Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Une nouvelle méthode appelée DIAMS (Desorption/Ionization on self-Assembled Monolayer Surface) a été développée pour remédier aux problèmes liés à la présence d'ions de matrice en ionisation MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization). Le principe de la méthode DIAMS est d'obtenir des spectres de masse à partir d'échantillons de faible poids moléculaire directement déposés sur une surface d'or recouverte d'une monocouche organique auto-assemblée (SAM) absorbant à la longueur d'onde du laser (337 nm). Après un rappel sur l'interaction laser/matière en spectrométrie de masse, l'élaboration des cibles DIAMS et leur contrôle par électrochimie sont décrits. La faisabilité de la méthode et sa robustesse sont testées à partir de l'analyse de lipides. Les résultats sont comparés avec d'autres méthodes telles que le LDI sur surface d'or et le MALDI. Une étude mécanistique est ensuite initiée pour apporter des éléments de compréhension au processus DIAMS. Il s'agit de comparer les évaluations de distributions d'énergie interne P(Eint) des ions produits en DIAMS et LDI sur or. Dans ce but, des molécules thermomètres telles que des sels de benzylpyridinium substitués et des peptides modèles sont utilisées. Les P(Eint) sont déterminées par la méthode de rendement de survie d'ions et confirmées à l'aide du logiciel MassKinetics. Ainsi, pour une certaine fluence du laser, la distribution d'énergie interne est purement thermique en DIAMS, contrairement à ce qui est mesuré en LDI sur surface d'or. La présence d'un groupement chromophore au sein de la monocouche (bithiophène), constitue un milieu protecteur vis-à-vis du rayonnement laser; cette protection semble augmenter avec la fluence laser. Enfin, une mesure des vitesses initiales des ions de la gramicidine désorbés en DIAMS et LDI sur or, révèle que la nature de la surface n'a pas d'influence sur l'énergie cinétique initiale des ions produits par désorption/ionisation laser.

Mes travaux de thèse concernent la fabrication de micro et de nanostructures en silicium dans le but de développer des surfaces non-mouillantes et d’outils analytiques pour des applications en biochimie et en microfluidique. Pour ce faire, nous avons utilisé d’une part la gravure chimique humide qu’est la « metal-assisted electroless etching » (approche descendante) et d’autre part la croissance de nanofils par « Chemical Vapor Deposition » via le mécanisme « Vapor-Liquid-Solid » (approche ascendante). Des surfaces structurées possédant des morphologies différentes ont été obtenues. Grâce à ces méthodes de fabrication nous avons préparé des structurations simple et double, à savoir des structurations nanométriques et micrométriques et des doubles structurations micro-nanométriques. Dans une première partie, les surfaces structurées ont permis de développer des surfaces superomniphobes, capables de repousser des liquides présentant des tensions de surface très variables. Les surfaces présentant une double structuration donnant les meilleures propriétés non-mouillantes. Dans une deuxième partie, ces surfaces nanostructurées ont été utilisées comme matrices inorganiques pour la désorption/ionisation assistée par laser permettant l’analyse en spectrométrie de masse de petites molécules sans l’utilisation de matrice organique. Nous avons étudié l’influence de la morphologie, du type de dopage et de la terminaison chimique sur l’analyse en spectrométrie de masse d’un mélange de peptide standard. Finalement, nous avons réalisé l’enrichissement d’un peptide et son analyse en spectrométrie de masse à partir d’un mélange donné, grâce à l’introduction d’un ligand spécifique. / This work concerns the fabrication of micro/nanostructured silicon substrates and their application as non-wetting surfaces, and analytical tools for biomolecules’ analysis and in microfluidic devices. Two different techniques were investigated for the formation of nanostructured silicon substrates: chemical wet etching via metal-assisted electroless etching (Top-down approach) and nanowire growth by « Chemical Vapor Deposition » via Vapor-Liquid-Solid mechanism (Bottom-up approach). Different structured surface morphologies were then obtained. These were either simple structured such as: Micro or Nanoscale, or double structured such as: Micro-Nano or Nano-Nanoscale. The first part of the thesis deals with the preparation of superominiphobic surfaces capable of repelling almost any liquid. The surfaces consisting of double structured substrates gave the best non-wetting properties. Secondly, nanostructured silicon substrates were used as inorganic matrices for the detection of small molecules without using an organic matrix in laser desorption/ionization mass spectrometry. Herein, we investigated the influence of surface morphology, doping type and chemical termination on mass spectrometry analysis of a standard peptide mixture. Finally, functionalized silicon nanowires surfaces with a specific ligand were used to perform peptide enrichment and its subsequent analysis by mass spectrometry from a mixture solution.

Dans un contexte d’étude des altérations biologiques survenant après un impact sur le système nerveux central (SNC), ma thèse porte sur l’étude des modifications protéomiques et lipidiques survenant après une lésion du SNC. Une étude spatio-temporelle a été menée sur un modèle TBI de rat afin d'identifier des marqueurs spécifiques de la lésion. En utilisant le MALDI-MSI, nous avons effectués une reconstruction 3D du cerveau lésé 3 jours post-lésion et nous avons représentés les molécules lipidiques spécifiques à la lésion. Après, cette analyse est réalisé avec d’autres délais après l’impact: 1, 3, 7 et 10 jours. En parallèle, une analyse microprotéomique est réalisée sur des coupes de tissus dans une approche visant à corréler les modifications lipidiques et protéiques. Nos résultats ont permis d'identifier une famille de lipides, les acylcarnitines, exprimés dans le cortex lésé avec une intensité maximale à 3 jours post-impact. Les données de protéomiques ont montrés une régulation positive de l’expression de protéines liées à la maladie de Parkinson. Dans l’ensemble, nos résultats décrivent un lien entre le TBI léger et la maladie de Parkinson dès 3 jours après l’impact, avec un rôle possible de l’acylcarnitine. Cette même famille de molécules est aussi présente dans les lésions médullaires. Dans une approche thérapeutique, les résultats précédents ont montrés que la protéine RhoA est un candidat majeur dans SCI. Après avoir utilisé un inhibiteur de RhoA, une étude protéomique a été réalisée pour évaluer l’impact sur ces lésions. Les résultats montrent que les traitements in-vivo et in-vitro avec l’inhibiteur stimule la croissance neuritique et la régénération axonale. / In the context of studying biological alterations occurring post impact to the central nervous system, my thesis was focused on studying the proteomic and lipid changes occurring post injury to the brain and spinal cord. A fundamental spatio-temporal study was conducted on an open-head rat TBI model to identify potential injury-specific markers. Using MALDI MSI, we performed 3D reconstruction of the injured brain at 3 days after injury and depicted lesion-specific m/z lipid molecules. After, MALDI MSI was applied on the acute/sub-acute time frame post impact: 1 day, 3 days, 7 days, and 10 days. In parallel, a microproteomic analysis was carried out on tissue segments directly consecutive to the imaged ones in an approach to correlate both lipid and protein changes. Our results yielded the identification of a family of lipids, acylcarnitines, which are expressed within the injured cortex with maximum intensity 3 days post impact. These lipid molecules also were found to be expressed in the substantia nigra and microproteomics data showed an upregulation in expression of Parkinson’s related proteins. Taken altogether, our results depict a role of link between mild-TBI and Parkinson’s disease as early as 3 days post impact, with a possible role of acylcarnitine. This same family of molecules was also present in SCI. In a therapeutic approach previous results showed RhoA protein as a major candidate post impact in SCI. After using RhoA inhibitor treatment, a proteomic study was carried out to investigate its impact on SCI. The results showed that both in-vivo and in-vitro treatment with RhoA inhibitor stimulated neurite outgrowth and helped in axonal regeneration.

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Les interactions non-covalentes (NCI pour Non-Covalent Interactions) stabilisant les complexes non-covalents biologiques (NCX pour Non-Covalent compleXes) régissent la majorité des processus cellulaires indispensables au développement et au bon fonctionnement de tout organisme vivant. Toutes les fonctions de l'ADN, tels que son conditionnement, sa réplication et la régulation de son expression, sont permises par la formation et la dissociation de NCI avec des protéines. La compréhension des bases de ces processus cellulaires de l'ADN au niveau moléculaire est un sujet d'actualité et d'une importance fondamentale. Des informations essentielles peuvent être obtenues par spectrométrie de masse (MS pour Mass Spectrometry) qui joue un rôle de plus en plus important dans ce domaine. Malgré la technologie avancée déjà mise en ¿uvre, le développement de nouveaux concepts d'ionisation et d'activation implémentent perpétuellement la MS. Les travaux de thèse exposés à travers ce manuscrit présente l'étude de la stabilité des NCI maintenant les NCX biologiques par la comparaison des voies de fragmentations observées en mode positif et en mode négatif mais aussi par l'application de certains concepts récents de la MS comme : (i) l'utilisation d'agents de " superchargement " et, (ii) le développement et l'utilisation d'une source V-EASI (pour Venturi Easy Ambiant Sonic-spray Ionization) permettant l'aspiration libre de la solution et la désorption/ionisation des analytes par la seule vélocité du gaz de nébulisation.

Les interactions non-covalentes (NCI pour Non-Covalent Interactions) stabilisant les complexes non-covalents biologiques (NCX pour Non-Covalent compleXes) régissent la majorité des processus cellulaires indispensables au développement et au bon fonctionnement de tout organisme vivant. Toutes les fonctions de l'ADN, tels que son conditionnement, sa réplication et la régulation de son expression, sont permises par la formation et la dissociation de NCI avec des protéines. La compréhension des bases de ces processus cellulaires de l'ADN au niveau moléculaire est un sujet d'actualité et d'une importance fondamentale. Des informations essentielles peuvent être obtenues par spectrométrie de masse (MS pour Mass Spectrometry) qui joue un rôle de plus en plus important dans ce domaine. Malgré la technologie avancée déjà mise en ¿uvre, le développement de nouveaux concepts d'ionisation et d'activation implémentent perpétuellement la MS. Les travaux de thèse exposés à travers ce manuscrit présente l'étude de la stabilité des NCI maintenant les NCX biologiques par la comparaison des voies de fragmentations observées en mode positif et en mode négatif mais aussi par l'application de certains concepts récents de la MS comme : (i) l'utilisation d'agents de " superchargement " et, (ii) le développement et l'utilisation d'une source V-EASI (pour Venturi Easy Ambiant Sonic-spray Ionization) permettant l'aspiration libre de la solution et la désorption/ionisation des analytes par la seule vélocité du gaz de nébulisation. / Non-covalent interactions (NCI) stabilizing biological non-covalent complexes (NCX) lead most of cellular processes compulsory for the development and the functioning of all living organisms. All DNA functions, such as its conditioning, its replication and the regulation of its expression, are allowed by the formation and the dissociation of NCI with proteins. The comprehension of cellular processes basis of DNA at the molecular level is both topical and fundamental. Crucial information can be obtained by mass spectrometry (MS) which plays an increasing role in this field. Despite the already advanced technology applied, the development new ionization and activation concepts implement perpetually the MS. The Ph.D. work described through this manuscript presents the study of NCI maintaining the biological NCX by the comparison of fragmentation pathways observed in positive ion mode and in negative ion mode but also by the application of some recent MS concepts like: (i) the use of supercharging reagents and, (ii) the development and the use of a Venturi Easy Ambiant Sonic-spray Ionization (V-EASI) source allowing the free aspiration of the solution and the desorption/ionization of the analytes only by the velocity of the spraying gas.

Le sujet de ce mémoire porte sur une nouvelle technologie, permettant d'améliorer l'utilisation d'un spectromètre de masse dans le domaine de l'analyse instrumentale de petites molécules (100 à 1200 uma), tant sur le point de vue de la rapidité d'analyse, que sur les coûts d'opérations et de maintenance. Dans un marché de plusieurs milliards de dollars, incluant entre autre l'industrie pharmaceutique, toxicologique ou environnementale, cela peut se traduire par des gains énormes. Cet instrument, la source d'ionisation LDTD (Laser Diode Thermal Desorption), a été développé entièrement par une entreprise québécoise et sera l'objet central de la présente étude en étant mis à l'essai afin de détecter et quantifier la présence dans le miel d'un résidu d'antibiotique dangereux pour l'être humain, le chloramphenicol (CAP). Lors du développement de cette méthode, une découverte particulière et fortuite a permis une amélioration de l'efficacité d'utilisation de l'appareil pour certaines applications en utilisant des acides gras comme agents exaltants. On démontrera donc l'efficacité de la source LDTD afin de détecter des niveaux de CAP aussi bas que dans les méthodes jusqu'à présent publiées, mais dans un temps d'analyse près de 100 fois plus rapide.

Ce manuscrit de thèse présente le développement de méthodes basées sur la spectrométrie de masse consacrées à la recherche d'inhibiteurs d'enzymes en milieux complexes, tels que les extraits de plantes. L’enzyme Tyrosinase a été utilisé comme principale cible biologique du fait de son implication dans les processus d’hyperpigmentation cutanée. De ce fait, la recherche d’inhibiteurs de cette enzyme, présente un grand intérêt pour l'industrie cosmétique. La première partie de ce manuscrit décrit la mise en place de la chromatographie d'affinité frontale (FAC), permettant d’obtenir le classement simultané des inhibiteurs présent dans un mélange complexe en fonction de leurs affinités avec la cible biologique. Deux capillaires hydrophiles de phase monolithiques ont été évalués afin de réduire au maximum les interactions non spécifiques indésirables entre les analytes et le support solide d’immobilisation. De plus, nous avons étudié la faisabilité de l’utilisation de phases à base de silice comme support solide d’immobilisation des enzymes dans le cadre de ces analyses par chromatographie d'affinité frontale. La seconde partie du manuscrit de thèse est consacrée au développement et à l’optimisation de l’approche nommée ENALDI-MS (Enzyme-coupled Nanoparticles-Assisted Laser Desorption/Ionisation Mass Spectrometry) permettant d’accéder à une gamme des faibles masses (m/z 500 Da). Elle est déclinée en une première approche dite par ‘extinction d’ions’ (Ion Fading, IF-ENALDI), basée sur l’identification directe de la liaison des inhibiteurs vis-à-vis de l’enzyme sans pré-traitement de l’échantillon végétal. Une seconde déclinaison de l’ENALDI-MS concerne une approche dite par ‘Ion Hunting’ (IH - ENALDI MS), basée sur une méthode de pré-concentration sélective des inhibiteurs présents dans l'échantillon. / This thesis report presents the development of mass spectrometry-based methods for searching for inhibitors of enzymes in complex mixtures, such as plant extracts. Tyrosinase enzyme was used as the main biological target for the reason of a significant importance of its inhibitors in the cosmetic industry as the skin whitening agents. The first part of this report describes Frontal Affinity Chromatography (FAC), an approach enabling simultaneous ranking the inhibitors within the complex mixture according to their affinities to the biological target. Two hydrophilic capillary-scale polymer-based bioaffinity stationary phases were evaluated in the context of the presence of undesirable nonspecific interactions between the analyte and the solid immobilisation support. In addition, we explored the usability of two types of silica-based particles as a solid support for enzyme immobilisation for FAC. The second part of the thesis manuscript is devoted to Enzyme-coupled Nanoparticle-Assisted Laser Desorption/Ionisation Mass Spectrometry (ENALDI MS) as a low-mass compatible extension of the Intensity ion Fading MALDI MS (IF-MALDI MS) method for high-throughput screening of the inhibitors in the complex mixtures. Two variations of ENALDI MS were evaluated: 'Ion Fading' (IF-ENALDI MS), based on on-the-spot binding of inhibitors by enzyme molecules and 'Ion Hunting' (IH-ENALDI MS), based on selective pre-concentration of inhibitors present in the sample.

Le cholestérol est l'une des molécules biologiques indispensable au bon fonctionnement de la plupart des organismes vivants, y compris chez l’homme. Cette molécule se trouve en abondance dans des tissus cérébraux et joue trois rôles principaux dans l'organisme. C’est un constituant (composant) essentiel de la membrane cellulaire qui sert à maintenir l’intégrité et la fluidité des cellules. Le cholestérol est aussi un élément déclencheur pour la production d’hormones stéroïdiennes comme les hormones sexuelles et la vitamine D. Finalement, il contribue à la production des acides biliaires par le foie. Dans cette étude, une méthode analytique de quantification absolu du cholestérol dans sections tissulaires de cerveau de souris par IMS a été développée. Pour ce faire, dans un premier temps des courbes d’étalonnage faites à partir de concentrations croissantes de cholesterol-d7 ont été réalisé en dopant directement des sections minces d’homogénat de cerveau. Par la suite, un étalon interne de stigmastérol (un stérol naturel d’origine exclusivement végétale) a été utilisé pour normaliser les signaux en provenance du cholestérol et du cholestérol-d7. Finalement, les analyses ont été effectué en utilisant une méthode IMS préalablement développée au laboratoire pour la détection spécifique et l’imagerie du cholestérol par désorption ionisation laser assistée par l’argent. L’étalon interne a été utilisé ici pour réduire les erreurs instrumentales, et les résultats avant et après normalisation montrent le rôle fonctionnel de cette méthode dans l’amélioration de la linéarité de la courbe d’étalonnage et, en conséquence, la mesure précise du cholestérol dans des échantillons analysés. / Cholesterol is one of the biological molecules essential for the proper functioning of most living organisms, including humans, and accurate quantification of cholesterol has many potential implications. This molecule is found abundantly in the brain and plays three main roles in the body. It is an essential component of the cell membrane which serves to maintain the integrity and fluidity of cells. Cholesterol is also a chemical trigger for the production of various steroid hormones such as sex hormones and vitamin D. Ultimately, it helps the liver to produce bile acids. A greater understanding of cholesterol and of its role in the body may directly impact our understanding of these processes. In this study, an analytical method for the absolute quantification of cholesterol in the mouse brain slices by IMS was developed. To achieve this calibration curves made from increasing concentrations of cholesterol-d7 were first performed by doping them on thin sections of brain homogenate. Subsequently, stigmasterol (a natural sterol of exclusively plant origin) was used as an internal standard to normalize the signals from cholesterol and cholesterol-d7 was evenly deposited over all analyzed sections. Finally, the analyzes were performed using an IMS method previously developed in the laboratory for the specific detection and imaging of cholesterol by silver-assisted laser ionization desorption. The internal standard was used here to reduce instrument errors, and the before and after normalization results show the functional role of this method in improving the linearity of the calibration curve and, therefore, the accurate measurement of cholesterol in the analyzed samples.