The repair of DNA damage is vital to the health and survival of organisms and their cells. In humans, there exist several disorders that involve the inefficient processing or repair of DNA damage. Cellular sensitivity to DNA-damaging agents is a hallmark of repair-deficient syndromes which are often associated with an increased risk of cancer. In this work, I have investigated the repair of cisplatin-damaged DNA by utilizing host cell reactivation and cellular capacity assays that assess DNA repair using adenovirus (Ad) as a probe. Cisplatin is a widely used chemotherapeutic drug that induces both intrastrand and interstrand crosslinks in DNA. The host cell reactivation (HCR) assay examines the ability) of host cells to repair and hence, replicate cisplatin-damaged Ad DNA. This assay is believed to primarily be a measure of bulk nucleotide excision DNA repair. The cellular capacity assay examines the ability of cisplatin-damaged cells to support the replication of undamaged Ad DNA, and is thought to reflect the repair of the active cellular genes necessary for Ad replication. The repair of cisplatin-damaged DNA was studied in three human genetic syndromes -Roberts syndrome (RS), xeroderma pigmentosum (XP) and Li-Fraumeni syndrome (LFS). Fanconi's anemia (FA) cells were also used as a contml strain. RS is characterized by growth retardation, limb reductions and craniofacial abnormalities. Cell; from a subset of RS patients, termed RS+, are hypersensitive to several DNA-damaging agents, and it has been suggested that this hypersensitivity may result from a deficiency in the DNA repair capacity of these cells. (XP patients are sensitive to ultra violet light and are prone to the development of skin cancers. Cells from these patients are deficient in the nucleotide excision repair (NER) pathway responsible for repair of UV -induced lesions.) Patients with FA have a variety of congenital abnormalities, including a high susceptibility to leukemia. FA cells are sensitive to DNAcrosslinking agents such as mitomycin C (MMC) and cisplatin. Using the HCR and cellular capacity assays, deficiencies in DNA repair were detected in the XP and FA fibroblasts but not in the RS+ fibroblasts when compared to normal strains. The NERdeficient XP cells showed a significant reduction in both HCR of cisplatin-damaged Ad and in their capacity to support Ad replication following cellular cisplatin damage suggesting that cisplatin damage is repaired at least in part by the NER pathway. The normal HCR and capacity response of the RS+ cells compared to the XP cells suggests that the hypersensitivity of RS+ cells to DNA damage is not due to a deficiency in NER. The FA cells had normal HCR of cisplatin-damaged Ad but were significantly reduced in their capacity to support Ad replication following cisplatin treatment which was attributed to a defici,~ncy in the repair of DNA interstrand crosslinks. RS+ cells were not reduced in their capc.city to support Ad DNA replication, suggesting that the RS+ cellular hypersensitivity doe; not result from a deficiency in interstrand crosslink repair as seen with FA cells. LFS is a cancer prone syndrome that involves mutations in the p53 tumour suppressor gene. It was found that HCR of cisplatin-damaged Ad was normal in both p53-heterozygous and -hemizygous LFS cells, whereas the NER-deficient XP cells had significantly reduced HCR. The capacity of cisplatin-damaged, p53-heterozygous LFS fibroblasts was significantly reduced compared to normal cells. This suggests that although the LFS fibroblasts appear to have normal bulk NER, as shown by HCR, they appear to be deficier in the repair of the actively transcribed cellular genes necessary for viral replication. These results suggest a role for p53 in the repair of cisplatin damage of active genes. / Thesis / Master of Science (MS)

Récemment, notre laboratoire a démontré pour la première fois, que la protéine Damaged DNA Binding 2 (DDB2) possédait une activité régulatrice négative de l’expression basale de la superoxyde dismutase mitochondriale (SOD Mn) en se fixant sur un élément de réponse dans la région promotrice de son gène. Cette protéine était connue jusque là pour sa participation dans le système de réparation de l’ADN par excision de nucléotides. L’objectif de ce travail a été de définir précisément l’implication de ces deux protéines dans la croissance des cellules d’adénocarcinome mammaire, en développant des modèles cellulaires dont l’expression de la SOD Mn ou de la DDB2 est modulée expérimentalement. Nos résultats montrent pour la 1ère fois, que la SOD Mn est surexprimée dans les cellules tumorales mammaires insensibles aux oestrogènes (ER-) et ayant un pouvoir métastatique, et non dans les cellules épithéliales mammaires normales et les cellules ER+. L’inhibition de l’expression de la SOD Mn entraîne une stimulation de la croissance et une diminution de l’invasivité cellulaires, associées à une activité réduite de la métalloprotéinase 9. L’addition d’antioxydants, éliminant spécifiquement l’H2O2 issu de l’activité élevée de la SOD Mn, entraîne à la fois une inhibition de la croissance et du pouvoir invasif des cellules ER-. Ces résultats révèlent que la SOD Mn participe aux capacités invasives des cellules ER- via la production d’H2O2. Nous avons également montré pour la 1ère fois, que la DDB2 présente une activité oncogénique dans les cellules tumorales mammaires sensibles aux oestrogènes (ER+), non seulement parce que son gène est surexprimé, mais également parce qu’elle active leur prolifération en agissant sur la phase de transition G1/S et sur la progression dans la phase S du cycle cellulaire. Contrairement à la SOD Mn, l’expression de la DDB2 n’est pas observée dans les cellules tumorales mammaires ER-. De même à partir de biopsies provenant de patientes atteintes d’un cancer du sein, nous avons montré que la DDB2 est significativement plus exprimée dans les tumeurs les moins agressives et exprimant le récepteur aux oestrogènes. En montrant l’importance de la SOD Mn et la DDB2 dans la croissance et l’invasion des cellules tumorales mammaires, l’ensemble de ce travail révèle ainsi ces deux protéines comme des marqueurs prédictifs potentiels de la progression tumorale, et ouvre de nombreuses perspectives en cancérologie mammaire. / Recently, our laboratory demonstrated for the first time, that Damaged DNA Binding 2 (DDB2) played a role as a negative transcriptional regulator on the mitochondrial superoxide dismutase (MnSOD) expression through its binding to a specific DNA sequence located into the promoter of MnSOD gene. DDB2 was known as a protein which participates in the nucleotide excision repair of DNA. The goal of this study was to define precisely the involvement of the both proteins in the growth of mammary adenocarcinoma cells, using experimental procedures to modulate their expression in the breast cancer cell lines. Our results show for the first time that MnSOD is overexpressed in the estrogen receptor (ER) negative and metastatic breast tumor cells, but not in normal epithelial mammary cells and ER-positive tumor cells. Inhibition of MnSOD expression stimulates proliferation but decreases the invasive ability and the metalloproteinase 9 activity of tumor cells. Elimination of H2O2 from the elevated MnSOD activity by addition of specific antioxidants decreases proliferation as well as invasive ability of tumor cells, suggesting that the role of MnSOD in the invasive ability of tumor cells is mediated by H2O2. We have shown too for the first time that DDB2 has an oncogenic activity in the ER-positive breast tumor cells, because its gene is overexpressed and stimulates the proliferation by activating the entry of cells in the G1/S transition phase and the S phase progression. In contrast to MnSOD, DDB2 expression is not observed in ER-negative breast tumor cells, but is higher in ER-positive than in ER-negative tumor samples from patients with breast carcinoma. Taken together, our findings demonstrate that both MnSOD and DDB2 play a role in the growth and invasiveness of tumor cells and may become a promising candidate as a predictive markers in breast cancer. More studies will be need to define molecular mechanism controlling this activity of these both proteins.

Le laboratoire a récemment identifié la protéine Damaged-DNA-Binding 2 (DDB2), connue à l’origine pour son rôle dans la réparation de l’ADN comme une protéine impliquée dans la tumorigenèse mammaire. En effet, nous avons montré son rôle dans la croissance et la progression des tumeurs mammaires via la régulation transcriptionnelle de gènes cibles. Dans ce travail, nous avons montré que la surexpression de DDB2 augmente la sensibilité des cellules tumorales MDA-MB231 et SKBr3 traitées à la doxorubicine et au 5-fluorouracile (5-FU). Inversement, l’inhibition de l’expression de DDB2 dans les cellules T47D qui l’expriment naturellement s’accompagne d’une baisse de la sensibilité à ces agents anticancéreux. Nos résultats montrent que la sensibilité des cellules au 5-FU mais pas à la doxorubicine, lorsque DDB2 est surexprimée, dépend en partie du contrôle négatif qu’exerce cette dernière sur l’activité de NF-κB, en régulant positivement l’expression d’IκBα. Enfin, la recherche d’autres gènes cibles de DDB2, impliqués dans l’apoptose, nous a conduits à celui codant le facteur anti-apoptotique Bcl-2. DDB2 agit négativement sur l’expression de Bcl-2 en interagissant avec une région de l’ADN localisée dans le promoteur P2 du gène correspondant. De part, son rôle anti-apoptotique, la régulation de son expression pourrait bien être à l’origine de la sensibilité aux agents anticancéreux induite par DDB2. L’ensemble de ces résultats met donc en évidence l’intérêt clinique de DDB2 comme marqueur prédictif de la réponse aux agents anticancéreux, et devrait contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans l’échappement des cellules tumorales aux thérapies / The laboratory has recently identified the Damaged-DNA Binding 2 protein (DDB2), a protein involved in DNA repair, as an important actor in breast tumorigenesis. Our laboratory has shown that DDB2 is involved in breast tumor growth and progression through the transcriptional regulation of target genes. Thus, the first aim of this work was to study the role of DDB2 and its target genes in the response of breast cancer cells to anticancer drugs. We showed that DDB2 overexpressed in breast cancer cell lines, such as MDA-MB231 and SKBr3, increased the cells sensitivity to apoptosis induced by doxorubicin and 5-Fluorouracil (5-FU). Conversely, the inhibition of DDB2 expression in T47D cells, which express endogenously this protein, decreased cell sensitivity to anticancer agents. Our results showed that cell sensitivity induced by DDB2 expression to 5-FU but not doxorubicin depended on its ability to repress NF-κB activity via the regulation of IκBα expression. At last, the search of potential DDB2 target genes implicated in apoptosis has led us to identify the anti-apoptotic factor Bcl-2. We showed the ability of DDB2 to downregulate Bcl-2 expression via its interaction with DNA region located in P2 promoter of the corresponding gene. Results suggest that Bcl-2 dowregulation by DDB2 could be a major event that explains the enhanced sensitivity of cancer cells to therapeutic agents. Altogether, these data highlight the clinical interest of DDB2, as a predictive marker of the response to anticancer agents. A better understanding of its mode of action will contribute to improve therapeutic treatments and avoid their failure in resistant patients

La superoxyde dismutase à Manganèse (SOD Mn ou SOD2) est une enzyme importante dans la défense antioxydante, qui semble jouer un rôle mal défini dans le développement des tumeurs selon l’expression constitutive de son gène. Cependant, les mécanismes de régulation de cette expression constitutive sont mal connus, en particulier dans les cellules tumorales mammaires. Ce travail a reposé sur la mise en évidence préalable d’une protéine, appelée la Damaged DNA Binding 2 (DDB2) protein, se fixant spécifiquement sur la région promotrice du gène SOD2. La DDB2 est connue pour sa participation dans la réparation de l’ADN par excision de nucléotides. Dans un 1er temps, nous avons caractérisé la séquence d’ADN spécifiquement reconnue dans la région proximale du promoteur du gène SOD2, sur laquelle la DDB2 s’y fixe sous la forme d’un monomère, pour réguler négativement la transcription constitutive de la SOD Mn dans les cellules tumorales mammaires non métastatiques de type MCF-7. Par ailleurs, la DDB2 n’est pas impliquée dans le mécanisme d’induction du gène SOD2, lorsque les cellules MCF-7 sont exposées à des substances inductrices. En revanche, nous avons montré que l’absence de la protéine DDB2, associée à celle du facteur de transcription AP-2?, déjà connu comme répresseur du gène SOD2, entraîne une expression constitutive élevée de la SOD Mn dans les cellules tumorales mammaires métastatiques n’exprimant pas le récepteur aux œstrogènes (ER-). De plus, cette expression constitutive élevée est principalement dépendante du facteur de transcription Sp1. Dans un 2ème temps, nous avons évalué la signification biologique de la régulation de l’expression constitutive de la SOD Mn par la DDB2 dans les cellules tumorales mammaires. Nos résultats montrent que la DDB2 active la prolifération des cellules tumorales mammaires ER+, en exerçant sa régulation négative sur l’expression de la SOD Mn. Dans un 3ème temps, nous avons cherché à montrer les conséquences sur la croissance des cellules tumorales mammaires ER-, qui surexpriment naturellement la SOD Mn. Nos résultats révèlent que l’enzyme antioxydante joue un rôle important dans les mécanismes moléculaires impliqués dans le pouvoir invasif des cellules tumorales mammaires ER-. La surexpression de la SOD Mn, associée à un taux faible des enzymes éliminant l’H2O2, entraînent une augmentation du pouvoir invasif déjà élevé des cellules tumorales mammaires ER-, associée une augmentation de l’activité de la métalloprotéinase 9. L’élimination, en présence d’antioxydants, de l’H2O2 libéré par l’activité de la SOD Mn surexprimée, entraîne une inhibition à la fois de la croissance et des capacités invasives des cellules tumorales mammaires ER-. L’ensemble de ce travail contribue à mieux comprendre l’importance de la SOD Mn et du mécanisme de régulation de son gène dans la croissance et l’invasion tumorales. Ainsi ce travail révèle également la SOD Mn et la DDB2 comme de potentiels facteurs prédictifs de la progression tumorale mammaire. Enfin, la découverte de la nouvelle activité biologique de la DDB2 ouvre un vaste champ de perspectives intéressantes en cancérologie mammaire. / Manganese superoxide dismutase (Mn SOD or SOD2) is an important enzyme in the antioxidizing defence, which seems to play an unclear role in the cancer development, according to the constitutive expression of its gene. However, the regulation of this constitutive expression is not totally known, particularly in the breast cancer cells. This work is based on a preliminary revealing that a protein, called Damaged DNA Binding 2 (DDB2), specifically binds the SOD2 gene promoter. The DDB2 is known for its involvement in the nucleotide excision repair. At first step, we characterized the specific DNA sequence recognized in the proximal area of the SOD2 gene promoter, on which a DDB2 monomer binds, in order to regulate negatively the Mn SOD transcription in the MCF-7 non metastatic breast cancer cells. Besides, DDB2 is not involved in the mechanism of SOD2 gene induction, when MCF-7 cells are exposed to induced substances. However, we showed that the lack of the DDB2 protein, associated with the lack of the AP-2a transcription factor, already known as a repressor of the SOD2 gene, lead to a high Mn SOD constitutive expression in the metastatic breast cancer cells. Furthermore, this high constitutive expression is mainly dependent of the Sp1 transcription factor. Secondly, we estimated the biological meaning of the regulation of the Mn SOD constitutive expression by the DDB2 in the breast cancer cells. Our results show that the DDB2 activates the positive ER breast cancer cell proliferation, by exercising its negative regulation on the Mn SOD expression. Thirdly, we tried to show the consequences on the negative ER breast cancer cell growth, which naturally and highly express the Mn SOD. Our results reveal that the antioxidizing enzyme plays an important role in the molecular mechanisms involved in the invasive capacities of the negative ER breast cancer cells. The high Mn SOD expression, associated in a decrease of the H2O2 detoxifying enzymes expression, enhance the negative ER breast cancer cell invasion and an increase of the matrix metallopeptidase-9 activity. The H2O2 elimination, with specific antioxidants, decreases both negative ER breast cancer cell growth and invasive capacities. This whole work contributes to better understand the Mn SOD importance and the mechanism of its gene regulation, in the tumoral growth and invasion. This work also reveals the Mn SOD and DDB2 as potential predictive factors of the breast cancer progress. Finally, the discovery of this new DDB2 biological activity opens a huge field of interesting perspectives in breast cancer research.

L'auteur n'a pas fourni de résumé en français. / L'auteur n'a pas fourni de résumé en anglais.

abstract: Fluorescence spectroscopy is a popular technique that has been particularly useful in probing biological systems, especially with the invention of single molecule fluorescence. For example, Förster resonance energy transfer (FRET) is one tool that has been helpful in probing distances and conformational changes in biomolecules. In this work, important properties necessary in the quantification of FRET were investigated while FRET was also applied to gain insight into the dynamics of biological molecules. In particular, dynamics of damaged DNA was investigated. While damages in DNA are known to affect DNA structure, what remains unclear is how the presence of a lesion, or multiple lesions, affects the flexibility of DNA, especially in relation to damage recognition by repair enzymes. DNA conformational dynamics was probed by combining FRET and fluorescence anisotropy along with biochemical assays. The focus of this work was to investigate the relationship between dynamics and enzymatic repair. In addition, to properly quantify fluorescence and FRET data, photophysical phenomena of fluorophores, such as blinking, needs to be understood. The triplet formation of the single molecule dye TAMRA and the photoisomerization yield of two different modifications of the single molecule cyanine dye Cy3 were examined spectroscopically to aid in accurate data interpretation. The combination of the biophysical and physiochemical studies illustrates how fluorescence spectroscopy can be used to answer biological questions. / Dissertation/Thesis / Doctoral Dissertation Chemistry 2015

Ce travail de thèse vise à étudier l'endommagement de l'ADN, de la formation de lésions à leur réparation par des méthodes de modélisation moléculaire. Plusieurs projets ont pris forme dans ce contexte, lesquels peuvent être classés en trois grandes catégories. D'un côté, nous nous sommes intéressés la formation de lésions induites par des agents mutagènes. Nous avons étudié les mécanismes de formation de la 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8oxoG), mais aussi le caractère de photosensibilisateur endogène de la pyrimidine 6-4 pyrimidone (6-4PP), et la photosensibilisation de l'ADN par deux anti-inflammatoires : le kétoprofène et l'ibuprofène. D'un autre côté, les propriétés mécaniques de l'ADN endommagé ont été simulées. La structure de lésions complexes est d'une importance capitale pour comprendre la manière dont elles sont réparées. Malheureusement, seulement peu de structures RMN et cristallographiques sont disponibles à ce jour. Pour pallier à ce manque et obtenir des informations sur leur dynamique, nous avons étudié un panel de lésions complexes : les clusters de sites abasiques, les pontages inter-brins, et la photolésion 6-4PP. De même, nous nous sommes penchés sur les modes d'interaction de certaines polyamines avec l'ADN, ces molécules étant connues pour interagir avec la double hélice. Enfin, latroisième partie de cette thèse concerne les interactions ADN-enzyme de réparation. En perspective avec l'étude de clusters d'abasiques, nous avons étudié le comportement dynamique du même système, cette fois-ci en interaction avec l'endonucléase APE1. Nous nous sommes également penchés sur les interactions entre la glycosylase Fpg avec un oligonucléotide contenant un tandem de lésions 8-oxoG d'un côté, etun cluster de lésions 8-oxoG - site abasique de l'autre. Ces multiples projets ont permis l'accumulation de nouvelles connaissances à propos des lésions complexes de l'ADN, et ont également apporté un appuicomputationnel aux expérimentations, qui peuvent se révéler très délicates dans ce domaine. Nos résultats ouvrent de larges perspectives dans le domaine de la pharmacologie, la cosmétique et plus généralementla compréhension du vivant / This thesis work is focused on the theoretical modelling of DNA damages, from formation to repair. Several projects have been led in this framework, which can be sorted into three different parts. One on hand, we studied complex DNA reactivity. It included a study about 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8oxoG) mechanisms of formation, a project concerning the UV-induced pyrimidine 6-4 pyrimidone (6-4PP) endogenous photosensitizer features, and an other one about DNA photosensitizationby nonsteroidal anti-inflammatory drugs (ie ketoprofen and ibuprofen). On the other hand, we investigated mechanical properties of damaged DNA. The structural signature of a DNA lesion is of major importance for their repair, unfortunately only few NMR and X-ray structures of such systems are available. In order to gain insights into their dynamical structure, we investigated a series of complex damages : clustered abasic sites, interstrand cross-links, and the 6-4PP photolesion. Likewise, we studied the interaction modes DNA with several polyamines, which are well known to interact with the double helix, but also with the perspective to model DNA-protein cross-linking. The third part concerned the study of DNA interactions with repair enzymes. In line with the structural study about clustered abasic sites, we investigated the dynamics of the same system, but this time interacting with the APE1 endonuclease. We also studied interactions between the Fpg glycosylase with an oligonucleotides containing tandem 8-oxoG on one hand and 8-oxoG - abasic site as multiply damaged sites. Thus, we shed new lights on damaged DNA reactivity, structure and repair, which provides perspectives for biomedicine and life's mechanisms understanding as we begin to describe nucleosomal DNA

La compréhension des mécanismes à l’origine de la progression métastatique des tumeurs mammaires reste une préoccupation constante en cancérologie et nécessite la découverte de nouveaux marqueurs prédictifs. Dans ce sens, le laboratoire a montré que la protéine DDB2 (Damaged-DNA Binding 2) était impliquée dans la tumorigenèse mammaire, en favorisant la prolifération et en réduisant le pouvoir invasif des cellules tumorales. Les propriétés invasives des cellules étant étroitement liées à leurs capacités d’adhérence, nous nous sommes intéressés au rôle de DDB2 dans l’adhérence des cellules tumorales mammaires. L’étude des propriétés d’adhérence et mécaniques a révélé une baisse de l’adhérence des cellules exprimant DDB2 sur des supports neutres ainsi qu’une augmentation de l’élasticité membranaire, associées une baisse du réseau d’actine corticale. Afin de comprendre les mécanismes mis en jeu, une analyse transcriptomique a été réalisée et révèle une diminution du niveau d’expression du gène codant le TGFß1 dans les cellules exprimant DDB2. Ainsi dans un second temps, nous avons étudié l’influence de DDB2 sur la voie du TGFß1. Nos résultats montrent que DDB2 inhibe transcriptionnelle des Smads en se fixant à proximité des éléments de réponse des Smads entraînant ainsi une diminution de leur présence sur le promoteur de leur gène cible. L’ensemble de ces résultats indique que DDB2 modulerait les propriétés nanomécaniques membranaires des cellules tumorales mammaires et la voie de signalisation induite par le TGFß1. Ce travail confirme donc l’importance clinique de la protéine DDB2 en tant que nouveau marqueur prédictif de la progression métastatique dans le cancer du sein / Understanding of mechanisms allowing metastatic progression remains a major issue in cancer research and requires discovery of new predictive markers. Thus, the laboratory has highlighted that DDB2 protein (Damaged-DNA Binding 2) is an important factor in breast tumorigenesis, by increasing proliferation and reducing invasive abilities of breast tumor cells. Migratory and invasive properties being closely related to adhesive properties, the aim of this work has been to study the involvement of DDB2 in breast cancer cell adhesion. First, adhesive and mechanical properties have been assessed, and reveal that DDB2 expression is associated with a decrease of adhesion on neutral surfaces, a decrease of cell stiffness in DDB2-expressing cells, related to the loss of cortical actin cytoskeleton. To understand molecular mechanisms involved in DDB2-dependent modulation of these properties, a transcriptomic study has been performed and shows the transcript level of gene encoding TGFß1 is modulated according to DDB2 expression level. Second, we have studied the influence of DDB2 on the TGFß signaling pathway. Our results show that DDB2, inhibits Smads transcriptional activity by binding near Smads responsive elements and decreasing so their binding on target genes promoter. Taken together, these data indicate that DDB2 could modulate nanomechanical properties of breast tumor cell membranes and the TGFß1 signaling pathway. The present work also confirms the clinical importance of DDB2 in breast tumorigenesis as a new predictive marker of metastatic progression of breast cancer

Le potentiel des nanoparticules d'or (AuNPs) pour améliorer l’efficacité de la radiothérapie est démontré par de nombreuses études expérimentales in vivo et in vitro. Ces particules métalliques augmentent significativement l’effet de la radiosensibilisation. La réaction en jeu est la radiolyse de l’eau: une fois excitées par un rayon X, elles génèrent des espèces réactives oxygénées qui amplifient les dégâts d’ADN et mènent à une plus grande destruction des cellules cancéreuses. Cependant, pour une efficacité thérapeutique plus optimale, plusieurs propriétés des AuNPs doivent être prises en compte lors de la synthèse comme leur taille, leur forme et leur surface qui sont suspectibles d’influencer ses effets catalytiques dans l’environnement biologique (majoritairement de liquide d’eau). Ces aspects structuraux ne sont pas encore examinés dans l’état de l’art, ni expérimentalement ni théoriquement. Ce travail de thèse a pour but de rationaliser la stabilité de AuNPs dans un environnement chimique ou biologique avant l’irradiation par des outils de modélisation théorique. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés à la stabilité des AuNPs dans la gamme de 1- 3.4 nm. Nous étudions ensuite le comportement de ces nanoparticules dans un environnement biologique (hydratation) et chimique modèle (PEGylation), et la combinaison des deux environnements. Quand les nanoclusters de 0.9-1.8 nm sont en interaction avec une couche de molécules d’eau à saturation, nous avons montré qu’il y a une transformation de NPs métastables (dans le vide) telles que l'ino-décaèdre en NPs métastables plus favorables telles que l'icosaèdre. Alors qu’en présence d’une couche de ligands PEG, la liaison forte Au-S et les liaisons hydrogène entre les ligands entraînent une déformation significative de la morphologie de la nanoparticule, à savoir une stellation du décaèdre Au54. Par ailleurs, nous avons montré que les ligands PEG promeuvent le confinement de quelques molécules d’eau à proximité des AuNPs. Nos conclusions ouvrent des perspectives intéressantes pour la modélisation théorique de la radiolyse de l’eau. Parallèlement à ces études, nous nous sommes intéressés à la caractérisation de différents types de lésions d’ADN. Deux projets ont été menés: premièrement, nous démontrons l’interaction d’un peptide trilysine avec un oligonucléotide qui pourrait conduire à la formation de pontage d’ADN-polyamine. Ensuite, le deuxième projet porte sur la rationalisation de différents taux de réparation de dimères de cyclobutanemathide iochella pyrimidine en présence de l’enzyme de reconnaissance DDB2 à l’échelle atomique. / The potential of gold nanoparticles (AuNPs) to improve the performance of radiotherapy is demonstrated by numerous in vivo and in vitro experimental studies. These metallic particles increase significantly the radiosensitization effect. Upon water radiolysis, AuNPs generate reactive oxygen species that amplify DNA damage and lead to a greater destruction of cancerous cells. Nevertheless, for a more optimal therapeutic efficacy, several properties of AuNPs must be taken into account during the synthesis, such as their size, shape and surface which can tune their catalytic effects in the biological environment (mainly liquid water). These structural aspects are not yet examined in the state-of-the-art, either experimentally or theoretically. This thesis aims to rationalize the stability of AuNPs in the presence of chemical or biological environment before irradiation by using theoretical approaches. Firstly, we have modeled the stability of AuNPs in the range 1- 3.4 nm. We have then studied the behavior of these nanoparticles in a biological (hydration) and chemical (PEGylation) model environment, and the combination of the two environments. When 0.9-1.8 nm nanoclusters interact with a complete shell of water molecules, we have shown that metastable ino-decahedrons (in vacuum) are transformed into more favourable metastable icosahedrons. While in the presence of monoshell of PEG ligands, the strong Au-S bond and the hydrogen bonds between the ligands induce a significant deformation on the nanoparticle morphology, i.e. stellation of the Au54 decahedron. In addition, we have shown that PEG ligands promote the confinement of a few water molecules in the vicinity of AuNPs. Our conclusions open interesting perspectives for the theoretical modeling of water radiolysis. In parallel with these studies, we have focused on the characterization of different types of DNA lesions. Two projects have been performed: firstly, we have studied the interaction of a trilysine peptide with an oligonucleotide which could lead to the formation of DNA-polyamine cross link. Then, the second project focuses on rationalizing different repair rates of cyclobutane pyrimidine dimers in the presence of the DDB2 recognition enzyme at the atomic scale.

Le laboratoire a identifié récemment la protéine DDB2 comme ayant une activité dans la régulation de l’expression de gènes cibles tels que SOD2, BCL2 et NFKBIA, conférant ainsi à cette protéine un rôle dans le contrôle de la progression métastatique et dans la réponse thérapeutique des cellules tumorales mammaires. Cependant, l’activité réelle de DDB2 dans la transcription génique reste à définir, car sa structure ne permet pas d’expliquer son influence sur l’expression de ses gènes cibles. Cette activité peut être soit inhibitrice comme pour SOD2 et BCL2, soit activatrice comme NFKBIA qui code la protéine IκBα, suggérant que DDB2 doit s’associer avec des inhibiteurs ou des activateurs de la transcription génique, ou en favoriser le recrutement. Afin d’identifier ces partenaires potentiels, susceptibles de participer à son activité transcriptionnelle, nous avons développé une approche de « DNA pull-down », couplée à une analyse protéomique globale par spectrométrie de masse à partir des cellules tumorales mammaires MCF-7 surexprimant naturellement DDB2. Nous avons révélé la présence du complexe UV-DDB (DDB2, DDB1 et Cul4A) sur le promoteur des gènes SOD2 et NFKBIA. Nous avons également mis en évidence que ce complexe, connu pour participer aux premières étapes de la réparation de l’ADN lésé par des rayonnements UV, favorise le recrutement de l’histone acétyl transférase p300 sur le promoteur du gène NFKBIA, expliquant en partie le rôle activateur de DDB2 sur ce gène cible. Notre analyse protéomique à révéler, avec un score élevé, la présence des protéines hnRNP K et J sur le promoteur du gène NFKBIA et d’une manière indépendante de toute interaction physique avec DDB2. La forme J, très peu décrite, présente une affinité plus grande pour le promoteur du gène NFKBIA que la forme K. De plus, nous l’avons observée strictement nucléaire et liée à la chromatine. De manière intéressante, nous montrons que la forme J est surexprimée dans le noyau des cellules tumorales MDA-MB231 métastatiques, comparativement aux cellules T47D non métastatiques. Par la suite, nous avons évalué l’importance des hnRNP K et J dans la transcription du gène NFKBIA par rapport à DDB2 et un régulateur bien décrit tel que le facteur de transcription Sp1. Nos résultats indiquent que les protéines hnRNP K et J, lorsqu’elles sont surexprimées, jouent un rôle de répresseur du gène NFKBIA et ce même en présence des activateurs DDB2 et Sp1. L’ensemble de ce travail a contribué à montrer la présence de protéines, pouvant participer à l’activité transcriptionnelle de DDB2, telles que le complexe UV-DDB et p300. En dehors de tout partenariat avec DDB2, il a été mis en évidence une relation entre les hnRNP K et J et l’activité constitutive de NF-κB, en particulier avec la forme J, qui, par son expression corrélée à l’agressivité des cellules tumorales mammaires, présente un intérêt clinique potentiel en tant que marqueur prédictif de la progression métastatique, tout comme DDB2 / The laboratory has recently identified the DDB2 (Damaged-DNA Binding 2) protein as a regulator of target gene expression like SOD2, BCL2 and NFKBIA, thus conferring to this protein a role in control of metastatic progression and therapeutic response of breast cancer cells. However, the real activity of DDB2 in gene transcription remains to be defined because its structure cannot entirely explain its influence on target gene expression. This protein can act either as an inhibitor like for the SOD2 and BCL2 genes or as an enhancer like for the NFKBIA gene, encoding IκBα protein. This suggests that DDB2 must associate with, or promote recruitment, of inhibitors or activators of gene transcription. In order to search and identify potential partners that could participate in its transcriptional activity, we developed a “DNA pull-down” approach associated with a global proteomic analysis by mass spectrometry from MCF-7 breast cancer cells overexpressing naturally DDB2. With this approach, we reveal the presence of the UV-DDB complex composed by DDB2, DDB1 and Cullin 4A proteins on the SOD2 and NFKBIA gene promoters. We also highlighted that this complex, known for its role in first steps of UV-induced DNA lesion repair, promotes the recruitment of the p300 histone acetyl transferase on the NFKBIA gene promoter, which may explain, in part, the enhancer activity of DDB2 on this target gene. The proteomic analysis from the “DNA pull-down” also reveals, with originality, the presence of heterogeneous ribonucleoproteins K and J (hnRNP K and J) on the NFKBIA gene promoter with a high recovery score among many other proteins and independently of any physical interaction with DDB2. The J form, very poorly described, shows a higher affinity for NFKBIA gene promoter than the K form. Furthermore, we observed that the J form is strictly nuclear and mostly bound to chromatin, while the K form is also found in cytoplasm. Interestingly, we show that the J form is overexpressed in nucleus of metastatic breast cancer MDA-MB231 cells by comparison with non-metastatic breast cancer T47D cells. Then, we evaluated the importance of hnRNP K and J proteins in NFKBIA gene transcription compared with DDB2 and with a well-known regulator, the Sp1 transcription factor. Our results show that hnRNP K and J proteins, when they are overexpressed, play a repressor role on NFKBIA gene expression by binding on its promoter even in presence of DDB2 and Sp1 activators. Taken together, these data show that some proteins could participate in DDB2 transcriptional activity, like the UV-DDB complex and the p300 protein. Outside of any interaction with DDB2, this work highlights a relationship between the hnRNP K and J proteins, and NF-κB constitutive activity, especially with the J form. This latter has an expression correlated with aggressiveness of breast cancer cells and a potential clinical interest as a predictive marker of metastatic progression, like DDB2