PIERDONÁ, Taiana Magalhães. Avaliação das atividades antiagregante plaquetária e anticoagulante em estudo de bioprospecção de Opercutina macrocarpa (L.) Urb. (Jalapa) em plasma humano : determinação do mecanismo de ação. 2011. 124 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2011. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-03-08T12:01:26Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_tmpierdoná.pdf: 2122526 bytes, checksum: f682e2203eb4dc5950da2fee4524dca5 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2013-03-12T14:08:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_tmpierdoná.pdf: 2122526 bytes, checksum: f682e2203eb4dc5950da2fee4524dca5 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-12T14:08:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_dis_tmpierdoná.pdf: 2122526 bytes, checksum: f682e2203eb4dc5950da2fee4524dca5 (MD5) Previous issue date: 2011 / Operculina macrocarpa (L.) Urb ("Brazilian jalapa") (Convolvulaceae) is a common species of the Brazilian Northeast. It is popularly used because of its laxative and purgative properties. The tincture of Operculina macrocarpa tubers (major constituent) and Convolvulus scammonia composes the raw materials of Aguardente Alemã®, herbal medicine, referred to as antithrombotic in folk medicine. The objective of this study was to investigate the antiplatelet and anticoagulant potential for Operculina macrocarpa in human plasma, including the bioprospection study and determination of possible mechanism of action. The evaluation of antiplatelet activity of drugs (tincture and fractions of O. macrocarpa, tincture of C. scammonia and AAL) in human platelet-rich plasma (PRP) was measured by the turbidimetric method where the aggregation was induced by the addition of agonists (adenosine diphosphate (ADP), epinephrine (EPI), arachidonic acid (AA) collagen (COL) or thrombin (TROM). Unlike tincture of C. scammonia and AAL, both O. macrocarpa tincture (TOM/preciptade (P) and supernatant (S)) and one of the organic fractions obtained from O. macrocarpa (TOM/1-F4) showed antiplatelet activity in human plasma where TOM/1-F4 (100 µg/mL) presented comparable effect to AAS. Physicochemical characterization (HPLC and spectrophotometer) of TOM/PS (content of resins 1,38g%) and TOM/1-F4 allowed the identification of phenolic acids (chlorogenic, galic and caffeic) as well as the determination of total phenols of TOM (0,14g%). The antiplatelet effect of TOM/PS and TOM/1-F4 seems to result from many intracellular actions. However, TOM/PS in presence of AAS, L-ARG, ODQ, pentoxifilin (PTX) or ticlopidine (TIC) had its antiplatelet effect modified mainly because of TIC, suggesting an important role of purinergic receptors in TOM/PS. TOM/PS presented antioxidant activity determined by DPPH test. Furthermore, TOM/PS and TOM/1-F4 did not showed anticoagulant action in human plasma but TOM/PS increased the bleeding time in mice. It was observed a relative toxicity of TOM/PS in human neutrophil. Therefore, this study demonstrated, as never before, the antiplatelet potencial of tincture and the organic fraction of "jalapa" and that at least related to the presence of phenols, particulary phenolic acids, and resins in plant. / Operculina macrocarpa (L.) Urb. (“jalapa brasileira”) (Convolvulaceae) é uma espécie comum do Nordeste brasileiro, sendo popularmente utilizada pelas suas propriedades laxativa, purgativa e “depurativa”. A tintura do tubérculo de jalapa, matéria-prima majoritária, ao lado da tintura de Convolvulus scammonia (TCS) compõem o fitoterápico Aguardente Alemã® (AAL) ou Tintura de Jalapa Composta, indicada como antitrombótico na medicina popular. O objetivo do presente trabalho foi investigar o potencial antiagregante plaquetário e anticoagulante de O. macrocarpa em plasma humano, incluindo estudo de bioprospecção e determinação do possível mecanismo de ação. A avaliação da atividade antiagregante plaquetária das drogas testes (tintura e frações de O. macrocarpa, TCS e AAL) em plasma humano rico em plaquetas (PRP) foi mensurada por método turbidimétrico, sendo a agregação induzida por vários agonistas como difosfato de adenosina (ADP), epinefrina (EPI), ácido araquidônico (AA), colágeno (COL) ou trombina (TROM). Ao contrário da TCS e da AAL, tanto a tintura de O. macrocarpa (TOM/precipitado(P) e sobrenadante(S)) quanto uma das frações orgânicas obtidas da planta (TOM/1-F4) mostraram atividade antiagregante plaquetária, onde a TOM/1-F4 (100 µg/mL) apresentou efeito comparável ao ácido acetilsalicílico (AAS). Caracterização físico-química (CLAE e espectrofotometria) da TOM/PS (teor de resinas 1,38g%) e da TOM/1-F4 permitiu a identificação de ácidos fenólicos (clorogênico, gálico e caféico), bem como a determinação do teor de fenóis totais da TOM (0,14g%). O efeito antiagregante plaquetário da TOM/PS e da TOM/1F-4 parece resultar de várias ações intracelulares. Contudo, a TOM/PS na presença do AAS, L-ARG, ODQ, pentoxifilina (PTX) ou ticlopidina (TIC) teve seu efeito antiagregante plaquetário modificado principalmente pela TIC, sugerindo um papel importante dos receptores purinérgicos na bioatividade da TOM/PS. A TOM/PS apresentou atividade antioxidante determinada através do teste do DPPH. Além disso, a TOM/PS e a TOM/1F-4 não mostraram ação anticoagulante em plasma humano, mas a TOM/PS aumentou o tempo de sangramento em camundongos. Foi observada uma toxicidade relativa da TOM/PS em neutrófilo humano. Dessa forma, o presente estudo comprovou, de maneira inédita, o potencial antiagregante plaquetário da tintura e da fração orgânica de jalapa, que estão pelo menos em parte relacionados à presença de fenóis, particularmente ácidos fenólicos, e resinas na planta.

The aims of this work were to produce and investigate the properties of NaYP2O7 and NaY0.99Ln0.01P2O7 (Ln = Ce, Sm, Eu, Tb and Yb) polycrystalline samples. The synthesis was done via a modified sol-gel method using PVA as polymeric agent. In order to obtain single crystalline phase, it was necessary to use molar ratio Na:Y:P = 1.15:1:2, which is not the stoichiometric, with two calcination steps at 400 ºC / 4 h and 600 ºC / 4 h. Structural characterizations of the synthesized material were performed by X-ray Diffraction and Absorption (XRD and XAS). It was observed that the dopant ions were incorporated into the matrix without changing the structure. Under VUV excitation, the undoped sample presented a luminescent emission spectrum which was attributed to self-trapped exciton recombination. On the other hand, the photoluminescence (PL) of doped samples presented the emission lines characteristic of each dopant. From the photoluminescence excitation curves, 4f-5d transitions were identified for Ce3+, Sm3+ and Tb3+ doped samples and charge transfer processes were noticed for that of Eu3+, Sm3+ and Yb3+. The experimental data of PL was used to determine the positions of the energy levels of all lanthanides (with oxidation states of 3+ or 2+) relative to the valence and conduction bands of NaYP2O7. The model successfully provided the positions of electronic levels within the bandgap, with excellent agreement with the experimental spectra. Thermoluminescence (TL) glow curves were measured for co-doped samples NaYP2O7:Ce3+,Ln3+ (Ln = Dy, Ho and Sm) in order to investigate the nature of the trapping centres. The values determined for the activation energies were comparable with the position of dopant-induced electronic levels, whereas the frequency factor related to the TL peak of Ho-doped sample agreed with the phonon frequency for the lattice. The results indicate that the Ce3+ acts as recombination centre whereas the codopants create electron trap levels. / Os objetivos centrais deste trabalho foram a produção e a investigação das propriedades de amostras policristalinas de NaYP2O7 e NaY0.99Ln0.01P2O7 (Ln = Ce, Sm, Eu, Tb e Yb). A produção foi feita por uma rota sol-gel usando PVA como agente polimérico. Para se obter a fase cristalina única, foi necessário utilizar uma razão molar Na:Y:P = 1.15:1:2, que não é a estequiométrica, com duas calcinações, a 400 ºC / 4h e a 600 ºC / 4h. A caracterização estrutural do material produzido foi realizada por Difração e Absorção de raios X (DRX e XAS). Observou-se que os íons dopantes são incorporados à matriz, ocupando o sítio do Y, sem, no entanto, provocar alteração da estrutura cristalina. Sob excitação na região do VUV, amostra não-dopada apresentou um espectro de emissão luminescente que foi atribuído à recombinação de éxcitons auto-armadilhados. Por outro lado, a fotoluminescência (PL) das amostras dopadas apresentou as linhas de emissão características de cada dopante. Nos espectros de excitação da fotoluminescência nestas amostras, as transições 4f-5d foram identificadas para as amostras dopadas com Ce3+, Sm3+ e Tb3+, e processos de transferência de carga para Sm3+, Eu3+ e Yb3+. Os dados experimentais de PL foram usados para determinar as posições dos níveis de energia de todos lantanídeos (com estados de oxidação 3+ ou 2+) em relação à banda de valência e de condução do NaYP2O7. O modelo utilizado forneceu com êxito a posição dos níveis eletrônicos na região proibida, em excelente concordância com os espectros experimentais. Curvas de termoluminescência (TL) foram medidas para amostras co-dopadas NaYP2O7:Ce3+,Ln3+ (Ln = Dy, Ho e Sm) a fim de investigar a natureza dos centros de armadilhamento. Os valores de energia de ativação determinados foram compatíveis com as posições dos níveis eletrônicos determinados por PL e o fator de frequência relacionado ao pico TL da amostra dopada com Ho coincidiu com a frequência de fônons da rede. Os resultados revelaram ainda que o Ce3+ atua como centro de recombinação, enquanto os codopantes são responsáveis pela criação de níveis de armadilhas de elétrons.

OBJETIVO: Determinar asociación entre la calidad del sueño y el control glicémico en pacientes con diabetes mellitus tipo 2 del Hospital Vitarte desde junio hasta setiembre del 2016. MATERIAL Y METODOS: Estudio de tipo observacional, analítico, transversal, prospectivo. Se trabajó con 155 pacientes que acudieron a consulta por endocrinología y medicina interna en el Hospital Vitarte. La variable dependiente fue la calidad de sueño medido con la escala de Pittsburgh, y la independiente fue el control glicémico medido con el promedio de los dos últimos controles de glucosa de cada paciente. Se realizó la prueba de chi cuadrado usando un valor p significativo de menos de 0,05; asimismo, se obtuvieron los OR con sus respectivos intervalos de confianza al 95%. RESULTADOS: De los 155 encuestados, 52,9 % eran del sexo femenino. La prevalencia de mala calidad de sueño fue del 59%. Esa se asoció a control glicémico, edad, tiempo de enfermedad y comorbilidades como el EPOC, la HTA y la anemia. La frecuencia de adherencia al tratamiento fue del 49,68 %. CONCLUSION: El pobre control glicémico, la edad, el tiempo de enfermedad y la comorbilidad de HTA, EPOC y anemia son factores de riesgo para mala calidad de sueño en pacientes con diabetes mellitus tipo 2 del Hospital Vitarte desde junio hasta setiembre del 2016. PALABRAS

Magíster en fisiología / La hipertensión arterial pulmonar (HAP) es una enfermedad crónica, progresiva y fatal. A pesar del desarrollo de nuevas drogas, continúa siendo incurable. Las tres vías de tratamiento farmacológico actual apuntan a la regulación del tono vascular pulmonar, sin embargo, no se ha considerado la posible participación del sistema de regulación purinérgica del tono, el cual ya es conocido por su contribución a la regulación de la vaso-actividad a nivel sistémico. La escasa bibliografía disponible que ha permitido iniciar la caracterización del sistema purinérgico a nivel pulmonar se refiere solo al nivel arterial, sin embargo, los vasos venosos intrapulmonares pequeños dan cuenta de cerca de un 20% de la resistencia vascular pulmonar, lo que hace de este un componente importante en HAP. Es por esto que nuestro objetivo fue evaluar la contracción de venas intrapulmonares pequeñas inducida por UDP y buscar el receptor sensible a UDP involucrado (P2Y6 o P2Y14 ). Registramos la contracción de venas intrapulmonares pequeñas (VIP) inducida por dosis crecientes de UDP en rebanadas de pulmón de ratas con HAP y ratas sanas; luego desarrollamos ensayos funcionales con agonistas y antagonistas específicos para los receptores P2Y6 y P2Y14 y finalmente evaluamos la expresión de dichos receptores a través de Inmunofluorescencia Indirecta (IFI). Nuestros resultados muestran por primera vez que el UDP es un agonista capaz de inducir contracción dependiente de concentración en VIP tanto en ratas sanas como HAP, en este último grupo se observa una contracción mediada por UDP de una magnitud mayor a la lograda en ratas sanas. Los estudios funcionales con agonistas específicos para cada receptor muestran contracción mediada por el receptor P2Y6 y en muy menor medida por el receptor P2Y14 en ratas sanas e interesantemente demostramos una hipercontractilidad mediada por UDP-Glucosa a través de su único receptor P2Y14 en ratas HAP. La IFI ratifica la presencia del receptor P2Y6 en músculo liso de ratas controles e hipertensas y consecuentemente con los estudios funcionales se demostró una mayor presencia del receptor P2Y14 en músculo liso de VIP de ratas con HAP en comparación a ratas sanas. Nosotros concluimos que es el receptor P2Y14 el que presenta una destacada participación en la fisiopatología de la HAP; esto debido a que su activación específica induce una respuesta hipercontráctil de las VIP en ratas enfermas, lo cual se ve respaldado por su mayor colocalización a nivel del músculo liso en la pared de VIP de ratas HAP. Esto nos permite pensar en el receptor P2Y14 como un nuevo target de acción farmacológica para el tratamiento de la enfermedad.

O presente trabalho teve como objetivo produzir comprimidos de liberação controlada de difosfato de primaquina baseados em polímeros hidrofílicos e otimizar a liberação do fármaco por meio do planejamento estatístico de mistura (DOE). Na seleção dos componentes da formulação foram realizados estudos de calorimetria exploratória diferencial (DSC) para verificar a compatibilidade entre o fármaco/excipientes e avaliação do fluxo dos pós das formulações por meio da determinação do ângulo de repouso. As 20 formulações obtidas no planejamento experimental continham misturas de hidroxipropilmetilcelulose de diferentes graus de viscosidade (K15M, K4M e K100LV) e polietilenoglicol 4000 como polímeros para controle da liberação. Os comprimidos de 30 mg de primaquina foram produzidos por compressão direta em máquina de punção simples de 9 mm e foram avaliados quanto à dureza, friabilidade, peso médio, teor do fármaco e dissolução. A cinética de liberação do fármaco foi estudada segundo os modelos de ordem zero, Higuchi e Korsmeyer-Peppas. Os ensaios de DSC permitiram verificar algum tipo de interação entre o fármaco e os excipientes lactose e estearato de magnésio. Os pós das formulações demonstraram boas propriedades de fluxo de acordo com os valores de ângulo de repouso. Os dados de regressão obtidos pelos modelos matemáticos aplicados com o DOE não permitiram verificar se a mistura de polímeros influenciou no ângulo de repouso dos pós e nas características físicas como dureza, friabilidade e peso médio dos comprimidos. No entanto, foi observada influência significativa da composição polimérica na dissolução dos comprimidos nos intervalos de 2, 4, 6 e 8 horas de ensaio. A partir desses dados e dos gráficos de superfície de resposta gerados pelo programa Design Expert® 6.0, foi possível otimizar as formulações restringindo a quantidade de cada polímero de forma a obter uma formulação com mecanismo de liberação duplo, por difusão e relaxamento das cadeias de polímero. O transporte anômalo foi o mecanismo de liberação de fármaco apresentado pela maioria das formulações, inclusive da formulação otimizada. / The objective of the present work was to produce primaquine diphosphate controlled release tablets based on hydrophilic polymers and use the mixture statistical experimental design (DOE) to optimize drug release. In selecting the components of the formulations, differential scanning calorimetry (DSC) were carried out to verify the compatibility between drug/excipients and evaluating flow properties of the powders by determining the angle of repose. The 20 formulations obtained in the experimental design contained mixtures of hydroxylpropylmethylcellulose of different degrees of viscosity (K15M, K4M and K100LV) and polyethylene glycol 4000 as polymers to control drug release. Tablets containing 30 mg of primaquine were produced by direct compression in a 9 mm single punch tablet press and were evaluated for hardness, friability, average weight, drug content and dissolution. The kinetics of drug release was studied applying Zero Order, Higuchi and Korsmeyer-Peppas models. DSC tests allowed verifying some kind of interaction between the drug and the excipients lactose and magnesium stearate. The values of angle of repose obtained demonstrated that the powders of the formulations presented good flow properties. The regression data obtained by the mathematical models failed to verify the influence of the mixture of polymers in the angle of repose of the powders and physical characteristics such as hardness, friability and average weight of the tablets. However, there was a significant influence of polymers composition in the dissolution of the tablets at intervals of 2, 4, 6 and 8 hours of testing. Most formulations showed anomalous transport as the mechanism of drug release. From these data and response surface plots generated by Design Expert® 6.0 software, it was possible to optimize the formulations by restricting the amount of each polymer to obtain a formulation with a double release mechanism, diffusion and relaxation of the hydrated matrix chains.

Made available in DSpace on 2016-08-17T17:39:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_ELYJANY MORAIS LIMA SENA.pdf: 1561186 bytes, checksum: 888156a1b9f61af2c114710a272cf739 (MD5) Previous issue date: 2014-10-17 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Protein disulfide isomerase (PDI) plays an important role in platelet aggregation involving thiol containing surface proteins in both dependent pathways and independent of ADP. Recently it has been shown that one dodecapeptide (CXXC) containing the catalytic motif PDI was able to decrease the reductase activity of PDI opening the perspective of using the same as antithrombotic therapeutic agent. This study aimed to investigate the effects of peptides PDI - like on platelet aggregation in vitro and molecular mechanism of action of the same. For in silico analysis using a molecular docking program, it was observed that the CXXC peptide as well as its control peptide, scrambled (SCR) and AXXA were all capable of binding to the substrate site of the lligação PDI. Posteriorly, Western blot, it was demonstrated that the peptide CXXC (25  M) induced a slight but significant reduction of free thiols marking PDI suggesting physical association between the peptide and the protein. The same was not observed in samples incubated with Scr and AXXA peptides at the same concentration. In platelet aggregation assays, the platelet-rich plasma (PRP) was pre-incubated with the CXXC, Scr and AXXA peptides using ADP (5  M) as aggregating agent. CXXC found that the peptide reduced the maximum aggregation by 14%, 27% and 30% at concentrations of 3, 10 and 30μM, respectively. The Scr AXXA peptide and the peptide had no effect on platelet aggregation induced by ADP in the same concentrations. Thus, all the data presented here suggest that the CXXC peptide is associated with PDI surface and partially inhibits platelet aggregation via mechanisms mediated by thiol-disulfide exchange. / A Proteína dissulfeto isomerase (PDI) desempenha um importante papel na agregação de plaquetas, envolvendo proteínas tiólicas de superfície tanto em vias dependentes, quanto independentes de ADP. Recentemente foi demostrado que um dodecapeptídeo (CxxC), contendo o motivo catalítico da PDI, era capaz de diminuir a atividade redutase da PDI, abrindo a perspectiva do uso do mesmo como agente terapêutico antitrombótico. Assim, este trabalho teve como objetivo investigar os efeitos de peptídeos PDI símile sobre a agregação plaquetária in vitro e o mecanismo molecular de ação dos mesmos. Por análises in silico utilizando um programa de ancoragem molecular, observou-se que o peptídeo CxxC, bem como os seus peptídeos controle, scrambled (Scr) e AxxA, foram todos capazes de se ligar ao sítio de lligação do substrato na PDI. Posteriomente, por western blot ,demonstrou-se que o peptídeo CxxC (25 M) promoveu uma discreta, mas importante, redução da marcação de tióis livres da PDI sugerindo associação física entre o peptídeo e a proteína. O mesmo não foi observado nas amostras incubadas com os peptídeos Scr e AxxA, na mesma concentração. Nos ensaios de agregação plaquetária, o plasma rico em plaquetas (PRP) foi pré-incubado com os peptídeos CxxC, Scr e AxxA utilizando ADP (5M) como agente agregante. Encontramos que o peptídeo CxxC reduziu a agregação máxima em 14%, 27% e 30% nas concentrações de 3, 10 e 30μM, respectivamente. O peptídeo Scr e o peptídeo AxxA, não afetaram a agregação plaquetária induzida por ADP nas mesmas concentrações. Sendo assim, o conjunto dos dados aqui apresentados sugerem que o peptídeo CxxC associa-se à PDI de superfície e inibe parcialmente a agregação plaquetária via mecanismos mediados por trocas tiol-dissulfeto.

O presente trabalho teve como objetivo produzir comprimidos de liberação controlada de difosfato de primaquina baseados em polímeros hidrofílicos e otimizar a liberação do fármaco por meio do planejamento estatístico de mistura (DOE). Na seleção dos componentes da formulação foram realizados estudos de calorimetria exploratória diferencial (DSC) para verificar a compatibilidade entre o fármaco/excipientes e avaliação do fluxo dos pós das formulações por meio da determinação do ângulo de repouso. As 20 formulações obtidas no planejamento experimental continham misturas de hidroxipropilmetilcelulose de diferentes graus de viscosidade (K15M, K4M e K100LV) e polietilenoglicol 4000 como polímeros para controle da liberação. Os comprimidos de 30 mg de primaquina foram produzidos por compressão direta em máquina de punção simples de 9 mm e foram avaliados quanto à dureza, friabilidade, peso médio, teor do fármaco e dissolução. A cinética de liberação do fármaco foi estudada segundo os modelos de ordem zero, Higuchi e Korsmeyer-Peppas. Os ensaios de DSC permitiram verificar algum tipo de interação entre o fármaco e os excipientes lactose e estearato de magnésio. Os pós das formulações demonstraram boas propriedades de fluxo de acordo com os valores de ângulo de repouso. Os dados de regressão obtidos pelos modelos matemáticos aplicados com o DOE não permitiram verificar se a mistura de polímeros influenciou no ângulo de repouso dos pós e nas características físicas como dureza, friabilidade e peso médio dos comprimidos. No entanto, foi observada influência significativa da composição polimérica na dissolução dos comprimidos nos intervalos de 2, 4, 6 e 8 horas de ensaio. A partir desses dados e dos gráficos de superfície de resposta gerados pelo programa Design Expert® 6.0, foi possível otimizar as formulações restringindo a quantidade de cada polímero de forma a obter uma formulação com mecanismo de liberação duplo, por difusão e relaxamento das cadeias de polímero. O transporte anômalo foi o mecanismo de liberação de fármaco apresentado pela maioria das formulações, inclusive da formulação otimizada. / The objective of the present work was to produce primaquine diphosphate controlled release tablets based on hydrophilic polymers and use the mixture statistical experimental design (DOE) to optimize drug release. In selecting the components of the formulations, differential scanning calorimetry (DSC) were carried out to verify the compatibility between drug/excipients and evaluating flow properties of the powders by determining the angle of repose. The 20 formulations obtained in the experimental design contained mixtures of hydroxylpropylmethylcellulose of different degrees of viscosity (K15M, K4M and K100LV) and polyethylene glycol 4000 as polymers to control drug release. Tablets containing 30 mg of primaquine were produced by direct compression in a 9 mm single punch tablet press and were evaluated for hardness, friability, average weight, drug content and dissolution. The kinetics of drug release was studied applying Zero Order, Higuchi and Korsmeyer-Peppas models. DSC tests allowed verifying some kind of interaction between the drug and the excipients lactose and magnesium stearate. The values of angle of repose obtained demonstrated that the powders of the formulations presented good flow properties. The regression data obtained by the mathematical models failed to verify the influence of the mixture of polymers in the angle of repose of the powders and physical characteristics such as hardness, friability and average weight of the tablets. However, there was a significant influence of polymers composition in the dissolution of the tablets at intervals of 2, 4, 6 and 8 hours of testing. Most formulations showed anomalous transport as the mechanism of drug release. From these data and response surface plots generated by Design Expert® 6.0 software, it was possible to optimize the formulations by restricting the amount of each polymer to obtain a formulation with a double release mechanism, diffusion and relaxation of the hydrated matrix chains.

D-Frutose-1,6-difosfato (F1,6BP), um intermediário altamente energético da via glicolítica, é descrito na literatura como portador de diversas atividades farmacológicas, contudo seu mecanismo de ação ainda não fora esclarecido. Dessa forma, a possível atividade anti-inflamatória da F1,6BP sobre diferentes modelos de inflamação e sua via de ação em camundongos foram averiguadas com enfoque na inibição da produção de citocinas e na elevação dos níveis endógenos de adenosina. A hipernocicepção mecânica foi avaliada por método eletrônico de pressão crescente em patas de camundongos, o ensaio cinéticocolorimétrico de mieloperoxidase (MPO) foi utilizado na avaliação da migração leucocitária para o tecido subcutâneo plantar, e a performance motora dos animais foi determinada pelo teste rota-rod. A quantificação de citocinas foi realizada por ELISA, enquanto a quantificação de adenosina foi obtida em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) após validação laboratorial da metodologia segundo normas protocoladas pela ANVISA. O pré-tratamento de camundongos com F1,6BP reduziu a hipernocicepção induzida por injeção intraplantar de carragenina (45%), TNF-a (40%), IL-1B (46%), KC (33%), prostaglandina E2 (41%) e dopamina (55%). O tratamento com F1,6BP, no entanto, não alterou a produção de citocinas induzidas por carragenina (TNF-a, IL-1B e KC) e nem interferiu com a migração leucocitária para a região desafiada. Por outro lado, o efeito antinociceptivo da F1,6BP foi prevenido por tratamento sistêmico e local com antagonista de receptores A1 de adenosina (DPCPX) e o tratamento com adenosina apresentou efeitos similares os do tratamento com F1,6BP, sugerindo que o efeito da F1,6BP é mediado pela ação periférica da adenosina sobre receptores A1. Endossando isso, foi constatado por meio de cromatografia líquida de alta eficiência um aumento na concentração plasmática de adenosina em camundongos após administração de F1,6BP. Por conseguinte, a via de ação da F1,6BP parece ser dependente da produção de adenosina, mas não da modulação na produção de citocinas hipernociceptivas. A adenosina atua, então, perifericamente em receptores A1 inibindo a hipernocicepção, e a evidência farmacológica de que ela medeia a atividade da F1,6BP através dessa ação sobre receptores A1 foi corroborada por resultados in vivo que demonstram aumento dos níveis de adenosina decorrente da administração de F1,6BP. Em vista disso, esses resultados insinuam um possível potencial terapêutico da F1,6BP em reduzir a dor inflamatória. / D-Fructose-1,6-bisphosphate (F1,6BP), a high-energy glycolytic pathway intermediate, is reported to have a many pharmacologically effect, but its underlying mechanism of action in inflammation is incompletely understood. In this study, the aim was to examine the function of F1,6BP on cytokines and adenosine. Then, the possible F1,6BP anti-inflammatory activities in different models of inflammation and its mechanism of action in mice were addressed focusing inhibition of cytokine production or adenosine production enhancement. Mechanical hypernociception (decrease in the nociceptive threshold of animals) was evaluated by the electronic pressure meter test in mice, the myeloperoxidase (MPO) kineticcolorimetric assay was used to evaluate the leukocyte migration to the subcutaneous plantar tissue of mice hind paw, and mice motor performance were evaluated on the rota-rod test. The cytokines levels were measured by ELISA. Adenosine levels were determined by high performance liquid chromatography and this experimental procedure was validated according to ANVISA for this purpose. The pretreatment of mice with F1,6BP reduced the hypernociception induced by intraplantar injection of carrageenan (45%), TNF (40%), IL-1 (46%), KC (33%), prostaglandin E2 (41%) and dopamine (55%). However, FBP treatment did not alter carrageenin-induced cytokines (TNF-, IL-1 and KC) production or the leukocyte migration to the subcutaneous plantar tissue of mice hind paw. On the other hand, the antinociceptive effect of F1,6BP was prevented by systemic and local treatment with an adenosine A1 receptor antagonist (DPCPX) and adenosine treatment presented similar effect of F1,6BP, suggesting that F1,6BP effect is mediated by peripheral adenosine acting on A1 receptors. In agreement, the present work determined by high performance liquid chromatography that D-Fructose-1,6-bisphosphate administration increased the adenosine endogenous levels in the mice plasma. Therefore, F1,6BP mechanism of action seems dependent on adenosine production but not on modulation of hypernociceptive cytokine production. In turn, adenosine acts peripherally on A1 receptor inhibiting hypernociception. The pharmacological evidence that adenosine through activation of adenosine A1 receptor mediates the antinociceptive action of F1,6BP was supported by the finding that in vivo administration of F1,6BP increases the levels of adenosine in the blood samples. Thus, suggesting the treatment with F1,6BP as a possible therapeutic approach to reduce inflammatory pain.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-05-27. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:25Z : No. of bitstreams: 1 Publico-00212.pdf: 1245886 bytes, checksum: 4848d0e58992c5a9ff4b387a14c2534a (MD5) / Objetivos: Analisar a expressão das proteínas CD10 e NM23 por estudo imunohistoquímico do tecido do carcinoma colorretal e da mucosa adjacente. Avaliar a relação da expressão dessas proteínas com os aspectos anatomopatológicos da neoplasia, estadiamento clínico, ocorrência de metástases hepáticas e prognóstico dos doentes. Método: Cento e trinta doentes operados por carcinoma colorretal foram analisados. Bloco de tissue microarray foi confeccionado com tecido neoplásico e com a mucosa não neoplásica adjacente. Estudo imuno-histoquímico foi realizado com anticorpos monoclonais NM23 e CD10 no tecido neoplásico e no tecido não neoplásico da mucosa adjacente. A leitura foi realizada por aparelho de escaneamento de lâminas. A imunoexpressão foi avaliada pelo percentual de células coradas e foram obtidos escores de intensidade. Foram considerados como positivos para CD 10 os tumores que expressavam o marcador em mais de 10% das células neoplásicas. Para NM 23 considerou-se dois grupos divididos em fortes expressores (mais de 50%) e expressores fracos (menos de 50%) das células coradas. Os resultados foram relacionados com as características morfológicas e histopatológicas do carcinoma colorretal, estadiamento clínico, presença de metástases hepáticas e com o prognóstico. No estudo estatístico foram utilizados os testes de Mann-Whitney, Kruskal- Wallis e exato de Fisher. A sobrevivência foi avaliada utilizando a curva de Kaplan- Meier, e o desfecho de comparação entre as curvas foi calculado pelo teste de Long rank. Resultados: Ambos os marcadores CD10 e NM23 apresentaram expressão maior no tecido do carcinoma do que na mucosa não neoplásica adjacente (p<0,0001 para ambos). A imunoexpressão tecidual das proteínas NM23 e CD10 não apresentou relação com o grau de diferenciação celular (p=0,57 e p=0,48, respectivamente), invasão vascular (p=0,85 e p=0,67, respectivamente), invasão linfática (p=0,41 e 0,73, respectivamente), infiltração perineural (p=0,46 e p=0,24, respectivamente) e com o estadiamento pela classificação TNM (p=0,19 para ambos). A imunoexpressão de CD10 no tecido do carcinoma colorretal foi maior (p=0,05) nas neoplasias exofíticas do que nos tumores não exofíticos. A expressão das proteínas NM23 e CD10 não apresentou relação com a incidência de metástases linfonodais (p=0,08 e 0,30, respectivamente). A expressão tecidual dos marcadores NM23 e CD10 não se relacionou com a ocorrência de metástases hepáticas (p=0,59 e p=0,31, respectivamente). A sobrevivência livre de doença mostrou relação significante (p=0,01) com a maior intensidade de imunoexpressão da proteína NM23 no tecido do carcinoma colorretal, o mesmo não ocorrendo com a imunoexpressão da proteína CD10 (p=0,18). A sobrevivência global não mostrou relação com as expressões das proteínas NM23 e CD10 (p=0,13 e p=0,24, respectivamente). Conclusões: O tecido neoplásico do carcinoma colorretal expressou mais intensamente as proteínas NM23 e CD10 do que a mucosa não neoplásica adjacente. A imunoexpressão de CD10 no tecido do carcinoma colorretal foi maior (p=0,05) nas neoplasias exofíticas do que nos tumores não exofíticos. A expressão das proteínas NM23 e CD10 não se relacionou com os demais aspectos anatomopatológicos da neoplasia, com a presença de metástase hepática e com o estadiamento do carcinoma colorretal. Os doentes com imunoexpressão aumentada da proteína NM23 apresentaram sobrevivência livre de doença significativamente maior. A intensidade da imunoexpressão tecidual da proteína CD10 não influenciou a sobrevivência livre de doença e a sobrevivência global não se relacionou com a imunoexpressão das proteínas NM23 e CD10. / Aims: To analyze the tissue expression of the proteins CD 10 and NM 23 through the immunohistochemichal study of the colorectal carcinoma and evaluate the expression relation of these proteins with the anatomopathological aspects of the neoplasia, clinical staging, occurrence of hepatic metastasis and patients’ prognostic. Method: One hundred and thirty operated patients of colorectal carcinoma have been analyzed. A block of tissue microarray was produced with the neoplastic mucosa and with the adjacent non-neoplastic mucosa. An immunohistochemichal study was performed with monoclonal antibodies NM23 and CD10 on the neoplastic tissue and non-neoplastic tissue of the adjacent mucosa. The interpretation of the slides was made by a scanner device. The immunoexpression was evaluated by the percentage of colored cells and the obtained intensity scores. The results were related to the morphological and histopathological characteristics of the carcinoma, clinical staging, presence of hepatic metastasis and to the prognostic of the patients. In the statistic study were used the Mann-Whitney test, the Kruskal-Wallis test and Fisher’s exact test. The analysis of survival was conducted with the use of the Kaplan-Meier curve and the comparison conclusion between the curves was calculated through the Longrank test. Results: Both markers CD10 and NM23 presented a higher expression on the carcinoma tissue rather than on the non-neoplastic adjacent mucosa (p<0,0001 for both). The expression of the proteins NM23 and CD10 did not present any relation to the degree of cellular differentiation (p=0,57 and p=0,48, respectively) , vascular invasion (p=0,85 and p=0,67, respectively), lymphatic invasion (p=0,41and 0,73, respectively), perineural infiltration (p=0,46 and p=0,24, respectively) and with the staging by the TNM classification (p=0,19). The immunoexpression of CD10 on the colorectal carcinoma tissue was higher (p=0,15) on the exophytic neoplasias than on the non-exophytic tumors. The expression of the proteins NM23 and CD10 did not present any relation with the incidence of lymphonodal metastasis (p=0,08 and 0,30, respectively). The tissue expression of the markers NM23 and CD10 did not relate to the occurrence of hepatic metastasis (p=0,59 and 0,31 respectively). The disease-free survival disclosed a significant relation (p=0,01) with a higher intensity of immunoexpression of the protein NM23 on the colorectal carcinoma’s tissue. However, the same did not occur with the immunoexpression of the protein CD10 (p=0,18). The global survival did not show any relation with the expression of the proteins NM23 and CD10 (p=0,13 and p=0,24, respectively). Conclusions: The neoplastic tissue of the colorectal carcinoma expresses more intensely the proteins NM23 and CD10 than the adjacent nonneoplastic mucosa. The expression of the proteins NM23 and CD10 does not relate to the presence of lymphonodal metastasis, hepatic metastasis, degree of cellular differentiation, colonic or rectal localization of the neoplasia, presence of vascular and/or lymphatic invasion, presence of neural infiltration and the staging of the colorectal carcinoma. The patients with increased immunoexpression of the protein NM23 presented a disease-free survival significantly higher. The intensity of the tissue immunoexpression of the protein CD10 did not influence the disease-free survival. The global survival does not relate to the immunoexpression of the proteins NM23 and CD10. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

D-Frutose-1,6-difosfato (F1,6BP), um intermediário altamente energético da via glicolítica, é descrito na literatura como portador de diversas atividades farmacológicas, contudo seu mecanismo de ação ainda não fora esclarecido. Dessa forma, a possível atividade anti-inflamatória da F1,6BP sobre diferentes modelos de inflamação e sua via de ação em camundongos foram averiguadas com enfoque na inibição da produção de citocinas e na elevação dos níveis endógenos de adenosina. A hipernocicepção mecânica foi avaliada por método eletrônico de pressão crescente em patas de camundongos, o ensaio cinéticocolorimétrico de mieloperoxidase (MPO) foi utilizado na avaliação da migração leucocitária para o tecido subcutâneo plantar, e a performance motora dos animais foi determinada pelo teste rota-rod. A quantificação de citocinas foi realizada por ELISA, enquanto a quantificação de adenosina foi obtida em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) após validação laboratorial da metodologia segundo normas protocoladas pela ANVISA. O pré-tratamento de camundongos com F1,6BP reduziu a hipernocicepção induzida por injeção intraplantar de carragenina (45%), TNF-a (40%), IL-1B (46%), KC (33%), prostaglandina E2 (41%) e dopamina (55%). O tratamento com F1,6BP, no entanto, não alterou a produção de citocinas induzidas por carragenina (TNF-a, IL-1B e KC) e nem interferiu com a migração leucocitária para a região desafiada. Por outro lado, o efeito antinociceptivo da F1,6BP foi prevenido por tratamento sistêmico e local com antagonista de receptores A1 de adenosina (DPCPX) e o tratamento com adenosina apresentou efeitos similares os do tratamento com F1,6BP, sugerindo que o efeito da F1,6BP é mediado pela ação periférica da adenosina sobre receptores A1. Endossando isso, foi constatado por meio de cromatografia líquida de alta eficiência um aumento na concentração plasmática de adenosina em camundongos após administração de F1,6BP. Por conseguinte, a via de ação da F1,6BP parece ser dependente da produção de adenosina, mas não da modulação na produção de citocinas hipernociceptivas. A adenosina atua, então, perifericamente em receptores A1 inibindo a hipernocicepção, e a evidência farmacológica de que ela medeia a atividade da F1,6BP através dessa ação sobre receptores A1 foi corroborada por resultados in vivo que demonstram aumento dos níveis de adenosina decorrente da administração de F1,6BP. Em vista disso, esses resultados insinuam um possível potencial terapêutico da F1,6BP em reduzir a dor inflamatória. / D-Fructose-1,6-bisphosphate (F1,6BP), a high-energy glycolytic pathway intermediate, is reported to have a many pharmacologically effect, but its underlying mechanism of action in inflammation is incompletely understood. In this study, the aim was to examine the function of F1,6BP on cytokines and adenosine. Then, the possible F1,6BP anti-inflammatory activities in different models of inflammation and its mechanism of action in mice were addressed focusing inhibition of cytokine production or adenosine production enhancement. Mechanical hypernociception (decrease in the nociceptive threshold of animals) was evaluated by the electronic pressure meter test in mice, the myeloperoxidase (MPO) kineticcolorimetric assay was used to evaluate the leukocyte migration to the subcutaneous plantar tissue of mice hind paw, and mice motor performance were evaluated on the rota-rod test. The cytokines levels were measured by ELISA. Adenosine levels were determined by high performance liquid chromatography and this experimental procedure was validated according to ANVISA for this purpose. The pretreatment of mice with F1,6BP reduced the hypernociception induced by intraplantar injection of carrageenan (45%), TNF (40%), IL-1 (46%), KC (33%), prostaglandin E2 (41%) and dopamine (55%). However, FBP treatment did not alter carrageenin-induced cytokines (TNF-, IL-1 and KC) production or the leukocyte migration to the subcutaneous plantar tissue of mice hind paw. On the other hand, the antinociceptive effect of F1,6BP was prevented by systemic and local treatment with an adenosine A1 receptor antagonist (DPCPX) and adenosine treatment presented similar effect of F1,6BP, suggesting that F1,6BP effect is mediated by peripheral adenosine acting on A1 receptors. In agreement, the present work determined by high performance liquid chromatography that D-Fructose-1,6-bisphosphate administration increased the adenosine endogenous levels in the mice plasma. Therefore, F1,6BP mechanism of action seems dependent on adenosine production but not on modulation of hypernociceptive cytokine production. In turn, adenosine acts peripherally on A1 receptor inhibiting hypernociception. The pharmacological evidence that adenosine through activation of adenosine A1 receptor mediates the antinociceptive action of F1,6BP was supported by the finding that in vivo administration of F1,6BP increases the levels of adenosine in the blood samples. Thus, suggesting the treatment with F1,6BP as a possible therapeutic approach to reduce inflammatory pain.