Les triacylglycérols d'algues (TAG) représentent une source prometteuse de biocarburants. Les principales étapes de la synthèse des acides gras et du métabolisme du TAG des algues ont été déduites de celles des plantes terrestres, mais on en sait peu sur les sources de carbones et d’énergie intervenant dans la synthèse de lipides de réserve. Nous avons donc étudié la synthèse des acides gras chez l’algue modèle Chlamydomonas reinhardtii en utilisant une combinaison d'approches génétiques, biochimiques et microscopiques. Plus précisément, j'ai d'abord examiné la localisation subcellulaire de gouttelettes de lipides dans des cellules d'algues exposées à une forte lumière, conditions où une plus grande quantité de pouvoir réducteur est produite. J'ai ensuite contribué à mettre en évidence que la bêta-oxydation des acides gras est un processus peroxysomal, et que pendant une carence en azote réalisée en conditions photoautotrophe, des mutants dépourvus de la malate déshydrogénase 2 peroxysomale (mdh2) accumulent 50% plus TAG que les souches parentales. Ces résultats nous ont permis de mettre en évidence l'importance du contexte redox cellulaire sur la synthèse lipidique. Cette étude a également permis de révéler l’existence d'un échange d’énergie entre le peroxysome et le chloroplaste. Enfin, en caractérisant des mutants déficients dans la dégradation des acides aminés à chaîne ramifiée (BCAA), j'ai montré que le catabolisme des BCAAs joue un double rôle dans la synthèse de TAG en fournissant des précurseurs carbonés et de l'ATP. L'ensemble de ces travaux ouvert de nouvelles pistes pour l'amélioration génétique future de souches d'algues pour la production de biocarburants. / Algal triacylglycerols (TAG) represent a promising source for biofuel. The major steps for fatty acid synthesis and TAG metabolism have been deduced based on that of land plants, but little is known about carbon and energy sources. To address this question, we investigated fatty acid synthesis in algal cells using a combination of genetic, biochemical and microscopic approaches in the model microalga Chlamydomonas reinhardtii. Specifically, I first examined subcellular localization of lipid droplets in algal cells exposed to high light, a condition favoring production of reducing power. Secondly, I contributed to put on evidence that the beta-oxidation of fatty acids is a peroxisomal process, and that during photoautotrophic nitrogen starvation, knock-out mutants of the peroxisomal malate dehydrogenase 2 (mdh2) made 50% more TAG than parental strains, highlighting the importance of cellular redox context on lipid synthesis. This study also revealed for the first time the occurrence of an energy trafficking pathway from peroxisome to chloroplast. And finally, by characterizing mutants defected in degradation of branched-chain amino acids (BCAAs), I showed that BCAA catabolism plays a dual role in TAG synthesis via providing carbon precursors and ATP. Taken together, this work highlighted the complex interplay between carbon and energy metabolism in green photosynthetic cells, and pointed future directions for genetic improvement of algal strains for biofuel productions.

Une attention croissante est portée aux cascades multi enzymatiques pour l’élaboration de procédés de synthèse plus efficaces. Cependant, le contrôle de l’expression hétérologue de plusieurs gènes dans un même hôte s’avère difficile et peut mener à un déséquilibre du flux réactionnel. Pour exploiter au mieux les avantages d’une cascade in vivo, il est nécessaire d’ajuster les activités de chaque étape, et de construire des catalyseurs cellulaires capables de programmer la stœchiométrie des enzymes. Nous avons développé dans ce projet une approche originale pour moduler le ratio de deux enzymes in cellulo en jouant sur le nombre de copies de plasmides par cellule (PCN). Nous avons choisi comme modèle un système autosuffisant associant une Alcool Déshydrogénase (ADH) et une Baeyer-Villiger MonoOxygenase (BVMO), NADP(H)-dépendantes. Plusieurs plasmides recombinants portant les deux gènes ont été conçus et combinés dans E. coli. Les souches de co-expression construites ont été comparées en termes de PCN, de production d’enzymes et d’activité. Nous avons montré l’importance d’un choix judicieux de la combinaison de plasmides ainsi que l’existence d’une corrélation entre ratios d’enzymes et activité. Nos biocatalyseurs s’étendent sur une gamme allant du système inactif à un système affichant un TTN d’environ 6000. Ce système a permis la synthèse de lactones d’intérêt industriel, la dihydrocoumarine et la caprolactone, à partir d’indanol et de cyclohexanol. Enfin, sur ce modèle de combinaison de plasmides, trois nouveaux biocatalyseurs cellulaires, associant l’ADH à diverses BVMOs, ont été créés afin d’élargir la gamme d’esters et de lactones synthétisables à partir d’alcools. / Growing attention is paid to multienzymatic cascades to develop more efficient synthetic processes. However, in in cellulo process, the control of the simultaneous heterologous expression of several genes in the same host is often difficult and can lead to imbalances in the reaction flow. To exploit the benefits of cascades, activities of each step have to be adjusted and thus, cellular biocatalysts capable of programming enzymes stoichiometry have to be constructed. In this work, to modulate the stoichiometry of two enzymes in vivo, we developed an original approach based on the copy number per cell of plasmids (PCN) used as vectors. The PCN is regulated in bacteria by three main mechanisms leading, according to the replicon, to low, medium or high PCN. As proof of concept, we chose a self-sufficient system combining an Alcohol Dehydrogenase (ADH) and a Baeyer-Villiger MonoOxygenase (BVMO), both NADP(H)-dependent. Several recombinant plasmids harboring both genes were designed and combined in E. coli. Coexpression strains constructed were compared in terms of PCN, enzyme production and activity. We showed the importance of a judicious choice of plasmids combination and the existence of a correlation between enzymes ratios and activity. Our biocatalysts ranged from an inactive system to a system with a TTN of about 6000. This system allowed the synthesis of lactones of industrial interest, dihydrocoumarin and caprolactone, via double oxidation of indanol and cyclohexanol. Finally, based on this plasmids combination model, three new cellular biocatalysts combining ADH with various BVMOs were designed to broaden the range of esters and lactones synthesizable from alcohols.

Le rôle important joué par la mitochondrie dans la cellule eucaryote est admis depuis longtemps. Cependant, la composition exacte des mitochondries, ainsi que les processus biologiques qui sy déroulent restent encore largement inconnus. Deux facteurs principaux permettent dexpliquer pourquoi létude des mitochondries progresse si lentement : le manque defficacité des méthodes didentification des protéines mitochondriales et le manque de précision dans lannotation de ces protéines. En conséquence, nous avons développé un nouvel outil informatique, YimLoc, qui permet de prédire avec succès les protéines mitochondriales à partir des séquences génomiques. Cet outil intègre plusieurs indicateurs existants, et sa performance est supérieure à celle des indicateurs considérés individuellement. Nous avons analysé environ 60 génomes fongiques avec YimLoc afin de lever la controverse concernant la localisation de la bêta-oxydation dans ces organismes. Contrairement à ce qui était généralement admis, nos résultats montrent que la plupart des groupes de Fungi possèdent une bêta-oxydation mitochondriale. Ce travail met également en évidence la diversité des processus de bêta-oxydation chez les champignons, en corrélation avec leur utilisation des acides gras comme source dénergie et de carbone. De plus, nous avons étudié le composant clef de la voie de bêta-oxydation mitochondriale, lacyl-CoA déshydrogénase (ACAD), dans 250 espèces, couvrant les 3 domaines de la vie, en combinant la prédiction de la localisation subcellulaire avec la classification en sous-familles et linférence phylogénétique. Notre étude suggère que les gènes ACAD font partie dune ancienne famille qui a adopté des stratégies évolutionnaires innovatrices afin de générer un large ensemble denzymes susceptibles dutiliser la plupart des acides gras et des acides aminés. Finalement, afin de permettre la prédiction de protéines mitochondriales à partir de données autres que les séquences génomiques, nous avons développé le logiciel TESTLoc qui utilise comme données des Expressed Sequence Tags (ESTs). La performance de TESTLoc est significativement supérieure à celle de tout autre outil de prédiction connu. En plus de fournir deux nouveaux outils de prédiction de la localisation subcellulaire utilisant différents types de données, nos travaux démontrent comment lassociation de la prédiction de la localisation subcellulaire à dautres méthodes danalyse in silico permet daméliorer la connaissance des protéines mitochondriales. De plus, ces travaux proposent des hypothèses claires et faciles à vérifier par des expériences, ce qui présente un grand potentiel pour faire progresser nos connaissances des métabolismes mitochondriaux. / The important role of mitochondria in the eukaryotic cell has long been appreciated, but their exact composition and the biological processes taking place in mitochondria are not yet fully understood. The two main factors that slow down the progress in this field are inefficient recognition and imprecise annotation of mitochondrial proteins. Therefore, we developed a new computational tool, YimLoc, which effectively predicts mitochondrial proteins from genomic sequences. This tool integrates the strengths of existing predictors and yields higher performance than any individual predictor. We applied YimLoc to ~60 fungal genomes in order to address the controversy about the localization of beta oxidation in these organisms. Our results show that in contrast to previous studies, most fungal groups do possess mitochondrial beta oxidation. This work also revealed the diversity of beta oxidation in fungi, which correlates with their utilization of fatty acids as energy and carbon sources. Further, we conducted an investigation of the key component of the mitochondrial beta oxidation pathway, the acyl-CoA dehydrogenase (ACAD). We combined subcellular localization prediction with subfamily classification and phylogenetic inference of ACAD enzymes from 250 species covering all three domains of life. Our study suggests that ACAD genes are an ancient family with innovative evolutionary strategies to generate a large enzyme toolset for utilizing most diverse fatty acids and amino acids. Finally, to enable the prediction of mitochondrial proteins from data beyond genome sequences, we designed the tool TESTLoc that uses expressed sequence tags (ESTs) as input. TESTLoc performs significantly better than known tools. In addition to providing two new tools for subcellular localization designed for different data, our studies demonstrate the power of combining subcellular localization prediction with other in silico analyses to gain insights into the function of mitochondrial proteins. Most importantly, this work proposes clear hypotheses that are easily testable, with great potential for advancing our knowledge of mitochondrial metabolism.

Dans le monde entier, les infections virales causent des problèmes de santé majeurs et récurrents, engendrant de sérieux problèmes socio-économiques. Notamment, les virus de la famille Flaviviridae qui représentent un fardeau considérable sur la santé mondiale et font partie des domaines prioritaires de la virologie médicale selon le rapport 2016 du ‘Global Virus Network’. Bien que le traitement actuel contre le virus de l’hépatite C (VHC) ait un taux de guérison dépassant 98%, d’autres comme le virus de la dengue (DENV) et le virus zika (ZIKV) n’ont pas encore de traitement spécifique autorisé. En prenant avantage de la grande expertise de notre laboratoire dans l’étude du VHC, nous avons utilisé des données d’une étude de biologie des systèmes visant à identifier l’interactome des différentes protéines virales. Les techniques utilisées ont combiné l’immunoprécipitation des protéines virales suivie de l’identification des protéines interacteurs humaines par spectrométrie de masse. Des études de génomique fonctionnelle par ARN interférent (ARNi) ont permis d’étudier l’effet de la diminution de l’expression des protéines identifiées sur la réplication du VHC. Cette étude a conduit à la découverte de l’interactant spécifique 17-bêta-hydroxystéroïde déshydrogénase de type 12 (HSD17B12 ou DHB12) de la protéine virale Core comme facteur cellulaire requis à la réplication du VHC. HSD17B12 est une enzyme cellulaire dont l’activité catalytique est requise pour l’élongation des acides gras à très longue chaîne (VLCFA) lors de la deuxième des quatre réactions du cycle d’élongation. Dans cette étude, nous avons déterminé que les cycles de réplication du VHC, ZIKV et DENV dépendent de l’expression et de l’activité métabolique du facteur cellulaire HSD17B12. Ainsi, nous avons étudié les effets de l’inhibition de l’expression génique par ARNi et de façon pharmacologique sur la réplication de plusieurs flavivirus dans une approche antivirale à large spectre. Nous avons démontré que le silençage de HSD17B12 diminue significativement la réplication virale, l’expression des protéines virales et la production de particules infectieuses de cellules Huh7.5 infectées par la souche JFH1 du VHC. L'analyse de la localisation cellulaire de HSD17B12 dans des ii cellules infectées suggère une colocalisation avec l'ARN double brin (ARNdb) aux sites de réplication virale, ainsi qu’avec la protéine Core (et les gouttelettes lipidiques) aux des sites d’assemblage du virus. Nous avons également observé que le silençage de HSD17B12 réduit considérablement le nombre et la taille des gouttelettes lipidiques. En accord avec ces données, la diminution de l’expression de HSD17B12 par ARNi réduit significativement l’acide oléique et les espèces lipidiques telles que triglycérides et phosphatidyl-éthanolamine dans l'extrait cellulaire total. Ces travaux suggèrent une contribution de la capacité métabolique de HSD17B12 lors de la réplication du VHC. De même, nous avons démontré que le silençage de HSD17B12 réduit significativement les particules infectieuses de cellules infectées par DENV et ZIKV. Ces études supportent le rôle de HSD17B12 dans l’efficacité des processus de la réplication de l'ARN viral et de l’assemblage de particules virales. De plus, l'inhibiteur spécifique de HSD17B12, INH-12, réduit la réplication du VHC à des concentrations pour lesquelles aucune cytotoxicité notable n'est observée. Le traitement avec 20 μM d'INH-12 réduit jusqu'à 1,000 fois les particules infectieuses produite par des cellules Huh-7.5 infectées par DENV et ZIKV lors de plusieurs cycles de réplication, et bloque complètement l'expression des protéines virales. En conclusion, ces travaux ont conduit à une meilleure compréhension du rôle de HSD17B12 lors de la synthèse de VLCFA et de lipides requise à la réplication du VHC, permettant d’explorer l’inhibition de HSD17B12 et de l’élongation d’acides gras à très longue chaîne comme nouvelle approche thérapeutique pour le traitement à large spectre des infections par les virus de la famille Flaviviridae. / Infections with viruses are major recurrent socio-economical and health problems worldwide. These include infections by viruses of the Flaviviridae family, which present a substantial global health burden and are among the priority areas of medical virology according to the Global Virus Network 2016 report. While the current treatment regimens for hepatitis C virus (HCV) infection have cure rates of more than 98%, other important members of Flaviviridae like dengue virus (DENV) and zika virus (ZIKV) have no specific licensed treatments. By taking advantage of the most-studied HCV, which our lab has developed a vast expertise in the last 20 years, we used proteomics data of an HCV interactome study, combining viral protein immunoprecipitation (IP) coupled to tandem mass spectrometry identification (IP-MS/MS) and functional genomics RNAi screening. The study uncovered the 17-beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 12 (HSD17B12, also named DHB12), as a specific host interactor of core that promotes HCV replication. HSD17B12 catalytic activity is involved in the synthesis of very-long-chain fatty acids (VLCFA) upon the second step of the elongation cycle. In this study, taking HCV as a virus model, we elucidated the dependency of HCV, dengue virus (DENV) and zika virus (ZIKV) replication on expression and metabolic capacity of the host factor HSD17B12. We investigated the effects of the inhibition of gene expression by RNAi and of its pharmacological enzymatic inhibition on flavivirus replication in a broad-spectrum antiviral approach. We showed that silencing expression of HSD17B12 decreases viral replication, viral proteins and iv infectious particle production of the JFH1 strain of HCV in Huh7.5 cells. The cellular localization analysis of HSD17B12 showed a co-staining with double-stranded RNA (dsRNA) at viral replication sites and with core protein (and lipid droplets) at virus assembly sites. Furthermore, HSD17B12 gene silencing drastically reduced the number and size of lipid droplets. In association, the reduced expression of HSD17B12 by RNAi decreases oleic acid levels and lipids such as triglycerides (TG) and phosphatidylethanolamine (PE) in whole-cell extract. The data suggested the requirement of the metabolic capacity of HSD17B12 for HCV replication. Similarly, we provide evidence that HSD17B12 silencing significantly reduces DENV and ZIKV infectious particles. The studies support a role of HSD17B12 for effective viral RNA replication and particle assembly processes. Moreover, the specific HSD17B12 inhibitor, INH-12, reduces HCV replication at concentrations for which no appreciable cytotoxicity is observed. The treatment of DENV- and ZIKV-infected Huh- 7.5 cells with 20 μM of INH-12 dramatically reduces production of infectious particles by up to 3-log10 in infection assays, and completely block viral protein expression. In conclusion, these studies extends our understanding of the role of HSD17B12 in VLCFA synthesis required for the replication of HCV, allowing to explore the inhibition of HSD17B12 and elongation of VLCFA as a novel therapeutic approach for the treatment of a broad-spectrum of viruses of the Flaviviridae family.