Les microorganismes photosynthétiques suscitent un intérêt biotechnologique important pour la production de dihydrogène. La cyanobactérie Synechocystis sp. PCC 6803 est capable d'initier une photoproduction d'hydrogène catalysée par une hydrogénase [NiFe] bidirectionnelle qui se présente sous la forme d'un complexe pentamérique (HoxEFUYH). Toutefois l'inhibition de cette enzyme par l'oxygène émis par le photosystème II rend cette photoproduction transitoire et constitue un verrou majeur au développement de tels procédés. L'exploitation de ces organismes impose une meilleure compréhension des bases moléculaires associées à la sensibilité de l'hydrogénase envers l'oxygène ainsi que des composantes limitant son activité de production d'H2, ce qui implique la connaissance détaillée des jeux d'interactions avec ses partenaires physiologiques NAD(P)+/NAD(P)H.Diverses substitutions d'acides aminés potentiellement impliqués dans la sensibilité de l'enzyme à l'O2 et situés au cœur du site actif (Ileu64, Leu107, Leu112) de la sous-unité catalytique HoxH ont été réalisées. Les résultats in vitro et in vivo indiquent une sensibilité envers l'O2 moindre chez le mutant I64M, qui présente une diffusion limitée et un biais vers l'activité de production d'H2.L'étude des interactions de mutants de délétion des gènes diaphorase hoxE et hoxF avec les cofacteurs NAD(P) a montré que NAD+/NADH semblent être les partenaires privilégiés de l'hydrogénase pour le transfert d'électrons, tandis que le NADPH a un effet activateur sur l'enzyme.Ces études apportent des éléments importants pour envisager une optimisation ciblée et maîtrisée pour la bioproduction d'H2. / Oxygenic photosynthetic organisms are a matter of great biotechnological interest for the production of dihydrogen using what seem to be infinite resources, water and solar energy. The cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 encodes a bidirectional [NiFe] hydrogenase consisting of a pentameric complex (HoxEFUYH) that allows it to carry H2 photoproduction. However, it is a transient process, mainly due to the oxygen sensitivity of hydrogenases, O2 being produced at PSII during photosynthesis. Future exploitation of these organisms in bioprocesses requires a better understanding of the molecular bases of O2 sensitivity of the hydrogenase and of the elements limiting H2 evolution which involves detailed knowledge of the interactions of the enzyme with its physiological partners NAD(P)+/NAD(P)H.Various mutants of the Synechocystis hydrogenase were created by genetic engineering, targeting specific amino acid residues (Ileu64, Leu107, Leu112) in the catalytic subunit HoxH identified as putative critical elements for O2 sensitivity. Results obtained in vitro and in vivo indicate that the substitution I64M slightly improves O2 tolerance and alters gas diffusion kinetics with a bias towards H2 production. Studying the interaction of diaphorase gene-deletion mutants hoxF and hoxE with partners NAD(P) showed that NAD+/NADH are the preferential electron acceptor/donor of the hydrogenase, while NADPH is more efficient for enzyme activation.These studies provide first insights on the determinants of the oxygen sensitivity of the hydrogenase of Synechocystis and its activation, which are critical elements to consider in targeted optimization for bioproduction of H2.

L'effet de voisinage radio-induit s'observe dans les cellules voisines de cellules irradiées mais non directement touchées par l'irradiation. A ce jour, les espèces réactives de l'oxygène (EROs) sont considérées comme ayant un rôle actif dans la survenue de réponse au voisinage, mais leur implication n'est pas encore totalement définie. Afin de déterminer leur impact dans la réponse au voisinage, à la fois temporellement et spatialement, des irradiations par microfaisceau de particules sont mises au point afin de cibler une fraction définie de cellules au niveau du noyau dans une culture cellulaire. Les irradiations sont pratiquées sur des cellules normales ostéoblastiques, à sous-confluence, nommées MC3T3-E1. L'observation directe de la génération d'EROs cellulaires et mitochondriales révèle que la réponse bystander est caractérisée par un stress cellulaire d'origine double et temporellement distinct. A court terme, la signalisation issue de la membrane induit une importante production d'EROs impliquée dans l'apparition de cassures double brin de l'ADN retardées. Les mitochondries produisant des EROs jusque 6 heures après l'irradiation semblent être impliquées dans un processus à long terme différent. L'étude indépendante de la réponse des cellules ciblées et voisines met en évidence un phénomène nouveau. L'effet de voisinage induit une réponse des cellules voisines mais est aussi impliqué dans une amplification de la réponse des cellules ciblées par l'irradiation. Ainsi toute cellule, irradiée ou non, peut recevoir ces signaux bystander et répondre. L'ensemble de cette étude mène à considérer les cultures cellulaires comme des réseaux complexes de communication; leurs réponses à l'irradiation indiquent une relation mêlée entre signaux relatifs à l'irradiation elle-même et réponse au voisinage. Cette complexité du phénomène d'effet de voisinage peut justifier que son incidence sur l'établissement de règles de radioprotection et sur la courbe linéaire sans seuil n'est pas encore clairement déterminée.

Le point clé des polymérisations radicalaires et/ou cationiques réside dans la génération des radicaux et/ou des cations qui amorcent la réaction. Ces derniers sont formés par transformation, via absorption de lumière, d'un composé photosensible. Puisque la majorité des réactions de polymérisation se produisent en système ouvert, on conçoit l'importance de trouver des solutions aux inconvénients liés à la présence de l'air lors de la réticulation. Durant ce travail, de nouvelles séries de molécules de type silanes, germanes, complexes boranes ... ont été examinées. On va s'intéresser aussi aux systèmes d'amorçage de type I et II. Nous nous intéresserons aussi à la polymérisation induite par la lumière visible ou solaire. Notre objectif consiste à développer des systèmes dont la sensibilité spectrale s'étend vers de grandes longueurs d'onde. Les molécules étudiées au cours de ce travail semblent être très favorables en tant que photoamorceurs ou co-amorceurs pour la polymérisation radicalaire ainsi que pour la polymérisation cationique. La plupart de ces structures se sont montrées plus efficaces que les références utilisées. Le travail de cette thèse s'articule autour de deux grandes parties : La première partie relative à la polymérisation radicalaire contient également une étude bibliographique et se divise en trois chapitres. La deuxième partie relative à la polymérisation cationique se divise en sept chapitres. Une annexe sera donnée à la fin de ce manuscrit et regroupe les différentes techniques expérimentales.

Ce travail porte sur la réalisation et la caractérisation d'électrodes pour piles à combustible (PAC). L'approche bottom-up adoptée associe par voie liquide des nanoparticules de platine enrobées par des molécules (NP) et des nanotubes de carbone (NT) préformés afin d'obtenir une dispersion liquide de nanocomposite. Ce procédé permet de contrôler dans une large gamme la couverture des nanotubes de carbone par les nanoparticules de platine. Puis, par filtration sur feutre de carbone nous obtenons des électrodes de PAC avec des couches actives de compositions très diverses (1 à 300 g Pt/cm², épaisseurs de 10 à 80 µm). Nous avons ensuite qualifié ex situ ces électrodes à l'aide de paramètres pertinents dont l'un est directement associé à la réduction de l'oxygène. Nous avons utilisé la voltampérométrie cyclique dans les conditions où les électrodes sont imprégnées d'électrolyte et calculé ces paramètres pour chaque électrode. Des différences observées dans ces paramètres entre deux méthodes d'imprégnation des électrodes ont révélé l'importance des modulations de mouillabilité des couches actives avec le rapport massique NP/NT et la nature de l'enrobage des nanoparticules. Cela débouche sur la possibilité de réaliser des électrodes modèles permettant à terme d'optimiser la gestion des points triples et donc l'utilisation du catalyseur dans les électrodes de PAC. Des tests en pile avec nos électrodes illustrent ainsi la possibilité de diminuer à l'avenir de manière très significative les densités de platine dans les PAC.

Le contrôle des pathologies est un élément primordial pour réduire les risques en élevage larvaire de mollusques bivalves. Il requiert une connaissance précise des maladies, des pathogènes et de leur mode d'action. Une nouvelle espèce de vibrio pathogène pour les larves de P. maximus, Vibrio pectenicida a été décrite par des caractères phénotypiques et génotypiques. Elle appartient au groupe de V. splendidus dans lequel se retrouvent d'autres nouvelles espèces pathogènes. La pathogénie de V. pectenicida a été étudiée en histologie et par des infections expérimentales sur des élevages larvaires conventionnels et axéniques. Ces études ont confirmé le caractère pathogène des souches de V. pectenicida et l'absence de symptômes spécifiques de la maladie. En ultrastructure, la localisation des bactéries à l'intérieur des tissus et de cellules peut être expliquée par un phénomène de translocation. L'activité toxique des vibrios pathogènes se manifeste vraisemblablement par des facteurs internes à la bactérie. En effet, une action létale de lysats bactériens de Vibrionaceae, et principalement de la fraction cytoplasmique, a été mise en évidence sur des larves axéniques. L'existence de facteurs toxiques internes a été confirmée par l'utilisation d'un test de chimioluminescence (CL) sur des hémocytes d'adultes. En effet, l'activité inhibitrice observée avec les bactéries entières, a été retrouvée dans la fraction cytoplasmique des vibrios pathogènes. D'après des essais de purification partielle, un des facteurs toxiques doit être une petite molécule (moins de 3kDa), hydrophile, résistante aux protéases, aux acides et à la chaleur. Cette toxine est éloignée des toxines bactériennes déjà décrites. Les relations entre l'immunité des adultes, très résistants aux attaques bactériennes, et celles des larves ont été abordées à partir de deux expériences: une infection expérimentale provoquée par une souche proche de V. splendidus sur des P. maximus adultes et l'injection de V. pectenicida à des animaux adultes entraînant la baisse de réactivité des hémocytes. Enfin quelques applications pratiques ont été proposées pour éviter l'utilisation d'antibiotiques durant la phase larvaire.

Au cours de ce travail de recherche, nous nous sommes intéressés à la réaction d'hydrosilylation asymétrique de diverses cétones aromatiques catalysée par des complexes chiraux du cuivre. Un premier système catalytique mis au point à partir du fluorure de cuivre (II) et du ligand (S)-BINAP (1 mol %) a permis d'atteindre 92 % d'excès énantiomérique en alcools chiraux obtenus. L'aspect fondamental de ce procédé réside dans l'effet accélérateur de l'oxygène. Nous avons alors mis au point une méthode de réduction de diverses cétones aromatiques dans des conditions douces et à l'air. Un deuxième système catalytique, plus efficace en termes de réactivité et de sélectivité, mis au point à partir de fluorure de cuivre (I) et de ligands diphosphines chiraux a permis de réduire de façon catalytique et énantiosélective diverses cétones aromatiques. L'effet accélérateur de l'oxygène est nettement plus marqué comparé au système au fluorure de cuivre (II). L'optimisation est réalisée en présence de ligands encombrés de la famille de la MeO-BIPHEP. Une méthode de réduction de cétones aromatiques pratique, douce, efficace, sélective (jusqu'à 95 % e.e.) et avec des taux catalytiques particulièrement intéressants (< 0,05 mol %) est alors proposée. L'étude mécanistique entreprise nous a permis de préciser certaines étapes du cycle catalytique envisagé pour cette réaction et de souligner la complexité de la réaction étudiée. Mots-clés : catalyse asymétrique, hydrosilylation asymétrique, hydrure de cuivre, effet de l'oxygène, étude mécanistique. / During this research work, we have studied the asymmetric hydrosilylation reaction of various aromatic ketones catalysed by chiral copper complexes. The first system, based on copper fluoride (II) and (S)-BINAP as ligand (1 mol %), allowed us to achieve up to 92% e.e. in chiral alcohols. The fundamental aspect of this reaction is based on the accelerating effect of oxygen. A smooth method of various aromatic ketones was therefore established under air atmosphere. A second catalytic system, based on copper fluoride (I) and diphosphine ligands, was developed. This system was found to be more efficient in terms of reactivity and selectivity for the reduction of various aromatic ketones than the first system. An increase in sensitivity to the accelerating effect of the oxygen was observed with this copper (I) system. Some optimisations have shown than hindered ligands such as MeO-BIPEPH furnish up to 95% e.e. in the presence of a very low catalytic loading (< 0,05 mol %). Those conditions allowed the reduction of aromatic ketones in practical, soft, efficient and selective conditions. The mechanistic study enabled us to get a better understanding of the catalytic cycle but also pointed out the complexity of the reaction. Keywords: asymmetric catalysis, asymmetric hydrosilylation, copper hydride, oxygen effect, mechanistic investigation.

Les exosomes sont de petites vésicules membranaires secrétées dans le milieu extracellulaire principalement par les cellules hématopoïétiques. Le mécanisme menant à leur biogenèse commence à être élucidé, mettant en jeu la machinerie endosomale et la formation d'un endosome multivésiculaire (EMV). La fusion de cet EMV avec la membrane plasmique conduit à la libération des vésicules internes dans le milieu extracellulaire. Différentes études ont permis d'attribuer un rôle physiologique dans la présentation du peptide antigénique aux exosomes libérés par les cellules présentatrices d'antigène. <br />Ce travail montre que la sécrétion d'exosomes au cours de la maturation du réticulocyte est un processus issu d'un programme cellulaire permettant un remodelage membranaire en éliminant spécifiquement certaines protéines devenues inutiles voire dangereuses pour la cellule en fin de différenciation. Nos résultats suggèrent qu'une fois libérés dans la circulation sanguine, les exosomes de réticulocyte sont éliminés par un mécanisme similaire à celui impliqué dans la clairance des corps apoptotiques. L'action d'une iPLA2 d'origine endosomale et activable à la fois par les espèces réactives de l'oxygène libérées lors de la mitoptose et par la caspase-3 présente dans les vésicules permet la formation de lysophosphatidylcholine (LPC) à la surface des exosomes. Cette LPC est alors reconnue par les IgMs naturelles présentes dans la circulation, activant à leur tour la voie du complément. De la même façon, ApoH interagit avec les exosomes de réticulocyte et pourrait contribuer à leur élimination via la reconnaissance de phosphatidylsérine. La liaison de ces différentes opsonines en surface des exosomes pourrait en effet permettre leur ingestion par les phagocytes.

Iron Regulatory Protein 1 (IRP1) est une protéine cytosolique dont le rôle est de réguler la concentration de fer intracellulaire chez les métazoaires par un mécanisme post-transcriptionnel. Elle interagit avec certains ARN messagers au niveau de motifs spécifiques appelés IRE (Iron Responsive Element) situés dans leurs régions non traduites et modifie la synthèse des protéines correspondantes. En présence de fer, IRP1 perd cette capacité de fixation, intègre un agrégat [4Fe-4S] et acquiert une activité aconitase. La régulation s'effectue donc par un processus d'assemblage et de désassemblage du centre fer-soufre.<br />La réactivité de la protéine recombinante IRP1 humaine, purifiée sous sa forme aconitase [4Fe-4S], a été étudiée vis à vis d'autres effecteurs que le fer capables de modifier l'activité des IRP. Ainsi des excès assez modestes de diverses espèces réactives de l'oxygène ne peuvent former que l'espèce [3Fe-4S] de la protéine. La doxorubicine, un composé cytostatique utilisé comme anti-cancéreux, a une action sur IRP1, mais elle dépend des conditions d'application et implique certainement des mécanismes multiples. In vitro, IRP1 est complètement activée pour la fixation d'ARN par un fort excès de 2-mercaptoéthanol. Parmi les diverses causes possibles de cet effet, les propriétés de solvant de ce produit (comme de l'éthanol) en sont responsables.<br />La recherche d'éventuels partenaires physiologiques de la protéine IRP1 a été entreprise par une étude double hybride chez la levure Saccharomyces cerevisiae, mais les constructions utilisées n'ont pas permis de déterminer de candidats potentiels. L'utilisation d'autres constructions ainsi que d'autres systèmes double hybride est envisagée pour la poursuite de cette étude.<br />Une nouvelle méthode de dosage de l'activité de fixation au motif IRE a été envisagée par l'utilisation d'un substrat fluorescent et de l'électrophorèse capillaire. Les résultats préliminaires obtenus n'ont pas encore abouti, mais ils contribuent à donner des orientations pour le développement de cette méthode présentant de nombreux avantages.<br />Des changements de conformation entre les deux formes actives de IRP1 ont été analysés par deux méthodes structurales en solution. La formation de certains éléments de structure secondaire d'IRP1 dépend de l'état d'activité de la protéine et ils sont sensibles à la fixation des substrats. Les propriétés hydrodynamiques d'IRP1 varient aussi lors de ces différents changements. Faute de structure à haute résolution, ces informations permettent toutefois de se représenter le comportement structural d'IRP1 dans son rôle de régulateur.

La radiothérapie est utilisée seule ou en association avec la chimiothérapie dans le traitement de plus de 50% des cancers. En dépit des nombreux progrès dans le but d'améliorer le rapport bénéfice/risque, l'irradiation est à l'origine de nombreux effets secondaires. Une des origines connues des cancers de la thyroïde est l'exposition pendant l'enfance aux radiations ionisantes, soit accidentelles, soit suite à un traitement par radiothérapie externe pour une autre pathologie. Les mécanismes par lesquels les radiations ionisantes provoquent l'apparition d'un cancer de la thyroïde sont nombreux et encore incomplètement connus. Les radiations ionisantes sont des agents génotoxiques qui induisent des dommages au niveau de l'ADN telles que des cassures et des aberrations chromosomiques. Bien que les mécanismes qui sous-tendent ces effets ne soient pas complètement compris, il est généralement admis que les radiations ionisantes induisent des dommages à l'ADN soit de manière directe soit de manière indirecte en générant des espèces réactives de l'oxygène (ROS). Durant ma thèse, nous avons étudié le rôle des ROS produit lors de l'irradiation dans la génération des dommages à l'ADN dans les cellules thyroïdiennes. Nos résultats montrent que les ROS produites après irradiation participent à la formation des réarrangements chromosomiques RET/PTC1 retrouvés dans 70% des cancers papillaires radioinduits. Les ROS engendrées par la radiolyse de l'eau ont une durée de vie extrêmement courte ce qui limite leur diffusion. Néanmoins, par des mécanismes redox, ils provoquent des modifications au niveau cellulaire qui conduisent à leur tour à l'activation de systèmes générateurs de ROS, parmi lesquels on trouve les NADPH oxydases. Nos résultats montrent que l'irradiation induit l'expression de la NADPH oxydase DUOX1 via la sécrétion d'IL-13, plusieurs jours après l'exposition aux radiations ionisantes. L'inactivation de DUOX1 par ARNs interférents diminue de manière significative les dommages de l'ADN observés plusieurs jours après irradiation. Ces résultats suggèrent un rôle de DUOX1 dans le stress oxydatif chronique qui contribue à l'instabilité génétique.

La cachexie est un syndrome complexe caractérisé par une balance énergétique négative. Le rôle joué par le métabolisme énergétique mitochondrial dans ce syndrome est peu connu. Nos précédents travaux montraient une diminution de la synthèse de l’ATP dans les mitochondries hépatiques en stade de cachexie cancéreuse sévère. Dans ce travail, nous démontrons, in vitro, que l’augmentation de la production d’espèce réactive de l’oxygène et du contenu en cardiolipine dans des mitochondries hépatiques saines, mime partiellement les mécanismes observés lors d’un stade cachexie sévère. Nous observons cependant que l’altération du métabolisme mitochondrial hépatique apparait à un stade tardif du développement de la cachexie. En stade sévère les mitochondries musculaires ne développent pas d’altération de leur efficacité de synthèse d’ATP mais une diminution des leurs capacités oxydatives. / Cancer cachexia is a composite syndrome, characterized by a negative energetic balance. The role played by mitochondrial energetic metabolism in this syndrome is poor known. Our past work showed a decrease of ATP synthesis efficiency in hepatic mitochondria in severe state of cancer cachexia. In this work, we demonstrate, in vitro, that increase of reactive oxygen species and cardiolipine content, in healthy mitochondria, can partly mimic the mechanisms observed in severe state of cancer cachexia. We observe that alteration of hepatic mitochondrial metabolism appear last during the development of cancer cachexia. In sever state of cancer cachexia, skeletal muscle mitochondria don’t develop this alteration but demonstrated a decrease of oxidative capacities.