NOGUEIRA, Vanessa Lúcia Rodrigues. Papel de proteínas na tinta liberada pela lesma-do-mar Aplysia dactylomela Rang 1828 os mecanismos de defesa do animal. 2005. 90 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Marinhas Tropicais) - Instituto de Ciências do Mar, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2005. / Submitted by Debora Oliveira (deby_borboletinha@hotmail.com) on 2011-12-22T15:10:49Z No. of bitstreams: 1 2005_dis_vlrnogueira.pdf: 12654022 bytes, checksum: 35936f35caac0bc23dbf25e1b2ffcafc (MD5) / Approved for entry into archive by Nadsa Cid(nadsa@ufc.br) on 2012-01-23T17:07:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2005_dis_vlrnogueira.pdf: 12654022 bytes, checksum: 35936f35caac0bc23dbf25e1b2ffcafc (MD5) / Made available in DSpace on 2012-01-23T17:07:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2005_dis_vlrnogueira.pdf: 12654022 bytes, checksum: 35936f35caac0bc23dbf25e1b2ffcafc (MD5) Previous issue date: 2005 / The sea hare Aplysia dactylomela is known by discharging a purple ink when disturbed. As it doesn't show any external structure of protection, it is believed that this secretion, rich in bioactive substances, participates in the chemical defense against pathogens and/or predators. The ink is constituted mainly by pigments, proteins and low molecular mass substances. The pigments are originated from red algae, nevertheless, there is lack of information about the origin, processing, storage and function of the ink proteins. This work describes the protein composition of the ink and present some physiochemical and biological characteristics of the dactylomelin-P, an antibacterial protein from the ink besides information concerning the location of this protein in the purple gland. The ink was obtained from specimens collected at Fleixeiras beach, Ce. The protein composition of the ink was studied by bi-dimensional electrophoresis. The purification of dactylomelin-P consisted basically in ion exchange and hydrophobic interaction chromatography. Dactylomelina-P was analyzed as to molecular mass, isoeletric point, amino acid composition, carbohydrates, heat stability, pH and proteinase resistance. Several biological activities were tested with the ink and with dactylomelina-P, including antimicrobial, enzymatic, haemagglutinating, anticoagulant, hemolytic, cytotoxic and toxic activities. The immunolocalization assays of dactylomelina-P were carried out in different sea hare tissues by western blot and immunohistochemistry and the interaction with Staphylococcus aureus was investigated by immunocytochemistry. The ink of A. dactylomela contains more than 40 proteins/peptides, with molecular masses below 70 kDa and acid pIs. The most abundant protein in the ink is the dactylomelin-P, a monomeric protein with 59,8 kDa, pI 5,0, high methionin content, and less than 1% carbohydrates. It is denatured at 60 ºC for 10 minutes and it resists to pH range of 3-12. Dactylomelin-P shows a wide antibacterial action spectrum, but no antifungal, unlike the ink that possesses some factor with this activity. It is particularly efficient against sea bacteria, can be bactericidal (4,0μg/ml) or bacteriostatic (0,2μg/ml), depending on the concentration. Dactylomelin-P agglutinated rabbit, mice and rat erythrocytes, but it did not show anticoagulating, hemolytic and cytotoxic activities. The LD50 for mice was 60-100 mg/Kg, being considered moderately toxic. Dactylomelin-P was only found in the ink gland, being located preferentially in the cells of the producing vesicles. The electronic transmission microscopy revealed that the dactylomelina-P crosses the cell wall of S. aureus and interacts mainly with the plasmatic membrane, probably interfering in the metabolism of the bacterium, instead of causing mechanic damage to the cell. / O gastrópode marinho Aplysia dactylomela é conhecido por liberar uma tinta púrpura sempre que é importunado. Como não possui nenhuma estrutura externa de proteção, acredita-se que essa secreção, rica em substâncias biologicamente ativas, participe da defesa química do animal. A tinta é composta de pigmentos, proteínas e substâncias de baixa massa molecular. Os pigmentos da tinta são originados de algas vermelhas, mas quanto às proteínas, pouco é conhecido sobre a sua origem, processamento, local de armazenamento e função no animal. Este trabalho descreve pela primeira vez a composição protéica da tinta e apresenta algumas características físico-químicas e biológicas da dactylomelina-P, uma proteína antibacteriana presente na tinta dessa lesma, além de trazer informações acerca da localização desta proteína na glândula de tinta. A tinta foi obtida a partir de espécimes encontrados na praia de Fleixeiras, Ce. A composição de proteínas da tinta foi determinada por eletroforese bidimensional e a purificação da dactylomelina-P foi feita através de cromatografias de troca iônica e interação hidrofóbica. Dactylomelina-P foi analisada quanto à massa molecular, ponto isoelétrico, composição de aminoácidos, presença de carboidratos, estabilidade térmica, resistência ao pH e a proteases. Várias atividades biológicas foram testadas com a tinta e com a dactylomelina-P, incluindo atividades antimicrobianas, enzimáticas, hemaglutinante, anticoagulante, hemolítica, citotóxica e tóxica. Os ensaios de localização da proteína foram realizados em diferentes tecidos da lesma por western blot, na glândula de tinta por imunohistoquímica e a interação com a bactéria Staphylococcus aureus foi feita por imunocitoquímica. A tinta de A. dactylomela contém mais de 40 proteínas/ peptídeos, com massas abaixo de 70 kDa e pIs na faixa ácida. A proteína mais abundante na tinta é a dactylomelina-P, que é uma molécula monomérica, de 59,8 kDa, pI 5,0, que possui alto teor de metionina e menos de 1% de carboidratos, é desnaturada a 60 ºC por 10 minutos e resiste a pHs entre 3-12. Dactylomelina-P mostra um amplo espectro de ação antibacteriano, mas não antifúngico, ao contrário da tinta que possui um fator com esta atividade. É particularmente eficiente contra bactérias marinhas, podendo ser bactericida (4,0μg/ml) ou bacteriostática (0,2μg/ml), dependendo da concentração. Dactylomelina-P aglutinou eritrócitos de coelho, ratos e camundongos, não apresentou atividade anticoagulante, hemolítica e nem citotóxica. A DL50 para camundongos ficou entre 60-100 mg/Kg, sendo considerada moderadamente tóxica. Dactylomelina-P só foi encontrada na glândula de tinta, localizando-se preferencialmente nas células das vesículas produtoras. Ensaios de microscopia eletrônica de transmissão revelaram que a dactylomelina atravessa a parede celular da bactéria S. aureus e, interage principalmente com a membrana citoplasmática, provavelmente interferindo no metabolismo, ao invés de causar danos à célula.

O gastrÃpode marinho Aplysia dactylomela à conhecido por liberar uma tinta pÃrpura sempre que à importunado. Como nÃo possui nenhuma estrutura externa de proteÃÃo, acredita-se que essa secreÃÃo, rica em substÃncias biologicamente ativas, participe da defesa quÃmica do animal. A tinta à composta de pigmentos, proteÃnas e substÃncias de baixa massa molecular. Os pigmentos da tinta sÃo originados de algas vermelhas, mas quanto Ãs proteÃnas, pouco à conhecido sobre a sua origem, processamento, local de armazenamento e funÃÃo no animal. Este trabalho descreve pela primeira vez a composiÃÃo protÃica da tinta e apresenta algumas caracterÃsticas fÃsico-quÃmicas e biolÃgicas da dactylomelina-P, uma proteÃna antibacteriana presente na tinta dessa lesma, alÃm de trazer informaÃÃes acerca da localizaÃÃo desta proteÃna na glÃndula de tinta. A tinta foi obtida a partir de espÃcimes encontrados na praia de Fleixeiras, Ce. A composiÃÃo de proteÃnas da tinta foi determinada por eletroforese bidimensional e a purificaÃÃo da dactylomelina-P foi feita atravÃs de cromatografias de troca iÃnica e interaÃÃo hidrofÃbica. Dactylomelina-P foi analisada quanto à massa molecular, ponto isoelÃtrico, composiÃÃo de aminoÃcidos, presenÃa de carboidratos, estabilidade tÃrmica, resistÃncia ao pH e a proteases. VÃrias atividades biolÃgicas foram testadas com a tinta e com a dactylomelina-P, incluindo atividades antimicrobianas, enzimÃticas, hemaglutinante, anticoagulante, hemolÃtica, citotÃxica e tÃxica. Os ensaios de localizaÃÃo da proteÃna foram realizados em diferentes tecidos da lesma por western blot na glÃndula de tinta por imunohistoquÃmica e a interaÃÃo com a bactÃria Staphylococcus foi feita por imunocitoquÃmica. A tinta de A. dactylomela contÃm mais de 40 proteÃnas/ peptÃdeos, com massas abaixo de 70 kDa e pIs na faixa Ãcida. A proteÃna mais abundante na tinta à a dactylomelina-P, que à uma molÃcula monomÃrica, de 59,8 kDa, pI 5,0, que possui alto teor de metionina e menos de 1% de carboidratos, à desnaturada a 60 ÂC por 10 minutos e resiste a pHs entre 3-12. Dactylomelina-P mostra um amplo espectro de aÃÃo antibacteriano, mas nÃo antifÃngico, ao contrÃrio da tinta que possui um fator com esta atividade. à particularmente eficiente contra bactÃrias marinhas, podendo ser bactericida (4,0μg/ml) ou bacteriostÃtica (0,2μg/ml), dependendo da concentraÃÃo. Dactylomelina-P aglutinou eritrÃcitos de coelho, ratos e camundongos, nÃo apresentou atividade anticoagulante, hemolÃtica e nem citotÃxica. A DL50 para camundongos ficou entre 60-100 mg/Kg, sendo considerada moderadamente tÃxica. Dactylomelina-P sà foi encontrada na glÃndula de tinta, localizando-se preferencialmente nas cÃlulas das vesÃculas produtoras. Ensaios de microscopia eletrÃnica de transmissÃo revelaram que a dactylomelina atravessa a parede celular da bactÃria S. aureus e, interage principalmente com a membrana citoplasmÃtica, provavelmente interferindo no metabolismo, ao invÃs de causar danos à cÃlula. / The marine gastropod Aplysia dactylomela is known to release a purple ink when it is plagued. How has no external structure of protection, it is believed that secretion, rich in biologically active substances, participate in the chemical defense of the animal. The ink is composed of pigments, proteins and low molecular weight substances. The pigments of ink are originated from red algae, but as the protein, little is known about its origin, processing, storage location and function in animals. This paper describes for the first time the protein composition of the ink and presents some physico-chemical and dactylomelina of organic-P, an antibacterial protein present in the ink that slug, and get information about the location of this protein in the ink gland. The paint was obtained from specimens found on the beach in Fleixeiras, Ce. The protein composition of the ink was determined by two-dimensional electrophoresis and purification of dactylomelina-P was done by ion exchange chromatography and hydrophobic interaction. Dactylomelina-P was analyzed on the molecular mass, isoelectric point, composition of amino acids, the presence of carbohydrates, thermal stability, resistance to proteases and pH. Several biological activities were tested with the ink and the dactylomelina-P, including antimicrobial activity, enzyme, haemagglutinating, anticoagulant, hemolytic, cytotoxic and toxic. Tests for localization of the protein were performed in different tissues of the slug by western blot in the ink gland by immunohistochemistry and the interaction with the bacterium Staphylococcus was performed by immunocytochemistry. The ink of A. dactylomela contains more than 40 proteins / peptides, with masses below 70 kDa and PIs in the acidic range. The most abundant protein in the ink is dactylomelina-P, which is a monomeric molecule of 59.8 kDa, pI 5.0, which has high content of methionine and less than 1% of carbohydrates, is denatured at 60  C for 10 minutes and resist the pH between 3-12. Dactylomelina-P shows a broad spectrum of antibacterial action, but not antifungal, unlike paint that has a factor with this activity. It is particularly effective against marine bacteria and may be bactericidal (4.0 g / ml) or bacteriostatic (0.2 g / ml), depending on the concentration. P-Dactylomelina agglutinate rabbit erythrocytes, rats and mice, showed no anticoagulant activity, and cytotoxic and hemolytic. The LD50 for mice was between 60-100 mg / kg, is considered moderately toxic. Dactylomelina-P was found in the ink gland, is located preferentially in cells producing the vesicles. Tests for transmission electron microscopy revealed that the dactylomelina through the cell wall of the bacterium S. aureus and mainly interacts with the cytoplasmic membrane, probably interfering with metabolism, rather than damage the cell.

Nos moluscos sem concha ou naqueles em que a mesma estÃÂ presente na forma vestigial, como cefalÃÂpedes e gastrÃÂpodes opistobrÃÂnquios, a falta dessa proteÃÂÃÂo externa conduziu ÃÂ evoluÃÂÃÂo de mecanismos de defesa dominados pela secreÃÂÃÂo ou incorporaÃÂÃÂo de substÃÂncias quÃÂmicas bioativas. ProteÃÂnas sintetizadas de novo sÃÂo bons exemplos dessas molÃÂculas, tendo sido encontradas nas tintas de vÃÂrias espÃÂcies de lesmas do mar, particularmente do gÃÂnero Aplysia. Muitas jÃÂ revelaram pertencer a famÃÂlias de proteÃÂnas com atividade oxidÃÂstica de L-aminoÃÂcidos (LAAOs), grupo do qual fazem parte tambÃÂm proteÃÂnas bioativas encontradas nos venenos de serpentes. A caracterizaÃÂÃÂo, portanto, das atividades biolÃÂgicas e do perfil bioquÃÂmico dessas proteÃÂnas ÃÂ muito ÃÂtil para que possamos entender como se dÃÂo os mecanismos defensivos desses animais e quÃÂo difundidos esses sÃÂo, alÃÂm de proporcionar subsÃÂdios para sua aplicaÃÂÃÂo biomedicinal. Esse estudo visou a elucidaÃÂÃÂo dos mecanismos de aÃÂÃÂo da dactilomelina-P, proteÃÂna antibacteriana purificada da tinta de Aplysia dactylomela, e a comparaÃÂÃÂo da composiÃÂÃÂo protÃÂica e das atividades antimicrobianas das tintas liberadas por dois gastrÃÂpodes, A. dactylomela e Bursatella leachii, e por um cefalÃÂpode, Octopus sp.. O estudo revelou que a dactilomelina-P ÃÂ uma L-aminoÃÂcido oxidase capaz de oxidar L-lisina e L-arginina, com maior afinidade por L- arginina, com Km de 0,22 +- 0,16 mM/L para a L-lys e de 0,015 +- 0,01 Mm/L para a L-arg. Demonstrou tambÃÂm que sua atividade antibacteriana ÃÂ medida por esta propriedade, tendo o perÃÂxido de hidrogÃÂnio, gerado na oxidaÃÂÃÂo enzimÃÂticca, grande aprtipaÃÂÃÂo na inibiÃÂÃÂo bacteriana. A proteÃÂna se comporta de maneira bacteriostÃÂtica quando em meio nÃÂo suplementado com L-lisina e L-angilina, sendo bactericida na presenÃÂa destes. AlÃÂm disso, a atividade antibacteriana mostrou ser dependente da concentraÃÂÃÂo de aminoÃÂcidos disponibilizados para oxidaÃÂÃÂo pela proteÃÂna. A atividade Staphylococcus aureus deve ocorrer por meio de mecanismos que nÃÂo induzam danoso na morfologia celular, uma vez que nÃÂo foi observada qualquer alteraÃÂÃÂo morfolÃÂgica por microscopia de forÃÂa atÃÂmica. JÃÂ a anÃÂlise das trÃÂs tintas pro PAGE-SDS revelou a presenÃÂa, em todas elas, de bandas protÃÂicas de cerca de 60 kDa, alÃÂm de bandas de peso moleculares mais baixos. Por Western blot pode-se observar a existÃÂncia de identidade imunolÃÂgica entre proteinas das trÃÂs tintas, visto que anticorpos policlonais produzidos contra a dactilomelina-P reconheceram proteÃÂna(s) de cerca de 60 kDa na tinta de B. leachii e de cerca de 30 kDa na tinta de Octopus sp. Dentre as trÃÂs tintas, somente a tinta de A. dactylomela apresentou atividades antibacterianas e antifÃÂngica / In shelled molluscs or those in which it is present as vestigial as cephalopods and gastropods opistobrÃÂnquios, the lack of external protection led to the evolution of defense mechanisms dominated by the secretion or incorporation of bioactive chemicals. Proteins synthesized again are good examples of these molecules, were found in paints of various species of sea slugs, particularly the genus Aplysia. Many have already revealed belong to protein families with oxidÃÂstica activity of L-amino acids (LAAOs), a group which comprises also bioactive proteins found in snake venoms. The characterization therefore biological activities and biochemical profile of these proteins is very useful for us to understand how to give the defense mechanisms of animals and how widespread they are, in addition to providing subsidies to its application biomedicinal. This study aimed to elucidate the mechanisms of action of P-dactilomelina, antibacterial protein purified from Aplysia ink dactylomela, and comparison of protein composition and antimicrobial activities of paint released by two gastropods, A. dactylomela and Bursatella leachii, and a cephalopod, Octopus sp .. The study revealed that dactilomelina-P is an L-amino acid oxidase capable of oxidizing L-lysine and L-arginine, with a higher affinity for L-arginine, with a Km of 0.22 + - 0.16 mM / L for L -lys and 0.015 + - 0.01 mM / L L-arg. It also demonstrated that its antibacterial activity is measured by this property, with the hydrogen peroxide generated in the oxidation enzimÃÂticca, great aprtipaÃÂÃÂo in bacterial inhibition. The protein behaves in a non-bacteriostatic when supplemented with L-lysine and L-angilina, being in the presence of bactericidal. In addition, the antibacterial activity was shown to be dependent on the concentration of amino acids available for oxidation by the protein. Staphylococcus aureus activity must occur through mechanisms that do not induce damage to cell morphology, since we did not observe any morphological change by atomic force microscopy. The analysis of the three pro paint SDS-PAGE revealed the presence in them all, protein bands of about 60 kDa, and bands of lower molecular weight. For Western blot can observe the existence of immunologic identity between proteins of the three dyes, since polyclonal antibodies produced against P-dactilomelina recognized protein (s) of about 60 kDa in ink B. leachii and approximately 30 kDa in ink Octopus sp. Among the three dyes, only the ink of A. dactylomela showed antibacterial and antifungal activities