Submitted by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2016-09-22T14:22:35Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Carmem Lucia dos Santos Machado.pdf: 2830040 bytes, checksum: e257722fc7ff4b644add8fc45c9be5cd (MD5) / Approved for entry into archive by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2016-09-22T14:22:57Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Carmem Lucia dos Santos Machado.pdf: 2830040 bytes, checksum: e257722fc7ff4b644add8fc45c9be5cd (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-22T14:22:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Carmem Lucia dos Santos Machado.pdf: 2830040 bytes, checksum: e257722fc7ff4b644add8fc45c9be5cd (MD5) Previous issue date: 2016-06-24 / A apocinina é uma acetofenona que apresenta estrutura pequena e possui diversas atividades biológicas. Sua estrutura pode ser oxidada em certas condições químicas ou biológicas e resultar na formação do seu dímero, a diapocinina. As chalconas são compostos que contém em sua estrutura básica a porção 1,3-diarilpro-2-em-1-ona e se caracterizam por apresentar ampla variedade de atividades biológicas, como atividade antioxidante e antibacteriana. Estudos demostram que modificações estruturais nos anéis aromáticos das chalconas resultam na obtenção de compostos com atividade aceptora de radicais e antibacterianas. Neste trabalho foram realizadas a síntese de chalconas derivadas da apocinina e diapocinina, a avaliação da atividade antioxidante e antibacteriana. Adicionalmente foram realizados estudos de modelagem molecular, determinação de propriedades físico-químicas e a avaliação da toxicidade in silico, com a finalidade de se obter compostos que possam ser utilizadas como protótipos a novos fármacos. As chalconas derivadas da apocinina e da diapocinina, com substituintes 4-OCH3, 3,4-OCH3, e 3,4,5-OCH3 ligados ao anel B, e não substituída (H), foram sintetizadas através da condensação de Claisen-Schmidth, dos benzaldeídos com a apocinina e diapocinina, em meio básico, temperatura ambiente, por 24 horas. Ao final de cada reação, os compostos foram analisados e purificados por recristalização ou em cromatografia em coluna. Os compostos foram caracterizados por CCD, ponto de fusão, espectroscopia de infravermelho (IV), e por 1H e 13C RMN. A análise de capacidade aceptora de radicais das moléculas sintetizadas, foram realizadas através do emprego do método colorimétrico de análise do DPPH e ABTS, utilizando como padrão BHT e Trolox, respectivamente, nas concentrações 6,75, 12,5, 25, 50, 100, 200 e 400 μM. A avaliação da atividade antibacteriana dos compostos obtidos foi realizada através do método de difusão ágar-cilindro e leitura de halos de inibição, onde foram testadas as cepas de Staphylococcus aureus ATCC 25923 (bactéria Gram positiva) e Escherichia coli ATCC 25922 (bactéria Gram negativa), utilizando como padrão o antibiótico cloranfenicol. A análise de toxidade in silico, como a genotoxidade, mutagenicidade, efeitos irritante e sobre sistema reprodutor, foi realizado através do programa computacional Osiris Property Explorer. Os compostos apresentaram atividade aceptora do radical DPPH e ABTS na faixa de concentração de 400 a 12,5μM, sendo superiores ao padrão de BHT e Trolox. No ensaio de avaliação da atividade antibacteriana todos os compostos apresentaram atividade antibacteriana frente à cepa Staphylococcus aureus, sendo, no entanto, inferior ao padrão cloranfenicol. Não foi observada atividade contra a cepa Escherichia coli. A partir da análise da toxicidade in silico observou-se que somente os compostos que tinham grupamentos OCH3 substituídos em posição para, apresentaram risco médio e alto para efeito irritante e tóxico para o sistema reprodutor. Os demais compostos apresentaram risco teórico baixo de desenvolver os efeitos tóxicos citados. Diante dos resultados obtidos, observa-se que as chalconas derivadas da apocinina e diapocinina se apresentam como compostos promissores para o estudo e o desenvolvimento de agentes com atividade antioxidante, com ação antibacteriana e baixa toxicidade teórica, sendo assim demonstrando potenciais agentes para se utilizar na terapêutica. / The apocynin is an acetophenone which has little structure and has several biological activities. Its structure can be oxidized in certain chemical or biological conditions and result in the formation of the dimer, the diapocinina. The chalcones are compounds containing in its basic structure portion 1,3-diaryl-pro-2-en-1-one and are characterized by having variety of biological activities such as antibacterial and antioxidant activity. Studies show that structural modifications on the aromatic rings of chalcones result in obtaining the compounds with acceptor radical and antibacterial activity. In this work were performed chalcones derived synthesis of apocynin and diapocinina, the evaluation of antioxidant and antimicrobial activity. It was also performed molecular modeling studies, determination of physicochemical properties and toxicity evaluation in silico, in order to obtain compounds which can be used as prototypes of new drugs. The derivatives of the chalcones and apocynin diapocinina, substituents 4-OCH3, 3,4-OCH3, and 3,4,5-OCH3 attached to B ring, unsubstituted (H) were synthesized by Claisen-Schmidth condensation, of benzaldehydes with apocynin and diapocinina, in basic medium at room temperature for 24 hours. After each reaction, the compounds were analyzed and purified by recrystallization or column chromatography. The compounds were characterized by TLC, melting point, infrared spectroscopy (IR) and 1H and 13C NMR. The acceptor capacity analysis of radical synthesized molecules were carried out by employing the colorimetric method of analysis of DPPH and ABTS using standard as BHT and Trolox, respectively, at concentrations 6.75, 12.5, 25, 50, 100 200 and 400 uM. The evaluation of the antibacterial activity of the obtained compounds was performed by the method of agar-cylinder diffusion and reading inhibition zones, where Staphylococcus aureus ATCC 25923 (Gram positive bacterium) and Escherichia coli ATCC 25922 (Gram negative bacteria) were tested using as standard antibiotic chloramphenicol. The analysis of in silico toxicity, such as genotoxicity, mutagenicity, and irritating effects on reproductive system, was performed using the computer program Osiris Property Explorer. The compounds showed acceptor activity of DPPH and ABTS radical in the concentration range of 400 to 12,5μM, being superior to the standard of BHT and Trolox. The evaluation of the antibacterial activity test all compounds showed antibacterial activity against Staphylococcus aureus strain being, however, lower than the standard chloramphenicol. There was no activity against Escherichia coli strain. From the analysis of in silico toxicity it was observed that only compounds which had OCH3 groups substituted in the para position, exhibited medium and high risk of irritating and toxic effect on the reproductive system. Other compounds showed low theoretical risk of developing toxic effects reported. Considering the results, it is observed that the derivatives of apocynin and diapocinina chalcones present as promising compounds for the study and development of agents having antioxidant activity, antibacterial action and low theoretical toxicity, thus demonstrating potential agents for use in therapy.

O osteossarcoma (OS) é o tumor maligno primário mais comum do tecido ósseo, caracterizado pela formação de osteócitos anormais. Apesar do avanço nas terapias convencionais (quimioterapia e retirada do tumor), essas não conseguem eliminar totalmente as células tumorais e impedir a progressão da doença. Recentemente, agentes derivados de fontes naturais ganharam considerável atenção por causa de sua segurança, eficácia e disponibilidade imediata. Nesse sentido, a apocinina, inibidor do complexo NADPH-oxidase, vem sendo estudada como agente antitumoral em alguns tipos de câncer como: pâncreas, próstata, pulmão e mama. Apocinina é um pró-fármaco e sua ação parece estar relacionada à sua conversão produzindo a diapocinina, a qual se mostrou mais efetiva do que a apocinina. Portanto, o objetivo desse estudo é avaliar, in vitro, o potencial antitumoral da apocinina e diapocinina em células de osteossarcoma humano. Para isso, foram utilizados osteoblastos humanos normais (HOb) e osteossarcoma humano imortalizadas (SaOS-2) tratados ou não com apocinina e diapocinina em diversas concentrações. Foram realizados os ensaios de viabilidade celular, alterações morfológicas, apoptose celular, produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), formação de colônias, migração, invasão e expressão do fator indutor de hipóxia-1alfa (HIF-1). Também foram conduzidos ensaios para verificar a atividade de metaloproteinase de matriz (MMP) 2 e 9. Os resultados em SaOS-2 mostraram que o tratamento com apocinina nas concentrações de 1,5 e 3 mM; e diapocinina nas concentrações de 0,75 e 1,5 mM reduziram a viabilidade; aumentaram o número de células em apoptose e diminuíram a produção de EROs; sem causar danos às células HOb. Além disso, essas mesmas concentrações inibiram a migração e invasão celular; diminuíram a expressão de HIF-1; e reduziram a atividade de MMP-2 em SaOS-2. Considerando os resultados obtidos, concluímos que a apocinina e diapocinina podem atuar como possíveis moduladores de células tumorais, sendo que a diapocinina mostrou ser mais efetiva nos parâmetros testados. / Osteosarcoma (OS) is the most common primary malignant tumor of bone tissue, characterized by the formation of abnormal osteocytes. Despite advances in conventional therapies (chemotherapy and surgery) they cannot completely eliminate tumor cells and prevent the progression of the disease. Recently, agents derived from natural sources have achieved considerable attention because of their safety, efficacy and immediate availability of therapies. In this way, apocynin, an inhibitor of the NADPH-oxidase complex, has been studied as an antitumor agent in some types of cancer, such as pancreas, prostate, lung and breast. Apocynin is a prodrug and its action indicate to be related to its conversion to diapocynin, which has been shown to be more efficient than apocynin itself. Thus, the aim of this study is to evaluate, in vitro, the antitumor potential of apocynin and diapocynin in human osteosarcoma cells. For this, normal human osteoblasts (HOb) and immortalized human osteosarcoma cells (SaOS-2) were treated or no-treated with apocynin and diapocynin in various concentrations. Cell viability assay, morphological alterations, cellular apoptosis, reactive oxygen species (ROS) production, colony formation, migration, invasion and expression of hypoxia-inducible factor-1 alpha (HIF-1) were performed. We also performed assays to verify the activity of matrix metalloproteinase (MMP) 2 and 9. The results in SaOS-2 showed that treatment with apocynin at concentrations of 1,5 e 3 mM; and diapocynin at concentrations of 0,75 e 1,5 mM reduced cell viability; increased the number of cells in apoptosis and decreased the production of ROS; without damaging HOb cells. Moreover, these same concentrations inhibited cell migration and invasion; decreased HIF-1 expression; and reduced MMP 2 activity in SaOS-2. Considering the results, we suggest that apocynin and diapocynin may act as possible modulators of tumor cells, and diapocynin has been shown to be more effective.

O osteossarcoma (OS) é o tumor maligno primário mais comum do tecido ósseo, caracterizado pela formação de osteócitos anormais. Apesar do avanço nas terapias convencionais (quimioterapia e retirada do tumor), essas não conseguem eliminar totalmente as células tumorais e impedir a progressão da doença. Recentemente, agentes derivados de fontes naturais ganharam considerável atenção por causa de sua segurança, eficácia e disponibilidade imediata. Nesse sentido, a apocinina, inibidor do complexo NADPH-oxidase, vem sendo estudada como agente antitumoral em alguns tipos de câncer como: pâncreas, próstata, pulmão e mama. Apocinina é um pró-fármaco e sua ação parece estar relacionada à sua conversão produzindo a diapocinina, a qual se mostrou mais efetiva do que a apocinina. Portanto, o objetivo desse estudo é avaliar, in vitro, o potencial antitumoral da apocinina e diapocinina em células de osteossarcoma humano. Para isso, foram utilizados osteoblastos humanos normais (HOb) e osteossarcoma humano imortalizadas (SaOS-2) tratados ou não com apocinina e diapocinina em diversas concentrações. Foram realizados os ensaios de viabilidade celular, alterações morfológicas, apoptose celular, produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), formação de colônias, migração, invasão e expressão do fator indutor de hipóxia-1alfa (HIF-1). Também foram conduzidos ensaios para verificar a atividade de metaloproteinase de matriz (MMP) 2 e 9. Os resultados em SaOS-2 mostraram que o tratamento com apocinina nas concentrações de 1,5 e 3 mM; e diapocinina nas concentrações de 0,75 e 1,5 mM reduziram a viabilidade; aumentaram o número de células em apoptose e diminuíram a produção de EROs; sem causar danos às células HOb. Além disso, essas mesmas concentrações inibiram a migração e invasão celular; diminuíram a expressão de HIF-1; e reduziram a atividade de MMP-2 em SaOS-2. Considerando os resultados obtidos, concluímos que a apocinina e diapocinina podem atuar como possíveis moduladores de células tumorais, sendo que a diapocinina mostrou ser mais efetiva nos parâmetros testados. / Osteosarcoma (OS) is the most common primary malignant tumor of bone tissue, characterized by the formation of abnormal osteocytes. Despite advances in conventional therapies (chemotherapy and surgery) they cannot completely eliminate tumor cells and prevent the progression of the disease. Recently, agents derived from natural sources have achieved considerable attention because of their safety, efficacy and immediate availability of therapies. In this way, apocynin, an inhibitor of the NADPH-oxidase complex, has been studied as an antitumor agent in some types of cancer, such as pancreas, prostate, lung and breast. Apocynin is a prodrug and its action indicate to be related to its conversion to diapocynin, which has been shown to be more efficient than apocynin itself. Thus, the aim of this study is to evaluate, in vitro, the antitumor potential of apocynin and diapocynin in human osteosarcoma cells. For this, normal human osteoblasts (HOb) and immortalized human osteosarcoma cells (SaOS-2) were treated or no-treated with apocynin and diapocynin in various concentrations. Cell viability assay, morphological alterations, cellular apoptosis, reactive oxygen species (ROS) production, colony formation, migration, invasion and expression of hypoxia-inducible factor-1 alpha (HIF-1) were performed. We also performed assays to verify the activity of matrix metalloproteinase (MMP) 2 and 9. The results in SaOS-2 showed that treatment with apocynin at concentrations of 1,5 e 3 mM; and diapocynin at concentrations of 0,75 e 1,5 mM reduced cell viability; increased the number of cells in apoptosis and decreased the production of ROS; without damaging HOb cells. Moreover, these same concentrations inhibited cell migration and invasion; decreased HIF-1 expression; and reduced MMP 2 activity in SaOS-2. Considering the results, we suggest that apocynin and diapocynin may act as possible modulators of tumor cells, and diapocynin has been shown to be more effective.

Submitted by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2018-09-24T15:01:09Z No. of bitstreams: 1 CAMILA COELHO RODRIGUES.pdf: 1765480 bytes, checksum: b3f50f8973734acade5a9396b1aafebf (MD5) / Approved for entry into archive by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2018-09-24T15:03:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 CAMILA COELHO RODRIGUES.pdf: 1765480 bytes, checksum: b3f50f8973734acade5a9396b1aafebf (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-24T15:03:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CAMILA COELHO RODRIGUES.pdf: 1765480 bytes, checksum: b3f50f8973734acade5a9396b1aafebf (MD5) Previous issue date: 2018-07-13 / A apocinina apresenta estrutura pequena e possui diversas atividades biológicas, sua estrutura pode ser oxidada em certas condições e resultar na formação do seu dímero, a diapocinina. Como um potencial agente terapêutico, análogos estruturais da diapocinina, contendo grupos substituintes ligados a esta molécula, podem apresentar atividade neuroprotetora e aceptora de radicais. As chalconas apresentam estrutura química 1,3-diaril-2-propen-1-ona simples que permite variadas modificações estruturais com a finalidade de otimizar o perfil farmacológico ou direcioná-las para diferentes atividades biológicas. A resposta de maior destaque é a capacidade aceptora de radicais e atividade neuroprotetora. Neste trabalho foram realizadas a síntese e caracterização da diapocinina e seus derivados, a avaliação das propriedades físico-químicas e da atividade aceptora de radicais, estudos de modelagem e docking molecular, toxicidade in silico e in vivo, com a finalidade de se obter compostos que possam ser empregados como candidatos a novos fármacos aceptores de radicais e antiparkinsonianos. A diapocinina foi sintetizada a partir da apocinina e caracterizada por CLAE, espectroscopia IV, e RMN 1H e 13C. As chalconas derivadas da diapocinina com substituintes 4-Cl, 4-N(CH3)2, 4-OCH3 e 4-NO2, foram sintetizadas através da condensação de Claisen-Schmidt. A análise de capacidade aceptora de radicais foi realizada através do ensaio de DPPH utilizando como padrão BHT. A análise de toxidade in silico, especificamente o risco de causar genotoxidade, mutagenicidade, efeitos irritante e sobre sistema reprodutor, foi realizado através dos programas computacionais Osiris Property Explorer e admetSAR. Os estudos de docking molecular foram realizados utilizando o software iGemdock 2.1 e envolveu a avaliação de ligação individual da apocinina e diapocinina. Os protocolos experimentais pré-clínicos in vivo de avaliação de atividade frente a sintomas de doença de Parkinson foi realizado com Drosophila melanogaster. A apocinina demonstrou capacidade de captura de DPPH maior que seu dímero, sugerindo-se que este composto se apresenta como melhor candidato para o desenvolvimento de compostos com atividade antioxidante potencial. A partir da análise da toxicidade in silico observou-se que somente os compostos 4-N(CH3)2 e 4-NO2 apresentaram riscos de causar os efeitos mutagênicos e genotóxicos, sendo que os demais compostos apresentaram risco teórico baixo. Os resultados obtidos no estudo de docking molecular permitiram a obtenção de modelos teóricos onde a apocinina e a diapocinina não possuem ligação no mesmo sitio de interação. Assim sugere-se que estruturas químicas possam, de maneira simultânea, atuar no mesmo alvo, mas em sítios adjacentes de interação. A avaliação da atividade frente a sintomas da doença de Parkinson realizada através de ensaio de sobrevivência, toxicidade e comportamento com Drosophila melanogaster constata que tanto a apocinina e diapocinina são compostos promissores para o estudo e o desenvolvimento de agentes para se utilizar na terapêutica, com atividade neuroprotetora. / Apocynin is phenolic compound with a small structure which exhibit diverse pharmacological activities. Aromatic ring structure can be oxidized under enzymatic or in oxidizing medium generating its dimer, diapocinin. Structural analogues of diapocinin are considering a potential therapeutic agent, and depending on substituent moieties attached to this molecule. Chalcones have a simple chemical 1,3-diaryl-2-propen-1-one structure which allows structural modifications aiming the optimization of the broad recognized pharmacological profile or to reach some different biological activities. Oxygen radical acceptor (antioxidant) and neuroprotective are highlighted biological activities observed to these class of compounds and they were studied in this research. In this work, the synthesis and characterization of diapocinin and its chalcone derivatives, the evaluation of physicochemical properties and radical acceptor activity, molecular modeling and docking studies, in silico and in vivo toxicity, and evaluation of Parkinson’s disease in Drosophila melanogaster protocols were performed in order to support the new antioxidant and antiparkinsonian drugs. Diapocinin was synthesized from apocynin and characterized by HPLC, IR spectroscopy, and 1H and 13C NMR. Chalcones derived from diapocinin, with 4-Cl, 4-N(CH3)2, 4-OCH3 and 4-NO2, were synthesized by the condensation of Claisen-Schmidt. Radical acceptor evaluation was performed usign DPPH assay using BHT as standard. In silico toxicity analysis, specifically the risk of causing genotoxicity, mutagenicity, irritant effects and activity on the reproductive system, were performed using Osiris Property Explorer and admetSAR. Molecular docking studies were performed using iGemdock 2.1 software, and this study involved the evaluation of individual binding of apocynin and diapocinin and alfa-synuclein and NADPH oxidase. In vivo preclinical experimental protocols of activity against Parkinson's disease symptoms were performed with Drosophila melanogaster. Apocynin demonstrated higher DPPH radical capture than diapocynin, suggesting that this compound is the best candidate for the development of compounds with potential antioxidant activity. From the analysis of in silico toxicity, it was observed the 4-N(CH3)2 and 4-NO2 compounds presented risks of causing the mutagenic and genotoxic effects, and the other compounds presented low theoretical risk. The results obtained in the molecular docking study allowed the generation of theoretical models which the apocynin and diapocinin not show binding or interactions in the same molecular protein site. Thus, it is suggested that chemical structures may, simultaneously, act on the same target, but in adjacent sites of interaction. The evaluation of activity against Parkinson's disease symptoms performed by survival, toxicity and behavior assays with Drosophila melanogaster suggest the both apocynin and diapocinin are promising compounds for the study and development of agents to be used in therapy, with neuroprotective activity.