Le marquage isotopique par le deutérium et le tritium est largement utilisé en chimie, en biologie ainsi qu’en recherche pharmaceutique.De nombreuses méthodes de marquage par échange isotopique permettent d’atteindre des enrichissements isotopiques élevés, mais elles requièrent généralement l’utilisation de conditions drastiques (température élevée, acidité). Ainsi, une méthode générale de marquage, régiosélective et douce, applicable à une grande variété de substrats, reste encore à développer. Dans le premier volet de cette thèse, nous avons montré que des nanoparticules de ruthénium (RuNP@PVP), synthétisées par l’équipe du Pr. Bruno Chaudret (INSA Toulouse), catalysaient avec une grande efficacité la réaction d’échange H/D sur des amines, des pyridines et des indoles par C‒H activation, sous 2 bars de D2 à 55 °C. L’application à la deutération de huit molécules azotées d'intérêt biologique a montré que la réaction était efficace sans pour autant altérer l’intégrité chimique ou stéréochimique des composés. Cependant, le respect de la stéréochimie originelle d’un centre chiral C‒H activé demeurait un problème majeur. Nous avons donc entrepris l’étude de la réactivité des RuNP@PVP sur différentes classes de substrats azotés chiraux (amines, aminoacides et peptides) dans l’eau ou dans des solvants organiques. Nos résultats ont montré sans ambiguïté que la C-H activation des carbones C(sp3) chiraux s’effectuait efficacement, sélectivement et dans tous les cas avec une rétention totale de configuration. La large gamme d’application de cette procédure a été démontrée par le marquage de 3 amines chirales, 14 aminoacides naturels, 3 aminoesters aromatiques et 4 peptides. D’autre part, notre collaboration avec l’équipe du Pr. Romuald Poteau (INSA Toulouse) a permis d’identifier deux mécanismes réactionnels par simulation ab initio en parfait accord avec nos résultats expérimentaux : le mécanisme par métathèse de liaison σ et le mécanisme d’addition oxydante. Ces deux mécanismes impliquent deux atomes de ruthénium voisins agissant ensemble pour conduire à la formation d’un intermédiaire-clé original dimétallacycle à quatre centres.Le second volet de cette thèse est consacré au développement d’une nouvelle méthode de détermination de la conformation et de l’arrangement relatif de petites molécules auto-assemblées. Elle repose sur la synergie entre chimie de marquage, RMN du tritium à l’état solide et modélisation moléculaire. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés au dipeptide diphénylalanine (Phe-Phe) qui, selon le solvant utilisé, peut former des cristaux (structure résolue) ou s’auto-assembler en nanotubes dont la structure atomique reste inconnue. Trois dipeptides Phe-Phe ditritiés sur des positions aromatiques, définies à l’aide de la modélisation moléculaire par le Dr. Yves Boulard (CEA Saclay), ont été synthétisés. La RMN du tritium à l’état solide a permis au Dr. Thibault Charpentier (CEA Saclay) de mesurer, sur des échantillons cristallisés, trois distances inter-tritiums très proches des distances de référence. Cette technique a également mis en évidence un éventuel désordre d’orientation d’un cycle aromatique de Phe-Phe cristallisé. Une modélisation ab initio nous a également incités à entreprendre un double marquage Caryl et Cα de Phe-Phe, ce dernier utilisant les nanoparticules de ruthénium. Les essais de marquage au deutérium avec RuNP@PVP sont très encourageants et des études complémentaires sont en cours dans notre laboratoire pour parvenir au marquage au tritium. Ainsi, nous espérons mettre au point un nouvel outil d’étude structurale permettant d’accéder à la structure atomique de petites molécules intégrées dans des ensembles supramoléculaires complexes (nanotubes, peptides amyloïdes ou membranaires). / Isotopic labeling with deuterium and tritium is extensively used in chemistry, biology and pharmaceutical research.Numerous methods of labeling by isotopic exchange allow high isotopic enrichments but generally require harsh conditions (high temperatures, acidity). As a consequence, a general, regioselective and smooth labeling method that might be applicable to a wide diversity of substrates remains to develop. In the first part of this thesis, we demonstrated that the use of ruthenium nanoparticles, synthesized by Pr. Bruno Chaudret’s team (INSA Toulouse), allowed the mild (2 bar of deuterium gas at 55°C), effective and selective H/D exchange reaction of a large variety of nitrogen-containing compounds, such as pyridines, indoles and primary, secondary and tertiary alkyl amines. The usefulness and the efficiency of this novel methodology was demonstrated by the deuteration of eight nitrogen-containing molecules of biological interest without altering their chemical and stereochemical properties. However, the conservation of the original stereochemistry of an activated chiral C-H center remains a major issue. We studied the reactivity of RuNP@PVP on different categories of nitrogen-containing substrates (amines, aminoacids and peptides) in water or in organic solvents. Our results showed that C-H activation of chiral carbons C(sp3) took place efficiently, selectively and, in all cases, with total retention of configuration. The wide range of applications of this procedure was demonstrated by the labeling of three chiral amines, fourteen aminoacids, three aromatic aminoesters and four peptides. Moreover, our collaboration with Pr. Romuald Poteau’s team (INSA Toulouse) led to the identification of two mechanisms by ab initio simulation in agreement with our experimental results: the σ-bond metathesis mechanism and the oxidative addition mechanism. These two mechanisms imply two vicinal ruthenium atoms leading to the formation an original dimetallacycle key-intermediate with four centers.The second part of this thesis deals with the development of a new method for the determination of the conformation and the relative arrangement of auto-assembled small molecules. It is based on the synergy between labeling chemistry, tritium solid-state NMR and molecular modeling. We focused on the diphenylalanine dipeptide (Phe-Phe) which forms either crystals or self-assembled nanotubes depending on the solvent. If the crystalline atomic structure of Phe-Phe has been solved, the structure of the self-assembled nanotubes of Phe-Phe is still unknown. Three Phe-Phe dipeptides ditritiated on aromatic positions, determined with the help of molecular modeling by Dr. Yves Boulard (CEA Saclay), were synthesized. Tritium solid-state NMR allowed Dr. Thibault Charpentier (CEA Saclay) to measure, on crystallized samples, three inter-tritiums distances very close to the reference distances. This technique also revealed a possible orientational disorder on an aromatic cycle of crystallized Phe-Phe. Ab initio modeling led us to set a double labeling Caryl and Cα on Phe-Phe with ruthenium nanoparticles. Deuteration with RuNP@PVP are very promising and supplementary studies are in progress to perform tritium labeling. We expect to set a new tool of structural study to determine atomic structures of small molecules integrated in supramolecular complexes (nanotubes, amyloid peptides or membranes).

Ce travail de thèse porte sur le développement de méthodes de spectrométrie de masse (MS) structurale pour la caractérisation de systèmes protéiques complexes, souvent réfractaires aux approches biophysiques classiques. Dans ce contexte, les développements entrepris furent notamment focalisés sur la caractérisation de complexes impliqués dans la biogénèse des ribosomes et dans la régulation transcriptionnelle, fonctions cellulaires essentielles pouvant être liées à de nombreuses pathologies humaines dont certains cancers. Ainsi, les approches par MS native, pontage chimique et d’HDX-MS ont permis de renseigner sur la connectivité, les proximités spatiales ou encore la dynamique conformationnelle retrouvées au sein des complexes étudiés. Parmi ces techniques, l’HDX-MS permet une approche comparative basée sur les mesures d’incorporations en deutérium renseignant sur la dynamique conformationnelle d’une protéine sous différents états. Aussi, la combinaison d’approches de MS structurale a permis d’approfondir la caractérisation des systèmes complexes étudiés, démontrant ainsi l’intérêt d’une approche intégrative dans ce contexte. / This PhD thesis focuses on developing methods in structural mass spectrometry (MS) to characterize complex protein systems, given their size and their heterogeneity, frequently inaccessible by classical biophysic approaches. In this context, methodological developments have particularly focused on the characterization of protein complexes involved in ribosomes biogenesis and transcriptional regulation. These fundamental cellular processes are related to numerous diseases such as cancers and genetic diseases. Thus native MS, crosslink, and hydrogen/deuterium exchange coupled to MS (HDX-MS) allowed gaining insights about the stoechiometry, spatial proximities and conformational dynamics of studied systems. Among these approaches, HDX-MS enables a comparative approach based on deuterium incorporation measurements giving information about the conformational dynamics of labeled proteins in various experimental conditions. Finally, the combination of structural approaches enables to deeply characterize complex protein systems, highlighting the advantages of an integrative approach in this context.