ or CoA, as well as the solution structure of the apoenzyme using SAXS, reveal the dynamics of the overall Rossmann fold between apo or cofactors-bound conformers, which is necessary to carry on the catalytic cycle. Finally, the catalytic mechanism and the structure of the thioacylenzyme intermediates indicate that MhpF is a hybrid between both ALDH families characterized to date

Le cycle de Krebs occupe une place centrale dans le métabolisme cellulaire et est le point de jonction de nombreuses voies essentielles. Depuis le début des années 2000, un lien a été démontré entre l’apparition de certains cancers et des mutations affectant des gènes codant pour des enzymes du cycle de Krebs, i.e., la succinate déshydrogénase, la fumarase ou les iso-enzymes 1 et 2 de l'isocitrate déshydrogénase (IDH). Les mutations des gènes IDH sont présentes dans 15 à 20 % des leucémies myéloïdes aigues (LAM) et jusqu'à 80 % dans certains gliomes. Ces mutations affectent le site actif des enzymes et elles induisent une néo-fonction enzymatique qui se traduit par la production et l'accumulation d'un oncométabolite : le stéréoisomère D du 2-hydroxyglutarate (D-2-HG) responsable de dérégulations énergétiques et épigénétiques au sein de la cellule. Afin de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu entre ces anomalies et la pathologie humaine, mon travail de thèse a impliqué le développement de différentes méthodes analytiques : - tout d'abord une méthode robuste de séparation et de quantification des stéréoisomères D et L par dérivation chirale du 2-HG, ceci en GC tandem MS, - également par GC tandem MS, des méthodes métabolomiques ciblées à haute spécificité pour l'analyse de plus de 120 composés d'intérêt clinique, - des méthodes analytiques à haute résolution et non-ciblées (masse exacte; n=360 composés) adaptées à l'étude de cellules, - et des méthodes d'étude de flux métaboliques sur culture cellulaire basées sur l'analyse des dérivés de traceurs marqués aux isotopes stables. Le développement de ces méthodes m'a permis d'obtenir les résultats suivants. J'ai démontré l'importance du D-2-HG comme marqueur de la présence de mutations IDH1/2 dans une large cohorte de patients leucémiques, à la fois pour le diagnostic et pour le suivi des patients sous traitement. Notre étude pilote a conduit à utiliser ce paramètre en pratique hospitalière courante dans le laboratoire de chimie analytique de l'institut Gustave Roussy (IGR; Villejuif). L'étude de profils métaboliques associés aux mutations affectant les enzymes IDH2 et succinate déshydrogénase nous a permis d'identifier des mécanismes compensatoires du dysfonctionnement du cycle de Krebs, par exemple la sur-activation de la pyruvate carboxylase. Nous avons par ailleurs montré que ces mécanismes ne sont que partiellement efficaces; ils pourraient ainsi servir de cibles thérapeutiques. Une mutation du gène IDH2 (R140Q) est retrouvée chez des patients atteint de LAM et chez des patients possédant une acidurie D-2-hydroxyglutarique, maladie héréditaire du métabolisme extrêmement rare. Un inhibiteur spécifique de l'enzyme IDH2 possédant la mutation R140Q est actuellement testé comme traitement dans un essai clinique à l'IGR pour les patients leucémiques. Nous avons étudié les effets de ce composé sur des fibroblastes de notre patient atteint d'acidurie D-2-hydroxyglutarique. Nous avons confirmé ses effets sur l'enzyme IDH et observé des effets secondaires sur le métabolisme des lipides et du cycle de Krebs, à la fois dans les fibroblastes témoin et du patient. Cet inhibiteur étant connu pour avoir des effets sur la différenciation cellulaire, nos résultats pourraient permettre d'expliquer les mécanismes impliqués. Ce travail a apporté de nouveaux outils pour l'exploration des maladies métaboliques traditionnelles ainsi que de certains types de cancers, et il met en avant de nouvelles illustrations de la puissance de l'approche métabolique pour identifier des points d'intervention et de surveillance thérapeutique personnalisée des patients ("théranostique"). / The Krebs cycle has a central role in cellular metabolism and is at the junction of many essential pathways. Since 2000, a link has been shown between the development of particular cancers and mutations affecting genes coding for several Krebs cycle enzymes, i.e., succinate dehydrogenase, fumarase or iso-enzymes 1 and 2 of the isocitrate dehydrogenase (IDH). The IDH mutations are found in 15 to 20 % of acute myeloid leukemias and up to 80% of specific gliomas. These mutations affect the enzyme active site and are responsible for an neomorphic activity that is the production and accumulation of a putative oncometabolite : the D stereoisomer of the 2-hydroxyglutarate (D-2-HG) which is linked to energetic and epigenetic deregulations in the cell. To better understand the mechanisms between these abnormalities and human pathology, my PhD work involved the development of different analytical tools : - First of all, a robust method of separation and quantification of the stereoisomers D and L by chiral derivatization of the 2-HG, in tandem mass spectrometry, - GC tandem MS was also used to develop targeted metabolomic methods with high specificity for the analysis of more than 120 compounds of clinical interest, - An analytical non-targeted method using high mass resolution (exact mass; n=360 compounds) adapted to the study of fibroblast cells, - and finally, methods for the study of metabolic flux in culture cell based on derivatives of stable labeled tracers. The development of these methods led to the following results. I highlight the importance of the D-2-HG as a biomarker of the presence of IDH1/2 mutations in a large cohort of leukemic patients, for the diagnostic and the follow-up of patients under treatment. Our pilot study was the starting point for routine usage of this test in the clinical setting at the Institut Gustave Roussy (IGR; Villejuif). The study of metabolic profiles related to the mutations affecting IDH enzymes and succinate dehydrogenase allowed us to identify compensatory mechanisms of the dysfunction of the Krebs cycle, notably, the overactivation of pyruvate carboxylase. Moreover, we have shown that because these mechanisms are only partially efficient; they have potential to provide therapeutic targets. An IDH2(R140Q) mutation is shared between patients with AML and patients with D-2-hydroxyglutaric aciduria, a very rare hereditary disease of the metabolism. A specific inhibitor of the IDH2 enzyme mutant for R140Q is currently used in a clinical trial at the IGR institute. We studied the effects of this compound in fibroblasts of our aciduria patient. We confirmed the expected effect in the IDH enzyme and also observed moderate off-target effects concerning the lipid and the Krebs cycle metabolism, both in control and patient fibroblasts. Because this inhibitor is known to have effects in the cellular differentiation, our results could explain the underlying mechanisms. This work provides new tools for the exploration of traditional inherited metabolic diseases, as well as particular cancers, and illustrates the power of the metabolic approach to identify therapeutic targets and for the personalized monitoring of patients ("theranostics").

Depuis que Parsons et col. ont découvert en 2008 que le gène de l’isocitrate déhydrogénase 1 (IDH1) est fréquemment muté dans les glioblastomes (12%), de nombreuses équipes ont étudié la prévalence et les caractéristiques des mutations des gènes IDH1 et 2 dans les gliomes.Les mutations du gène IDH1 sont observées dans environ 40% des gliomes. La mutation d’IDH1 la plus fréquentes dans les gliomes (>90% des cas) est la mutation R132H. La fréquence des mutations IDH1 et 2 est inversement corrélée au grade des gliomes (grade II ~80%, III ~50%, and IV ~10%). Les mutations IDH1/2 ont une valeur diagnostique ainsi que pronostique (associées à une meilleure survie). Pendant ce travail de thèse nous avons dans une première partie analysé la distribution de ces mutations IDH1/2 dans les différents gliomes, leur association avec d’autres altérations génétiques, ainsi que leur valeur diagnostique et pronostique dans une cohorte de 1332 patients atteints de gliomes. Nous confirmons sur cette très grande cohorte les données de la littérature et affinons la valeur pronostique des mutations IDH1/2. Dans une seconde partie, nous avons mis en évidence dans les gliomes un polymorphisme (SNP) du gène IDH1 (SNP rs 11554137; C (cytosine) substituted by T (thymin)) précédemment observé dans les leucémies myéloïdes aigues. Ce SNP, codon 105, est localisé dans le même exon que le codon 132 fréquemment muté, et nous avons montré qu’il est associé à une moins bonne survie des patients atteints de gliomes. Les mutations du codon 132 causent une baisse de l’activité enzymatique normale d’IDH1/2 qui est remplacé par le gain d’une nouvelle. Les protéines IDH1/2 mutés, au lieu de produire de l’alpha-cétoglutarate de façon NADP dépendante, réduisent de façon NADPH dépendante l’alpha-cétoglutarate en 2-hydroxyglutarate (2HG). Une forte concentration de 2HG et une baisse de la quantité de NADPH peuvent sensibiliser les tumeurs au stress oxidatif et donc potentialiser l’effet de la radiothérapie, ce qui pourrait expliquer la meilleure survie de ces patients. Nous avons donc dans une troisième partie étudié in vitro l’impact de la mutation IDH1R132H sur la survie après radiothérapie de cellules tumorales exprimant de façon stable ce gène muté. Les résultats obtenus montrent que dans certaines conditions ces cellules pourraient être plus radiosensibles que les mêmes cellules exprimant le gène IDH1 non-muté.Dans ce travail de thèse, nous avons donc étudié le gène IDH1 dans les gliomes de patients et tenté par une approche fonctionnelle in vitro d’évaluer l’impact de la mutation IDH1R132H sur la radiosensibilité des cellules tumorales. / Since Parsons et al. (2008) found the frequent mutations of IDH1 (12%) in GBMs, various reports have studied the prevalence and characteristic of IDH1 and IDH2 mutations.The mutations in the isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) gene occur in nearly 40% of gliomas. The frequency of IDH1 mutations are inversely connected with grade II (~80%), III (~50%), and IV (~ 10%) gliomas. Importantly, the status of IDH1 mutations is associated with a better outcome and demonstrated a diagnostic value. We analyzed also these mutations in distribution, association with tumor-derived other genetic alterations and the diagnostic and prognostic value in a cohort of 1332 glioma patients.A synonymous single nucleotide polymorphism [SNP rs 11554137; C (cytosine) substituted by T (thymin)] has been studied in gliomas patients. The SNP rs 11554137 (in codon 105) are located in the same exon with the IDH1 R132 mutations (in codon 132). And gliomas patients with SNP rs 11554137: C>T had a poorer outcome than patients without SNP rs 11554137. This was observed a similarly adverse effect in survival in patients with AML. Mutations in codon 132 can cause a decrease of IDH1/2 activity and also gain a new enzyme function for the NADPH dependent reduction of alpha-ketoglutarate to 2-hydroxyglutarate. High 2HG and low NADPH levels might sensitize tumors to oxidative stress, potentiating response to radiotherapy, and may account for the prolonged survival of patients harboring the mutations. So we studied further the alterations of function in IDH1R132H mutant cells in vitro. Based on the decrease of defence and the increase of impairing factors in tumor cells, we found that the tumors harbouring IDH1 mutations may have an elevated radiosensitivity. In the present study, we described the impact of IDH1 mutations in gliomas and search for new perspectives for the treatment strategy.

Depuis quelques années, de plus en plus de personnes reçoivent un diagnostic pour des maladies prolifératives induites par des hormones estrogéniques. On dénombre parmi eux de nombreux cancers, tel que le cancer du sein, mais également une maladie comme l’endométriose. Même si les thérapies couramment utilisées sont plus efficaces, plusieurs problèmes persistent dont : la résistance aux médicaments ainsi que les effets indésirables liés au manque d’efficacités et au caractère destructif de plusieurs de ces traitements. Il est donc essentiel de développer de nouvelle alternative au traitement pour offrir des options thérapeutiques plus sélectives et plus efficaces au traitement actuel de ces maladies. L’hormonothérapie représente une avenue intéressante, puisqu’elle pourrait ralentir, voir bloquer la progression de ces maladies en limitant certains effets secondaires liés aux traitements actuellement utilisés. En fait, l’enzyme 17β- hydroxystéroïde déshydrogénase type 1 (17β-HSD1) est une cible clé pour ce type de traitement, puisqu’elle régule la formation de l’estradiol, l’estrogène le plus puissant. Ainsi, une inhibition de cette enzyme diminuerait les niveaux d’hormones estrogéniques intracrines qui lient et activent les récepteurs des estrogènes. En se basant sur plusieurs travaux effectués dans ce domaine, plusieurs dérivés stéroïdiens ont été synthétisés dans le but d’obtenir de puissants inhibiteurs pour l’enzyme 17β-HSD1. Dans un premier temps, on compte de nombreux dérivés benzyles fonctionnalisés qui furent ajoutés au niveau du carbone 16 du noyau stéroïdien. Ces modifications ont permis d’obtenir une série d’analogues de notre composé de tête (PBRM). Ensuite, un groupe oxirane fut ajouté en position 3 afin d’en évaluer l’activité par rapport à l’inhibiteur PBRM. Les travaux réalisés ont permis d’approfondir et de découvrir des informations cruciales sur l’inhibition de l’enzyme. Quelques composés synthétisés ont permis d’obtenir des activités inhibitrices intéressantes qui serviront de point de départ lors de futurs travaux. Ces découvertes permettront de mieux cibler certaines fonctionnalisations utiles pour la conception d’inhibiteurs permettant de traiter certaines maladies sensibles aux estrogènes. / For the last few years, there has been an increase in the number of people who receives a diagnosis of estrogenic proliferation induced disease. Among them, there are breast cancers and endometriosis. Although commonly used therapies are effective, several problems persist, including the development of drug resistance, adverse effects associated with the lack of efficacy and destructiveness of these therapies. It is therefore essential to develop alternative treatments to provide more selective and effective therapies. Hormone therapy is an interesting avenue because it could slow down or block the progression of diseases by limiting some of the side effects associated with the current treatments. In fact, the enzyme 17β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 (17β-HSD1) is a key target for this purpose, since it regulates the formation of the more potent estrogen, estradiol. Thus, inhibition of this enzyme would decrease the levels of intracrine estrogens that bind and activate the estrogen receptors. Based on several studies in this field, several steroidal derivatives have been synthesized in order to provide a potent inhibitor for 17β- HSD1. First of all, numerous functionalized C16-benzyl estrane derivatives were synthesized. These modifications allowed obtaining a series of analogs of our leading 17β-HSD1 inhibitor (PBRM). Then, an oxirane group was added in position 3 of the steroid backbone to evaluate its activity compare to the inhibitor PBRM. The work achieved allowed to increase and discover crucial information on the enzyme. Some synthesized compounds have revealed interesting inhibitory activity, which will serve as a starting point for future work. All the discoveries will provide a better targeting of certains functionalizations in the development of estrogen-sensitive disease treatment.

Très appréciés des consommateurs du fait de leur qualité nutritionnelle, les produits de la mer jouent un rôle important dans l'alimentation humaine. Toutefois, la confiance du consommateur vis-à-vis de leur qualité est affectée par les riques associés à une exposition aux contaminants chimiques et à la fraîcheur des produits. Si le premier aspect résulte de la pollution des eaux marines sous l'effet d'une forte anthropisation des littoraux, le second est lié à la haute périssabilité de ces produits. Évaluer les niveaux de contamination chimique et la qualité-fraîcheur des produits de la mer est plus qu'un besoin : c'est aujourd'hui une nécéssité. C'est dans ce contexte que les travaux de cette thèse ont été menés. Deux objectifs principaux ont été visés dans la présente étude. Le premier objectif de ce travail était de faire une évaluation spatiale et saisonnière des niveaux de contamination par les polluants métalliques et organiques (HAPs et PCBs) des zones côtières du Sénégal en s'intéressant aux teneurs en contaminants dans les organismes marins. Nous avons étudié 7 espèces marines représentatives des différents maillons de la chaîne trophique (une macroalgue verte, un mollusque bivalve, un crustacé et 4 espèces de poisson) prélevées le long du littoral au niveau de 5 sites présentant des degrés d'anthropisation différents. Les résultats de cette étude montrent que les teneurs en contaminants chimiques des organismes marins sont variables selon les espèces et soulignent ainsi la nécéssité de l'approche multi-espèces pour l'étude de la contamination chimique du milieu. Des variations inter-sites de la teneur en contaminants chimiques dans les organismes ont été mis en évidence. Les sites les plus anthropisés comme Soubédioune et Rusfisque sont ceux qui présentent les teneurs les plus élevées. Les niveaux de contamination métalliques et organiques dans les organismes marins du littoral sénégalais sont inférieurs ou du même ordre de grandeur que ceux mesurés dans d'autres régions d'Afrique de l'Ouest ou dans d'autres régions du monde. L'évaluation des risques associés à l'ingestion des produits de la mer analysés montre que les teneurs en contaminants chimiques sont faibles et inférieures aux limites maximales admissibles pour la consommation humaine (norme EU). Seuls les sites de Rufisque et Soumbédioune présentent quelques dépassements chez certaines espèces (moules, sardinelles). Le deuxième objectif de cette étude était de développer des méthodes permettant d'évaluer la fraîcheur des filets de poisson et de différencier des filets frais des filets décongelés. Les méthodes retenues sont basées sur la mesure de l'augmentation de la perméabilité cellulaire du muscle de poisson. La conservation des filets de poisson à 4°C va conduire à une perméabilisation des cellules dans le temps qui peut être apréhendée par la mesure de la libération d'enzymes intracytoplasmiques ou par l'augmentation de la perméabilité des cellules à des colorants fluorescents. La mesure de l'activité LDH est intéressante à double titre : elle va permettre d'une part de mesure le niveau de lyse cellulaire, donc le niveau d'altération, des filets de poisson dans le temps. Elle va permettre d'autre part grâce à sa sensibilité à la congélation de mieux cerner les conditions qui permettraient à terme de faire la distinction entre les filets frais et des filets congelés/décongelés. / Much appreciated by consumers for its nutritional qualities, seafood plays an important role in human diet. Consumer confidence in the quality of these foodstuffs is nevertheless affected by concerns about risks associated with exposure to chemical contaminants and the freshness of these products. If the first of these is the result of pollution resulting from increasing human activities along coastlines, the second is linked to the highly perishable nature of these products. An evaluation of the levels of chemical contaminants in seafood and of its freshness is therefore a necessity. It is within this context that the work presented in this thesis was carried out. Two principal objectives were targeted in the present study. The first objective of this work was to evaluate the spatial and seasonal variability of seafood contamination by elements (including metals) and organic pollutants (PAHs and PCBs) along the Senegalese coast. We studied 7 marine species representative of different trophic level (a green macro algae, a bivalve mollusc, a crustacean and 4 species of fish) sampling them along the coastline at 5 sites representing different human activity pressur. The result of this study showed that contamination levels varied with species, underlining the importance of a multi-species approach to study contamination in the marine environment. Variations between sites were also observed. Sites with the greatest human activity, such as Soumbédioune and Rufisque, were also those where the highest levels of contaminants in seafood were found. The levels of contamination measured along the Senegalese coast, of both elements and organic pollutants, were inferior or of the same order of magnitude as those reported from other West African sites or from other regions of the globe. The risks associated with eating theseseafood products were low, with contaminant levels generally below the admissible limits (EU) for human consumption. Only a few samples of certain species (mussels, sardines) exceeded these limits at Soumbédioune and Rufisque. The second objective of this study was to develop methods to evaluate the freshness of fish fillets, and to distinguish fresh fillets from previously frozen ones. The methods developed were based upon a measure of cellular permeability within the fish muscle tissue. The conservation of fish fillets ar 4°C results in increased permeability of cells over time, measurable by studying the liberation of intra-cytoplasmic enzymes or the increasing permeability of cells to fluorescent colouring agents. The measurements of lactate dehydrogenase (LDH) is doubly interesting in this contex : on the one hand it enables a measure of cell lysis, and so the level of alteration of the fillets over time, to be established. It also, thanks to its sensitivity to freezing, to better distinguish fresh fillets from those that have been frozen then thawed.

Les déshydrogénases sont faiblement actives en présence de fortes concentrations (> 50 % (v/v)) de liquides ioniques (LIs) miscible à l’eau et les raisons précises de cette inactivation ne sont pas connues. La structure de la formiate déshydrogénase de Candida boidinii (FDH) en présence de ces LIs miscibles à l’eau a été étudiée par atténuation de fluorescence par de l’iode ou de l’acrylamide. Une concentration critique, la CILc ("Critical Ionic Liquid concentration"), au dessus de laquelle la fluorescence n’est pas exploitable, est déterminée. Elle se situe entre 30 et 40 % (v/v) des LIs de cette étude. Les LIs s’avèrent être de forts agents dénaturants : les constantes d’atténuation de fluorescence en présence de LI sont de 1,4 à 2 fois plus importantes qu’en présence d’urée. La FDH a été modifiée chimiquement par des cations analogues aux cations des LIs afin de la préserver de l’interaction avec les LIs. Les enzymes modifiées par des cations de plus petite taille présentent une importante activité résiduelle (30-45%) en présence de 70% (v/v) de LI tandis que l’enzyme sauvage est inactive. En présence de 30% (v/v) de LI, l’efficacité catalytique (kcat/KM) des enzymes modifiées augmente de 1,3 à 3,6 fois et la constante de Michaelis (KM) diminue de 1,7 à 4,6 fois suivant le cation utilisé. Selon la taille du cation greffé, le temps de demi-vie des enzymes modifiées augmente de 3 à 5 fois en solution tamponnée. Enfin, la structure des enzymes modifiées est préservée en présence de 40% (v/v) de LI tandis que l’enzyme native commence à se dénaturer. La technique d’évolution dirigée a également été utilisée. A ce jour, 987 mutants ont été criblés. Un mutant (M60) présente une activité résiduelle de 35% à 70% (v/v) de LI tandis que l’enzyme sauvage est inactive. Ce dernier porte deux mutations, N187S et T321S, situées à la surface de la structure protéique. En présence de 30 % (v/v) de LI, le mutant 60 fixe les substrats avec des valeurs de de KMNAD et de KDN3 (N3 est l’azide, un inhibiteur compétitif du formiate) 2 fois plus faibles que celles de l’enzyme sauvage. / The dehydrogenases are weakly active in the presence of high concentration (> 50% (v/v)) of water-miscible ionic liquids (ILs) and the mechanism of enzyme inactivation in ILs is not fully understood. The structure of the formate dehydrogenase Candida boidinii (FDH) in ILs has been studied by quenching of fluorescence experiments in the presence of iodide or acrylamide. A critical concentration, the CILc (“Critical Ionic liquid concentration"), is defined as the concentration of IL above which the fluorescence is not relevant. In this work, the CILc is comprised between 30 and 40 % (v/v) of the ILs. The ILs have revealed to be denaturing agents which increase the quenching of fluorescence efficiency by 1.4 to 2 times more than in urea. The FDH is chemically modified by analogous cations found in ILs in order to preserve the biocatalyst from the direct interaction with ILs. The enzymes modified by the smaller cations shown 30 45% residual activity at 70% (v/v) of ILs while the native enzyme is fully inactive. In the presence of 30% (v/v) of ILs, the kinetic efficiency (kcat/KM) of the grafted enzymes is improved by a 1.3-3.6 fold factor and the constant of Michaelis (KM) is reduced by a 1.7-4.6 fold factor depending on the grafted cations. In aqueous solution, the half-lives of modified enzymes are 3 to 5 fold higher than the native FDH depending on the size of the cation grafted. Finally, the structure of the grafted enzymes is somehow maintained in the presence of 40% (v/v) of ILs while the native FDH begins to unfold. We also used directed evolution to improve the FDH activity in the presence of ILs. At this stage, 987 mutants have been screened and one mutant (M60) shows 35% of residual activity at 70% (v/v) of ILs. In the presence of 30% (v/v) of ILs, the mutant binds the substrates in a greater extent than the native FDH, the values of KMNAD and the KDN3 (N3 is the azide, a competitive inhibitor of formate) are reduced by a 2 fold factor by comparison to the native enzyme.

Les systèmes bioélectroniques tels que les biopiles enzymatiques nécessitant souvent l'utilisation des assemblages moléculaires complexes comprenant le cofacteur de l'enzyme, des agents de couplage et des médiateurs électrochimiques. Afin de les simplifier, nous avons remplacé ces différents partenaires par 13 analogues simples à synthétiser après identification par criblage in silico. Le noyau aromatique est couplé à un noyau aromatique et puis un médiateur électrochimique est couplé à celui-ci. Les produits sont des poudres de couleurs variées (rose, rouge). Le rendement de la première étape est de 83% avec une pureté d'environ 92%. Le rendement de la seconde étape est compris entre 45% et 65% avec une pureté de 97%. Ces analogues ont été caractérisés chimiquement (RMN, spectrométrie de masse) et électrochimiquement (voltammétrie cyclique et spectroélectrochimie). Les activités de deux enzymes, la formiate déshydrogénase (FDH) et l'alcool déshydrogénase de foie de cheval (HLADH), et d'un catalyseur organométallique, le [Cp*Rh(bpy)(H2O)]2+, ont été évaluées avec ces analogues. De faibles activités ont été observées en présence de l'HLADH avec 4 analogues et en présence de la FDH avec un seul analogue. Au contraire aux enzymes, la réduction d'un médiateur a pu été confirmée en présence du catalyseur [Cp*Rh(bpy)(H2O)]2+ par voltammétrie cyclique. La FDH native n'est pas adaptée à fonctionner avec ces nouveaux substrats solubles dans un LI, le [MMIm][Me2PO4]. Une FDH tolérante (N187S/T321S) au [MMIm][Me2PO4] précédemment obtenue par évolution dirigée a été donc étudiée en isolant les simples mutants N187S et T321S. Le double mutant N187S/T321S et le simple mutant N187S sont 4 fois plus actifs en solution aqueuse et en présence de LI. Des analyses par spectroscopie de fluorescence ont montré que la simple mutation N187S favorise la stabilité du dimère de FDH en modifiant le pKa de l'acide aminé E163. Celui-ci est impliqué dans la thermostabilité et la tolérance des FDHs aux LIs / Bioelectrical systems, such as enzymatic biofuel cells, often require a molecular construction complex comprising the enzyme cofactor, intermediary molecules and electrochemical mediators. In order to simplify them, we have replaced these different partners by 13 analogs that are simple to synthesize after identification by screening in silico. The nicotinamide ring is coupled to an aromatic moiety and an electrochemical mediator is then coupled to it as well, resulting in various colored powders (pink, red). The first step' s yield is around 83% with a purity of approximately 92%. The second step's yield is comprised between 45% and 65% with a purity of 97%. The analogs were characterized chemically (NMR, mass spectrometry) and electrochemically (cyclic voltammetry, spectroelectrochemistry). The activities of two enzymes, the formate dehydrogenase (FDH) and the horse liver alcohol dehydrogenase (HLADH), and an organometallic catalyst, [Cp*Rh(bpy)H2O]2+, were evaluated with these analogs. Weak activities were observed for 4 analogs using the HLADH and 1 analog using the FDH. Unlike the enzymes, the reduction of a conjugated mediator was confirmed with the catalyst [Cp*Rh(bpy)H2O]2+ using cyclic voltammetry. The wild type FDH is not adapted to function with these new substrates, which can be solubilized in an IL such as [MMIm][Me2PO4]. An FDH (N187S/T321S) shown to be tolerant to [MMIm][Me2PO4], and obtained previously by directed evolution, was studied by isolating the two single mutants, N187S and T321S. The double mutant N187S/T321S and the mutant N187S are 4 times more active in aqueous solution and in [MMIm][Me2PO4]. Fluorescence spectroscopy analyses showed that the single mutation N187S favorises FDH dimer stability by modifying the pKa of the amino acid E163. The latter is involved in FDH thermal stability and tolerance in ILs

Chez les plantes supérieures, les membranes thylacoïdiennes des chloroplastes contiennent des protéines de type respiratoire, un complexe NADH déshydrogénase (Ndh) homologue au complexe I bactérien et une oxydase (PTOX) homologue à l'oxydase alternative des mitochondries. Dans le but d'élucider la fonction du complexe Ndh, le gène chloroplastique ndhB a été inactivé par transformation chloroplastique du tabac. Chez les plantes transplastomiques obtenues, des mesures de fluorescence de la chlorophylle ont permis de démontrer que ce complexe est impliqué dans la réduction non photochimique du pool de plastoquinones (PQ). Chez les mutants dépourvus de complexe Ndh, un retard de croissance ainsi qu'une altération des capacités photosynthétiques ont été observés dans des conditions où la photorespiration est stimulée par une limitation de la disponibilité en CO2 (par exemple un déficit hydrique modéré). En étudiant les effets de l'antimycine A, un inhibiteur du transfert cyclique des électrons autour du PS I, sur l'activité photosynthétique de ces plantes, nous avons conclu que le complexe Ndh est impliqué dans une voie de transfert cyclique et participe à la fourniture en ATP nécessaire à la fixation de CO2 quand la demande est forte. <br />Afin de déterminer le rôle de PTOX, nous avons généré des plantes de tabac surexprimant cette protéine. Des mesures de fluorescence de la chlorophylle nous ont permis de démontrer l'implication de PTOX dans l'oxydation non photochimique du pool de PQ. Nous avons conclu que le complexe Ndh et PTOX, tous deux localisés dans les thylacoïdes lamellaires, constituent avec le pool de plastoquinones les éléments d'une chaîne de transfert d'électrons de type chlororespiratoire. Nous avons proposé un mécanisme par lequel l'activité du transfert cyclique des électrons autour du PS I serait régulée par l'activité de la chlororespiration, à travers un contrôle fin du niveau rédox de certains transporteurs de la chaîne de transfert d'électrons.

La cellule est un milieu très concentré où les interactions entre macromolécules, même faibles, jouent un grand rôle dans leur solubilité et dans l'assemblage des complexes labiles assurant les fonctions biologiques. Les interactions faibles entre protéines déterminant la non-idéalité de leurs solutions vont aussi gouverner leur cristallisation.<br />Dans quelle mesure les interactions protéine – solvant influencent-elles les interactions protéine – protéine ? Nous avons mis en relation ces deux types d'interactions pour la malate déshydrogénase (Hm MalDH) de Haloarcula marismortui, protéine halophile très acide qui a des solvatations variées et très riches en eau et en sel.<br />Nous avons développé une nouvelle méthode de détermination du second coefficient du viriel A2 par la modélisation des profils de vitesse de sédimentation en ultracentrifugation analytique, qui permet l'étude de solvants complexes.<br />Les interactions protéine – protéine de la Hm MalDH en divers sels ont été caractérisées par diffusion de neutrons ou de rayons X aux petits angles. Les A2 et les facteurs de structure en solution ont été modélisés par des potentiels d'interaction de type DLVO. Les interactions répulsives sont principalement dues au terme de volume exclu et dans une moindre mesure au terme électrostatique. Les interactions attractives sont qualitativement corrélées à des valeurs positives ou négatives des paramètres d'interaction préférentielle avec le sel. Ces résultats permettent d'expliquer l'adaptation moléculaire des protéines halophiles qui doivent ainsi avoir une solvatation riche en sel pour rester soluble à haut sel.<br />La cristallisation par dilution de la Hm MalDH dans des mélanges sel – MPD (méthyl-2-pentanediol-2,4) résulte d'une lente évolution des interactions protéine – protéine, de répulsives à modérément attractives. Le MPD modifie les interactions protéine – protéine en divers sels en ajoutant une attraction qui est liée à la répulsion du MPD par les charges de la protéine.

La récente définition de Brachypodium distachyon comme modèle des graminées en fait un organisme de choix pour l'étude de leur paroi cellulaire, en particulier dans le cadre de leur utilisation comme matière première renouvelable pour le bioéthanol de seconde génération. Les lignines, dont les trois unités (H, G et S) proviennent de la polymérisation des monolignols, sont associées aux acides hydroxycinnamiques dans la paroi des céréales et représentent l'obstacle majeur à l'exploitation industrielle de la biomasse lignocellulosique. L'acquisition de connaissances sur les mécanismes dirigeant leur mise en place et leur organisation permettrait d'identifier des facteurs modulant les rendements de production qui y sont associés. Quatre familles de gènes ont été étudiées et l'implication dans la voie de biosynthèse des monolignols de trois gènes a été montrée : BdF5H2 possède une activité férulate-5-hydroxylase permettant la synthèse des précurseurs des unités S des lignines, BdCOMT3 est l'isoforme principale des acide cafféique O-Méthyltransférases et sa perte partielle de fonction cause une diminution de la quantité de lignine, la modification du rapport S/G et une baisse de quantité d'acide p-coumarique dans deux lignées mutantes indépendantes. Enfin, BdCAD1 est l'isoforme principale des alcools cinnamylique déshydrogénases : sa perte de fonction dans deux lignées indépendantes cause la diminution de la quantité globale de lignine et d'acide p-coumarique, une baisse du rapport S/G ainsi que l'accumulation de sinapaldéhyde. Par ailleurs ces deux lignées présentent des rendements de saccharification augmentés de plus d'un quart par rapport au sauvage.