Os cecos gástricos de Rhynchosciara americana e de outros insetos são órgãos envolvidos em digestão terminal e/ou absorção de nutrientes. Devido a isso, a sua disposição na região anterior do ventrículo é intrigante. Uma explicação para essa localização seria a existência de uma circulação endo-ectoperitrófica de fluidos e de enzimas digestivas, como foi proposto anteriormente em R. americana. Afim de procurar reforçar o modelo proposto procurou-se obter dados sobre a ultraestrutura das células do tubo digestivo e sobre a composição enzimática de suas microvilosidades. As células dos cecos e do ventrículo posterior distal tem uma ultraestrutura bastante semelhante; elas possuem grandes microvilosidades apicais e a membrana plasmática basal apresenta invaginações com mitocôndrias associadas, embora a maioria dessas organelas sejam encontradas no citoplasma apical. O compartimento extracelular delimitado por essas invaginações da membrana basal apresenta poucas aberturas para a hemolinfa, o que dá à célula a possibilidade de concentrar solutos nesse compartimento. As células do ventrículo anterior possuem microvilosidades apicais muito pequenas e um sistema elaborado de invaginações da membrana basal, com muitas mitocôndrias associadas, e que se estendem até quase o ápice das células. O compartimento extracelular delimita do por essas invaginações apresenta, nessas células, grande número de aberturas para a hemolinfa. O ventrículo posterior proximal representa uma região de transição entre o ventrículo anterior e o ventrículo posterior distal. A ultraestrutura dos cecos e ventrículo posterior distal é coerente com uma função na absorção de fluidos, enquanto que aquela do ventrículo anterior e coerente com uma função de secreção de fluidos. A análise da composição de enzimas nas microvilosidades das diferentes regiões do intestino médio mostrou novamente que as células dos cecos e do ventrículo posterior distal são semelhantes e também que devem estar envolvidas na digestão terminal dos nutrientes, pois possuem alta atividade específica para hidrolases de oligômeros. As células do ventrículo anterior (e do ventrículo posterior proximal) possuem microvilosidades com atividade específica muito baixa para as hidrolases de oligômeros, corno seria de esperar para urna célula que estivesse secretando fluidos, pois o substrato seria continuamente arrastado para longe da enzima. Os dados obtidos permitiram reforçar e refinar o modelo da circulação endo-ectoperitrófica de enzimas em R.americana. Para melhor compreensão da digestão terminal de proteínas em R.americana, aminopeptidases de diferentes regiões do tubo digestivo foram estudadas. As aminopeptidases do lúmen e do citossol das células dos cecos são semelhantes, e ambas diferem daquelas presentes na membrana plasmática dessas células. Os dados obtidos apoiam a hipótese de que a maioria das aminopeptidases solúveis nas células dos cecos são enzimas em via de serem secretadas para o lúmen e somente urna quantidade muito pequena pode ter urna função intracelular. Para iniciar o estudo das propriedades das enzimas envolvidas na digestão terminal, a celobiase ligada a membrana plasmática dos cecos foi escolhida. A celobiase solubilizada por Triton X-100 apresenta um peso molecular de 106.000 e um pI de 5,4, enquanto que a solubilização por papaína resulta em urna molécula com peso molecular de 65.000 e um pI de 4,7. A celobiase solubilizada por papaína e purificada por centrifugação em gradientes de densidade hidrolisa β-glicosídeos, β-galactosídeos e β-fucosídeos em um mesmo sítio ativo. Com base na comparação entre os Kis e os Kms para celobiose e para pNPβGli e na constância do Km obtido em diferentes pHs, tem-se uma forte evidência que essa enzima opera segundo uma cinética de equilíbrio rápido e não de estado estacionário. O fato da hidrólise da ligação β-glicosídica ocorrer sem inversão da configuração, ocorrer uma grande inibição da celobiase pela δ-gliconolactona e substituintes do radical aglicone influenciarem a constante catalítica sugere que, no mecanismo de catálise da celobiase, há formação de um íon carbônium intermediário e que não há formação de um complexo covalente enzima-substrato. / The gastric caeca of Rhynchosciara americana and other insects are involved in terminal digestion and/or absorption of nutrients. Due to that, their occurrence near the oesophagus is puzzling. One explanation for this should be the existence of an endo-ectoperitrophic circulation of fluids and digestive enzymes as previously proposed for R. americana. In order to support the proposed model of endo-ectoperitrophic circulation of digestive enzymes, fine structural and enzymological data on the midgut cells were obtained. Midgut caecal and distal posterior ventricular cells have a similar ultrastructure characterized by large apical microvilli and a basal plasma membrane infolded with associated mitochondria which are, nevertheless, more conspicuous in the apical cytoplasm. The fact that the basal plasma membrane infoldings constitute an extracellular compartment, with few openings into the underlying extracellular space, should permit the cell concentrate solutes in that compartment. The anterior ventricular cells possess small microvilli disposed in the cell apexes and elaborate mitochondria-associated basal plasma membrane infoldings extending almost to the tips of the cells. These infoldings display regular openings into the underlying extracellular space. The proximal posterior ventriculus represents a transition region between the anterior ventriculus and the distal posterior ventriculus. The fine structure of caeca and distal posterior ventricular cells is in accordance to their presumed function in fluid absorption, whereas the fine structure of anterior ventricular cells suggests a function in fluid secretion. Hydrolase assays in microvilli samples prepared from cells of different midgut regions showed that caeca and distal activities for digestive enzymes, suggesting a role in terminal posterior ventricular cells are alike in displaying high specific digestion. In contrast, very low specific activities of digestive enzymes were found in anterior ventricular cells, in accordance to their proposed function in fluid secretion. The results lend support to the model of the endo-ectoperitrophic circulation of digestive enzymes in R. americana. In order to extend our knowledge on protein terminal digestion, the aminopeptidases from cytosol and lumen were found to be similar and to differ from caecal microvillar aminopeptidades. The data support the assumption that the majority of the soluble aminopeptidases from the caecal cells are enzymes en route to their being secreted and only a minor amount would have a typical intracellular function. Caecal plasma membrane-bound cellobiase was chosen to initiate a detailed study of the properties of the enzymes involved in terminal digestion. The Triton X-100-solubilized cellobiase displays a molecular weight of 106.00 and a pI of 5.4, whereas the papaintreated cellobiase shows a molecular weight of 65.000 and a pI of 4.7. The papain-solubilized cellobiase, after being purified by density gradient centrifugation, hydrolyze β-g1ucosides, β-galactosides and β-fucosides in the same active site. The cellobiase seems to operate according to a rapid equilibrium kinetics, since the Km for cellobiose is constant over a wide range of pHs and the Km for cellobiose and pNPβGlu are identical to their Kis in a experiment of competition between substrates. The hydrolysis of the β-g1ucosidic bound occurs without inversion of configuration, δ-gluconolactone is a strong inhibitor of cellobiase and substituints in the substrate aglycone affects the catalytic constant of the reaction. These data support the assumption that the mechanism of the reaction catalysed by cellobiase involves the intermediary formation of a carbônium ion, instead of a glucosyl-enzyme intermediate.

Os cecos gástricos de Rhynchosciara americana e de outros insetos são órgãos envolvidos em digestão terminal e/ou absorção de nutrientes. Devido a isso, a sua disposição na região anterior do ventrículo é intrigante. Uma explicação para essa localização seria a existência de uma circulação endo-ectoperitrófica de fluidos e de enzimas digestivas, como foi proposto anteriormente em R. americana. Afim de procurar reforçar o modelo proposto procurou-se obter dados sobre a ultraestrutura das células do tubo digestivo e sobre a composição enzimática de suas microvilosidades. As células dos cecos e do ventrículo posterior distal tem uma ultraestrutura bastante semelhante; elas possuem grandes microvilosidades apicais e a membrana plasmática basal apresenta invaginações com mitocôndrias associadas, embora a maioria dessas organelas sejam encontradas no citoplasma apical. O compartimento extracelular delimitado por essas invaginações da membrana basal apresenta poucas aberturas para a hemolinfa, o que dá à célula a possibilidade de concentrar solutos nesse compartimento. As células do ventrículo anterior possuem microvilosidades apicais muito pequenas e um sistema elaborado de invaginações da membrana basal, com muitas mitocôndrias associadas, e que se estendem até quase o ápice das células. O compartimento extracelular delimita do por essas invaginações apresenta, nessas células, grande número de aberturas para a hemolinfa. O ventrículo posterior proximal representa uma região de transição entre o ventrículo anterior e o ventrículo posterior distal. A ultraestrutura dos cecos e ventrículo posterior distal é coerente com uma função na absorção de fluidos, enquanto que aquela do ventrículo anterior e coerente com uma função de secreção de fluidos. A análise da composição de enzimas nas microvilosidades das diferentes regiões do intestino médio mostrou novamente que as células dos cecos e do ventrículo posterior distal são semelhantes e também que devem estar envolvidas na digestão terminal dos nutrientes, pois possuem alta atividade específica para hidrolases de oligômeros. As células do ventrículo anterior (e do ventrículo posterior proximal) possuem microvilosidades com atividade específica muito baixa para as hidrolases de oligômeros, corno seria de esperar para urna célula que estivesse secretando fluidos, pois o substrato seria continuamente arrastado para longe da enzima. Os dados obtidos permitiram reforçar e refinar o modelo da circulação endo-ectoperitrófica de enzimas em R.americana. Para melhor compreensão da digestão terminal de proteínas em R.americana, aminopeptidases de diferentes regiões do tubo digestivo foram estudadas. As aminopeptidases do lúmen e do citossol das células dos cecos são semelhantes, e ambas diferem daquelas presentes na membrana plasmática dessas células. Os dados obtidos apoiam a hipótese de que a maioria das aminopeptidases solúveis nas células dos cecos são enzimas em via de serem secretadas para o lúmen e somente urna quantidade muito pequena pode ter urna função intracelular. Para iniciar o estudo das propriedades das enzimas envolvidas na digestão terminal, a celobiase ligada a membrana plasmática dos cecos foi escolhida. A celobiase solubilizada por Triton X-100 apresenta um peso molecular de 106.000 e um pI de 5,4, enquanto que a solubilização por papaína resulta em urna molécula com peso molecular de 65.000 e um pI de 4,7. A celobiase solubilizada por papaína e purificada por centrifugação em gradientes de densidade hidrolisa β-glicosídeos, β-galactosídeos e β-fucosídeos em um mesmo sítio ativo. Com base na comparação entre os Kis e os Kms para celobiose e para pNPβGli e na constância do Km obtido em diferentes pHs, tem-se uma forte evidência que essa enzima opera segundo uma cinética de equilíbrio rápido e não de estado estacionário. O fato da hidrólise da ligação β-glicosídica ocorrer sem inversão da configuração, ocorrer uma grande inibição da celobiase pela δ-gliconolactona e substituintes do radical aglicone influenciarem a constante catalítica sugere que, no mecanismo de catálise da celobiase, há formação de um íon carbônium intermediário e que não há formação de um complexo covalente enzima-substrato. / The gastric caeca of Rhynchosciara americana and other insects are involved in terminal digestion and/or absorption of nutrients. Due to that, their occurrence near the oesophagus is puzzling. One explanation for this should be the existence of an endo-ectoperitrophic circulation of fluids and digestive enzymes as previously proposed for R. americana. In order to support the proposed model of endo-ectoperitrophic circulation of digestive enzymes, fine structural and enzymological data on the midgut cells were obtained. Midgut caecal and distal posterior ventricular cells have a similar ultrastructure characterized by large apical microvilli and a basal plasma membrane infolded with associated mitochondria which are, nevertheless, more conspicuous in the apical cytoplasm. The fact that the basal plasma membrane infoldings constitute an extracellular compartment, with few openings into the underlying extracellular space, should permit the cell concentrate solutes in that compartment. The anterior ventricular cells possess small microvilli disposed in the cell apexes and elaborate mitochondria-associated basal plasma membrane infoldings extending almost to the tips of the cells. These infoldings display regular openings into the underlying extracellular space. The proximal posterior ventriculus represents a transition region between the anterior ventriculus and the distal posterior ventriculus. The fine structure of caeca and distal posterior ventricular cells is in accordance to their presumed function in fluid absorption, whereas the fine structure of anterior ventricular cells suggests a function in fluid secretion. Hydrolase assays in microvilli samples prepared from cells of different midgut regions showed that caeca and distal activities for digestive enzymes, suggesting a role in terminal posterior ventricular cells are alike in displaying high specific digestion. In contrast, very low specific activities of digestive enzymes were found in anterior ventricular cells, in accordance to their proposed function in fluid secretion. The results lend support to the model of the endo-ectoperitrophic circulation of digestive enzymes in R. americana. In order to extend our knowledge on protein terminal digestion, the aminopeptidases from cytosol and lumen were found to be similar and to differ from caecal microvillar aminopeptidades. The data support the assumption that the majority of the soluble aminopeptidases from the caecal cells are enzymes en route to their being secreted and only a minor amount would have a typical intracellular function. Caecal plasma membrane-bound cellobiase was chosen to initiate a detailed study of the properties of the enzymes involved in terminal digestion. The Triton X-100-solubilized cellobiase displays a molecular weight of 106.00 and a pI of 5.4, whereas the papaintreated cellobiase shows a molecular weight of 65.000 and a pI of 4.7. The papain-solubilized cellobiase, after being purified by density gradient centrifugation, hydrolyze β-g1ucosides, β-galactosides and β-fucosides in the same active site. The cellobiase seems to operate according to a rapid equilibrium kinetics, since the Km for cellobiose is constant over a wide range of pHs and the Km for cellobiose and pNPβGlu are identical to their Kis in a experiment of competition between substrates. The hydrolysis of the β-g1ucosidic bound occurs without inversion of configuration, δ-gluconolactone is a strong inhibitor of cellobiase and substituints in the substrate aglycone affects the catalytic constant of the reaction. These data support the assumption that the mechanism of the reaction catalysed by cellobiase involves the intermediary formation of a carbônium ion, instead of a glucosyl-enzyme intermediate.

Insetos abrangem o maior número de espécies descritas, estando distribuídos por praticamente todos os nichos ecológicos. O tubo digestivo destes animais consiste na principal interface entre estes e o meio externo. Assim, o estudo das enzimas digestivas, ou proteínas relacionadas ao processo digestivo em insetos, faz-se fundamental para a tentativa de desenvolver novos métodos de controle que ajam via canal alimentar, como o uso de plantas transgênicas para controlar insetos fitófagos (Felton & Gatehouse, 1996). Diptera superiores são os únicos animais, além dos vertebrados, que apresentam uma região ácida em seu intestino médio (Vonk & Western, 1984). Assim, o estudo da digestão ácida nestes organismos permite-nos examinar em detalhe este interessante paralelismo evolutivo (muito revelador se incluir também aspectos moleculares). Para realização deste estudo foram escolhidas duas enzimas relacionadas com a digestão ácida em Diptera: uma aspártico-proteinase de Musca domestica, semelhante à catepsina D, e uma lisozima digestiva de Drosophila melanogaster. Para purificar a aspártico-proteinase intestinal de M. domestica, ventrículos anterior e médio de larvas deste inseto foram homegeneizados e centrifugados, sendo o sobrenadante resultante utilizado como fonte de enzima. A combinação de uma cromatografia em coluna de troca iônica seguida de uma filtração em gel mostrou-se como a melhor para a obtenção da aspártico-proteinase intestinal de larvas de M. domestica totalmente purificada. Clones de lisozima de D. melanogaster (LysD) e de A. darlingi (Lysdar) foram utilizados na construção de vetores de expressão a seguir usados na transformação de E. coli linhagem OrigamiTMB (DE3) e P. Pastoris GS115 (his4). As bactérias transformadas com vetor pT7-dar (que continha o gene Lysdar), quando induzidas por IPTG, foram capazes de expressar uma proteína, cujo peso molecular em gel de SDS-PAGE é de cerca de 14 kDa, como o esperado. A lisozima hipotética foi encontrada em corpos de inclusão, que solubilizados por SDS 3% resultaram em proteína inativa. Colônias de P. pastoris transformadas com o vetor pPIC-9-D (contendo o gene LysD) foram submetidas a reação em cadeia com DNA polimerase. Aquelas que geraram produtos de PCR de tamanho coerente com o de uma lisozima foram cultivadas e posteriormente, induzidas por metanol. P. pastoris é capaz de secretar a lisozima induzida. Assim, alíquotas do meio de indução foram utilizadas em ensaios enzimáticos para a detecção da atividade da lisozima intestinal de D. melanogaster. A lisozima é expressa em P. pastoris em grande quantidade (12 mg/L) e com atividade preservada. Foi verificado que há uma intima relação entre a força iônica do meio e o pH ótimo da lisozima intestinal recombinante de D. melanogaster. O pH ótimo é deslocado para valores mais ácidos quando em forças iônicas maiores. Em contrapartida, os valores de atividade obtidos para a lisozima D recombinante de D. melanogaster decrescem com o aumento da força iônica do meio. / Insects are the most numerous of living beings and are found in almost all habitats. The midgut of these animals is the main interface between them and their enviroment. Thus, the study of digestive enzymes or of other proteins relateded to the insect digestive process is putatively useful for the development of new insect control strategies. Houseflies (higher Diptera) are the only animals, besides vertebrates, that present an acidic region in the midgut (Vonk & Western, 1984). Due do that, a detailed analysis of the acidic digestion in these insects may disclose molecular evolutionary paralellisms between those animals. Two enzymes were chosen along the aims discussed: a Musca domestica aspartic-proteinase, similar to cathepsin D and a digestive lysozyme from Drosophila melanogaster. To purify the cathepsin D-like proteinase from M. domestica larvae, larval foreguts and midguts were homogeneized, centrifuged, and the resulting supernatant was used as an enzyme source. Ion-exchange chromatography followed by a gel filtration of enzyme extract resulted in a homogeneous preparation of the enzyme. Clones of lysozyme from D. melanogaster (LysD) and A. darling (Lysdar) were used in the construction of expression vectors, which were used to transform E. coli cells (OrigamiTM B(DE3)) and P. pastoris GS115 (his4). Bacteria transformed with pT7-dar (the expression vector which contained the gene Lysdar), when induced by IPTG, expressed a protein with a molecular weight of 14 kDa, as expected for lysozyme. This protein was found in inclusion bodies that were solubilized in 3% SDS resulting in a protein with no activity. After choosing at random P. pastoris colonies transformed with the expression vector pPIC9-D (containing the gene LysD), they were submited to a PCR. The colonies with 366pb products were grown and induced by methanol. P. pastoris was engineered to excrete the expressed proteins. In accordance to that, about 12 mg of lysozyme were recovered from each litter of culture medium. Recombinant D. melanogaster lysozyme D was more active at acid pH values, when present in media with physiological ionic strengths, and its Km value increased with the ionic strength of media. This is agreement with data obtained with lysozyme D isolated from D. melanogaster midgut. The results support the assertion that this enzyme may be used in crystalographic and site mutagenesis studies to reveal the molecular basis of its catalytic properties.

Insetos abrangem o maior número de espécies descritas, estando distribuídos por praticamente todos os nichos ecológicos. O tubo digestivo destes animais consiste na principal interface entre estes e o meio externo. Assim, o estudo das enzimas digestivas, ou proteínas relacionadas ao processo digestivo em insetos, faz-se fundamental para a tentativa de desenvolver novos métodos de controle que ajam via canal alimentar, como o uso de plantas transgênicas para controlar insetos fitófagos (Felton & Gatehouse, 1996). Diptera superiores são os únicos animais, além dos vertebrados, que apresentam uma região ácida em seu intestino médio (Vonk & Western, 1984). Assim, o estudo da digestão ácida nestes organismos permite-nos examinar em detalhe este interessante paralelismo evolutivo (muito revelador se incluir também aspectos moleculares). Para realização deste estudo foram escolhidas duas enzimas relacionadas com a digestão ácida em Diptera: uma aspártico-proteinase de Musca domestica, semelhante à catepsina D, e uma lisozima digestiva de Drosophila melanogaster. Para purificar a aspártico-proteinase intestinal de M. domestica, ventrículos anterior e médio de larvas deste inseto foram homegeneizados e centrifugados, sendo o sobrenadante resultante utilizado como fonte de enzima. A combinação de uma cromatografia em coluna de troca iônica seguida de uma filtração em gel mostrou-se como a melhor para a obtenção da aspártico-proteinase intestinal de larvas de M. domestica totalmente purificada. Clones de lisozima de D. melanogaster (LysD) e de A. darlingi (Lysdar) foram utilizados na construção de vetores de expressão a seguir usados na transformação de E. coli linhagem OrigamiTMB (DE3) e P. Pastoris GS115 (his4). As bactérias transformadas com vetor pT7-dar (que continha o gene Lysdar), quando induzidas por IPTG, foram capazes de expressar uma proteína, cujo peso molecular em gel de SDS-PAGE é de cerca de 14 kDa, como o esperado. A lisozima hipotética foi encontrada em corpos de inclusão, que solubilizados por SDS 3% resultaram em proteína inativa. Colônias de P. pastoris transformadas com o vetor pPIC-9-D (contendo o gene LysD) foram submetidas a reação em cadeia com DNA polimerase. Aquelas que geraram produtos de PCR de tamanho coerente com o de uma lisozima foram cultivadas e posteriormente, induzidas por metanol. P. pastoris é capaz de secretar a lisozima induzida. Assim, alíquotas do meio de indução foram utilizadas em ensaios enzimáticos para a detecção da atividade da lisozima intestinal de D. melanogaster. A lisozima é expressa em P. pastoris em grande quantidade (12 mg/L) e com atividade preservada. Foi verificado que há uma intima relação entre a força iônica do meio e o pH ótimo da lisozima intestinal recombinante de D. melanogaster. O pH ótimo é deslocado para valores mais ácidos quando em forças iônicas maiores. Em contrapartida, os valores de atividade obtidos para a lisozima D recombinante de D. melanogaster decrescem com o aumento da força iônica do meio. / Insects are the most numerous of living beings and are found in almost all habitats. The midgut of these animals is the main interface between them and their enviroment. Thus, the study of digestive enzymes or of other proteins relateded to the insect digestive process is putatively useful for the development of new insect control strategies. Houseflies (higher Diptera) are the only animals, besides vertebrates, that present an acidic region in the midgut (Vonk & Western, 1984). Due do that, a detailed analysis of the acidic digestion in these insects may disclose molecular evolutionary paralellisms between those animals. Two enzymes were chosen along the aims discussed: a Musca domestica aspartic-proteinase, similar to cathepsin D and a digestive lysozyme from Drosophila melanogaster. To purify the cathepsin D-like proteinase from M. domestica larvae, larval foreguts and midguts were homogeneized, centrifuged, and the resulting supernatant was used as an enzyme source. Ion-exchange chromatography followed by a gel filtration of enzyme extract resulted in a homogeneous preparation of the enzyme. Clones of lysozyme from D. melanogaster (LysD) and A. darling (Lysdar) were used in the construction of expression vectors, which were used to transform E. coli cells (OrigamiTM B(DE3)) and P. pastoris GS115 (his4). Bacteria transformed with pT7-dar (the expression vector which contained the gene Lysdar), when induced by IPTG, expressed a protein with a molecular weight of 14 kDa, as expected for lysozyme. This protein was found in inclusion bodies that were solubilized in 3% SDS resulting in a protein with no activity. After choosing at random P. pastoris colonies transformed with the expression vector pPIC9-D (containing the gene LysD), they were submited to a PCR. The colonies with 366pb products were grown and induced by methanol. P. pastoris was engineered to excrete the expressed proteins. In accordance to that, about 12 mg of lysozyme were recovered from each litter of culture medium. Recombinant D. melanogaster lysozyme D was more active at acid pH values, when present in media with physiological ionic strengths, and its Km value increased with the ionic strength of media. This is agreement with data obtained with lysozyme D isolated from D. melanogaster midgut. The results support the assertion that this enzyme may be used in crystalographic and site mutagenesis studies to reveal the molecular basis of its catalytic properties.

Utilizando uma bibioteca de expressão feita a partir do epitélio do intestino médio da larva de Diatraea saccharalis, nós clonamos e sequenciamos 3 cDNAs completos (DsβglyA, DsβglyB e DsβglyC), além de uma seqüência parcial que teoricamente codificam β-glicosidases. As sequências dos peptídeos obtidos após digestão por tripsina das β-glicosidases βgly1 e βgly2 de D. saccharalis mostraram que DsβglyA codifica a βgly1, caracterizada anteriormente. DsβglyB e DsβglyC provavelmente codificam duas β-glicosidases solúveis com massas moleculares teóricas de, respectivamente, 57,5 KDa e 56,2 KDa. Levando em consideração as semelhanças entre βgly1 e βgly3 e entre DsβglyA e DsβglyC, é razoável supor que DsβglyC codifique a βgly3. Os peptídeos produzidos após a hidrólise de βgly2 por tripsina não são codificados por nenhum dos cDNAs que nós sequenciamos. βgly2 provavelmente é codificada pelo cDNA cuja seqüência ainda está incompleta. A inativação da βgly2 por carbodiimida usando o tio-glicosídeo sinigrina e o O-glicosídeo p-nitrofenil β-D-galactopiranosídeo resulta na mesma constante de inativação, indicando que o mesmo sítio ativo é responsável pela hidrólise dos dois substratos. A mesma conclusão é obtida calculando o Km de βgly2 para os dois substratos e o Ki da inibição que cada um deles causa na hidrólise do outro. Os resultados indicam que uma só enzima é responsável pela hidrólise de sinigrina e p-nitrofenil β-D-glicosídeo com atividade semelhante. Essa propriedade nunca foi descrita para outra tio- ou O-glicosidase. / We used an expression library made from Diatraea saccharalis midgut epithelium and succeeded in cloning and sequencing three complete cDNAs (DsβGlyA; DsβGlyB; DsβGlyC) plus a partial sequence that hypothetically code for β-glycosidases. The sequence of peptides obtained from the purified D. saccharalis β-glycosidases (βGly1 and βGly2) after trypsin digestion shows that DsβGlyA codes for βGly1, an enzyme that had already been characterized. DsβGlyB and DsβGlyC probably code for two soluble β-glycosidases with, respectively, 503 and 493 amino acid residues and theoretical molecular weighs of 57.5 kDa and 56.2 kDa. Taking into account the similarities of βGly1 and βGly3 and of DsβGlyA and DsβGlyC it is reasonable to suppose that DsβGlyC codes for βGly3. The peptides produced after βGly2 hydrolysis by trypsin could not coded by any of the complete sequenced cDNAs, although they might be code by the still partial sequence we have. We determined the chemical inactivation of βGly2 using the thio-glucoside sinigrin and the O-glycoside p-nitrophenyl-β-D-galactoside, and found the same inactivation constant, indicating that the same active site is responsible for the hydrolysis of the two substrates. The same conclusion is reached determining βGly2 Km for both substrates and the Ki for inhibition of the hydrolysis of one substrate using the other as inhibitor. These results indicated that only one enzyme is responsible for the hydrolysis of sinigrin and p-nitrophenyl-β-D-galactoside with similar activities, which is not a property reported before for any O- or S- β-glycosidase.

O milho sempre ocupou lugar de destaque na alimentação de vacas leiteiras no Brasil como principal fonte energética. Entretanto, é crescente o interesse por suplementos alternativos, dentre eles alguns subprodutos da agroindústria, como a polpa cítrica e a raspa de mandioca, com o objetivo de reduzir os custos de alimentação. Este trabalho avaliou a substituição do milho moído fino por polpa cítrica ou raspa de mandioca, variando os teores de amido total da dieta e de amido degradável no rúmen, para vacas no terço final de lactação. Os parâmetros avaliados foram consumo de alimento, produção e composição de leite e condição corporal.O experimento foi conduzido nas instalações do Departamento de Zootecnia da "Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz". Foram utilizadas 24 vacas HPB no terço final de lactação, mantidas em free-stall. Os animais foram agrupados em oito Quadrados Latinos 3x3, de acordo com o número de lactações (primípara ou multípara), dias em lactação e a produção de leite, medida durante os 10 dias do período pré-experimental. Foram utilizados 3 lotes do free-stall, com 8 vacas em cada grupo. O experimento teve a duração de 60 dias, com 3 períodos de 20 dias cada. Os 10 primeiros dias de cada período foram utilizados para adaptação e os 10 dias restantes para coleta de dados. As dietas utilizadas foram isoprotéicas e continham silagem de milho, resíduo de cervejaria, farelo de soja, uréia, mistura mineral e vitamínica e os diferentes suplementos energéticos testados: T1 - milho moído fino; T2 - milho moído fino + polpa cítrica peletizada (50:50) e T3 raspa de mandioca + polpa cítrica peletizada (50:50). Houve tendência de redução de CMS (P<0,13) quando o milho (T1) foi substituído pela mistura de raspa de mandioca + polpa cítrica peletizada (T3). As produções de leite e LCG, os teores e produções de proteína e gordura, lactose e sólidos totais, a eficiência alimentar, o teor de N-uréico e a condição corporal das vacas não foram afetadas pelos tratamentos (P>0,05). / Corn is the major energy supplement for dairy cows in Brazil. However, its increasing price during the last years, has increased the interest for cheaper energy sources, especially by-products as citrus pulp and tapioca meal, to reduce feed costs. The objective of this trial was to evaluate the replacement of fine ground corn by peleted citrus pulp and/or tapioca meal, varying the total and rumen degradable starch levels in the diet for late lactation cows. Group dry matter intake and individual milk yield and composition and body condition score were measured. The trial was conducted at the dairy farm of the Animal Science Department of the Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiróz" - Universidade de São Paulo, in Brazil. Twenty four lote lactation Holstein cows, managed in a free-stall housing were grouped in eight 3x3 Latin Square, according to their number of lactation (primiparous x multiparous), days in milk and milk production measured during a 10 days pre- trial period. Three pens were used with 8 cows each. Total trial lasted 60 days, with three 20 days experimental periods. The first 10 days of each period were use for cows adaptation to treatments, and the last 10 days for data collection. As feed intake was measured for group and not individual cows, the DMI and feed efficiency were analyzed considering every group of 8 cows as an experimental unit (a single 3x3 Latin Square). All the others data were analyzed as eight 3x3 Latin Square design. Diets were isonitrogenous and were composed by corn silage, brewers grains, soybean meal, urea, mineral and vitamin mix and one of the energy sources: fine ground corn (T1); fine ground corn + citrus pulp (50:50) (T2) and citrus pulp + tapioca meal (50:50) (T3). There was a tendency (<0,13) for decrease in dry matter intake when fine ground corn (T1) was replaced by citrus pulp + tapioca meal (T3). Milk and 3,5% fat corrected milk, yields, content and yields of fat, protein, lactose and total solids, feed efficiency, milk urea-N and body condition score were not affected by treatments(P>0,05).

Um enfoque analítico, envolvendo centrifugação diferencial de homogeneizados de cecos gástricos de Rhynchosciara americana preparados em condições brandas e vigorosas, suporta a asserção de que existe uma classe principal de aril-&#945;- e &#946; -glicosidases, aril-&#945;- e &#946;-galactosidases e celobiases que é ligada à membrana plasmática, e duas classes de maltases, aminopeptidases, carboxipeptidases e dipeptidases. Maltases ocorrem na membrana plasmática e no interior de lisossomos na forma solúvel, enquanto que as peptidases (amino-carboxi- e dipeptidase) são encontradas na membrana plasmática e citossol. A ocorrência das enzimas citadas acima na membrana plasmática das células cecais, foi confirmada por resultados obtidos em preparações de microvilosidades realizadas com técnica desenvolvida para enterocito de mamíferos. O tratamento de microvilosidades com solução hiperosmótica de Tris, seguido de centrifugação em gradiente de densidade, permitiu a separação de quatro frações de membrana e de uma fração que contém microvilosidades intactas e, provavelmente, microfilamentos isolados. Eletroferogramas do material recolhido do gradiente mostrou diferenças entre as frações de membrana e sugeriu a ocorrência de actina como componente majoritário dos microfilamentos das microvilosidades. Ensaios enzimáticos nas diferentes frações do gradiente confirmaram a ocorrência de celobiase e carboxipeptidase ligadas à membrana plasmática. Os resultados de distribuição intracelular de hidrolases nos cecos de R. americana permitiram propor que a digestão terminal de proteínas ocorre na membrana plasmática e no citossol, por ação de amino-, carboxi- e dipeptidases, enquanto que a digestão de carboidratos, com exceção da trealose, ocorre somente na superfície das microvilosidades. / An analytical approach involving differencial centrifugation of Rhynchosciara Americana midgut caeca homogenates prepared in mild and in vigorous conditions support the assumption there are one main class of aryl-&#945;- e &#946;-glucosidases, aryl-&#945; - e &#946;-galactosidases and cellobiases, which are plasma membrane bound, and two classes of maltases, aminopeptidades, carboxypeptidases and dipeptidases. Maltases, occur in plasma membrane and in lysosomes (as a soluble enzyme) and the others are found in plasma membrane and cytosol. A succeful purification of caeca cells brush-borders by tecniques used for mammal enterocytes confirmed the assumptions based on differential centrifugation data. Treatment of purified microvilli with a hyperosmotic solution of Tris, followed by density gradient centrifugation, resulted in the separation of four membrane fractions and one fraction containing intact microvilli and, probably, isolated microfilaments. Electropherograms of the material recovered from the gradient showed differences among the membrane fractions, and they permitted to propose that actin is a major component of microvilli microfilaments. Enzymatic assays in the different fractions from the gradient confirmed the occurrence of cellobiase and carboxypeptidase plasma membrana bound. The results permite to propose that the majority of the terminal digestion of proteins and carbohydrates, with the exception of trehalose, occurs on the surface of the insect midgut caeca cells microvilli.

Existem poucas informações sobre exigências de energia de cervídeos brasileiros, dificultando o sucesso de manejo e reprodução em cativeiro. O conhecimento das exigências de energia também é importante para determinar os recursos necessários para sua conservação em parques e reservas. O primeiro objetivo deste experimento foi estudar as exigências nutricionais do veado catingueiro (Mazama gouazoubira) em cativeiro. O segundo objetivo foi observar o comportamento alimentar do veado-campeiro (Ozotoceros bezoarticus) no Parque Nacional das Emas (PNE), descrevendo qualitativamente e quantitativamente as principais espécies vegetais utilizadas para o aporte de nutrientes. A determinação das exigências de energia para mantença utilizou 8 veados-catingueiro de ambos os sexos em cativeiro e foi desenvolvida através de dois métodos: a)equilíbrio de peso e b)água duplamente marcada (2H2 18º). Os animais foram dosados com água duplamente marcada (111,8 mg/kgPV para 2H2O e 163,1 mg/kgPV para H2 18O) e amostras de sangue foram coletadas em intervalos de 3 dias, até que 3 ou 4 meias– vidas dos isótopos tenham decorrido (atingindo o limite de detecção em aproximadamente 30 dias após a dosificação). As curvas de desaparecimento dos isótopos em função do tempo foram utilizadas para calcular o “turnover" de CO2 e H2O. Os resultados obtidos pelos dois métodos foram semelhantes (111,4 e 112,0 kcal/kg.75.d) comprovando que a técnica da água duplamente marcada pode ser utilizada em estudos nutricionais de cervídeos. Informações de doses (mg/kgPV) e intervalo máximo entre aplicação e coleta de sangue (30 dias), permitem o uso desta metodologia em estudos futuros em vida livre. No PNE, veados-campeiro já monitorados com radio colares, permitiram a observação de seu comportamento alimentar. O experimento foi realizado em duas épocas distintas (inverno e verão). As espécies foram analisadas quanto à composição nutricional, para estimar valores energéticos assim como consumo de minerais e proteína. As contribuições das diferentes espécies que compõem a dieta dos cervídeos foram estimadas para duas populações em vida livre, uma com acesso apenas a espécies nativas (área central do parque) e outra com acesso às espécies cultivadas na periferia do PNE. Os sinais isotópicos do carbono 13 e os perfis de n-alcanos foram utilizados para quantificar a contribuição das diferentes espécies ingeridas. Os resultados indicaram que os veados-campeiro utilizam uma ampla gama de partes e espécies vegetais. Sua dieta é composta por aproximadamente 78 ítens, divididos em brotos (38,5%), folhas (15,4%), flores (17,9%), botões florais (12,8%), frutos e sementes (15,4%); de 55 diferentes espécies nativas e 7 culturas agrícolas. Há grande diferença no padrão de consumo entre as populações no interior do parque e aquelas que tem possibilidade de selecionar plantas cultivadas pelo homem. As espécies agrícolas podem contribuir com até 46,9% da dieta dos cervídeos da periferia do parque. Este trabalho determinou as exigências de energia de cervídeos brasileiros, validou o uso de uma técnica indireta para futuros estudos em vida livre e descreveu as espécies e partes utilizadas como aporte de nutrientes por cervídeos em vida livre. / There are limited data on energy requirements of brazilian cervids. Thus, it is difficult to succeed in their management and reproduction in captivity. Knowing the energy requirements is also important to determine the necessary nutritional resources for their conservation in parks and reserves. The first objective was to study the nutritional requirements of the grey-brocket deer (Mazama gouazoubira) in captivity. The second objective was to observe the feeding behavior of the pampas-deer (Ozotoceros bezoarticus) in the Emas National Park (ENP), describing qualitatively and quantitatively the main vegetal species used to supply these animals with nutrients. The determination of energy requirements for maintenance used 8 gray-brocket deer of both sexes in captivity and was carried through two methods: a)weight equilibrium and b)double-labeled water (2H2 18O). The animals were dosed with double-labeled water (111.8 mg/kgBW for 2H2O and 163.1 mg/kgBW for H2 18O) and blood samples were collected with 3 days interval, until 3 or 4 half lives of isotopes had occurred (reached limit of detection at approximately 30 days after the dosage). The curves of isotopes disappearance as a function of time were used to calculate the turnover of CO2 and H2O. The results obtained from the two methods were similar (111.4 and 112.0 kcal/kg.75.d) proving the double-labeled water technique may be used in nutritional studies of cervids. Information on doses (mg/kgBW) and maximum interval between injection and blood collection (30days), allow the use of this methodology in future studies with free ranging deer. In the national park, pampas-deer already monitored with radio colars, facilitated the observation of their feeding behavior. The experiment was conducted at two distinct seasons (winter and summer). The species were analyzed for the nutritional composition, to estimate energy values as well as mineral and protein consumption. The contributions of the different species to the diet of the cervids were estimated for two free ranging populations of the national park, one with access only to native species (central area of the park) and another with access to the crop species cultivated in the periphery of the park. The isotopic signals of carbon 13 and profiles of n-alkanes were used to quantify the contribution of different species to supply the energy demands. The results indicated that pampas-deer feeds on a broad spectrum parts and vegetal species. Its diet was composed of approximately 78 different parts, divided in sprouts (38.5%), leaves (15.4%), flowers (17.9%), floral buttons (12.8%), fruits and seeds (15.4%); from 55 different native species and 7 agricultural cultures. There is a great difference in the intake selection patterns between populations in the interior of the park and those that have access to cropland and the opportunity to choose feeding on native or cultivated plants. The agricultural species can contribute with up to 46.9% of deer diet of the park periphery. This work determined the requirements of energy of Brazilian cervids, validated the use of one indirect technique for use in free ranging animals and described the species and parts used to supply nutrients to cervids in the wild.

O presente trabalho teve o objetivo de avaliar fatores associados à ensilagem da cana-de-açúcar (Saccharum officinarum L.), com destaque para a aplicação de aditivos químicos e microbianos, sobre a composição químico-bromatológica, perdas fermentativas, digestão de nutrientes e desempenho de bovinos de corte. No primeiro experimento, avaliaram-se variedades de cana-de-açúcar, idades de colheita, tempos de armazenamento das silagens e inclusão de uréia como aditivo na ensilagem, sobre composição das silagens, perdas e parâmetros fermentativos. O experimento foi realizado em esquema fatorial 3x2x2x2, usando-se silos experimentais para confecção das silagens. A composição de nutrientes das silagens foi afetada pelos fatores testados. Silagens da variedade IAC86-2480 apresentaram menor teor de fração fibrosa e de matéria seca, e maior digestibilidade in vitro em relação à variedade IAC87-3184. Plantas colhidas aos 15 meses proporcionaram perdas reduzidas de MS. A aplicação de uréia nas ensilagens foi efetiva em reduzir as perdas totais de MS, e não alterou os teores de etanol ou ácido acético, e elevou o teor médio de ácido lático das silagens. Em um segundo experimento foram avaliados os aditivos químicos uréia e benzoato de sódio, e os microbianos Lactobacillus plantarum (LP) e L. buchneri (LB) na ensilagem da cana-de-açúcar, bem como a cana-de-açúcar ensilada sem aditivos, em rações para bovinos providos de cânula, em ensaio de digestão. Os aditivos aplicados alteraram a composição e as recuperações de MS das silagens. O consumo de MS, digestibilidade aparente de nutrientes e comportamento ingestivo dos animais não foram alterados pelos tratamentos testados. Os parâmetros ruminais foram afetados de forma moderada pelos tratamentos experimentais, com concentrações molares médias dos ácidos acético, propiônico e butírico de 60,9; 19,3 e 10,2 mM, respectivamente. Os tratamentos com uréia, LB e benzoato de sódio elevaram moderadamente a degradabilidade efetiva da MS das silagens. Em uma terceira fase, avaliou-se a silagem de cana sem aditivos e silagens contendo doses de LB em rações para bovinos de corte em confinamento. Foram usados 56 tourinhos Nelore e Canchim, alimentados com rações contendo 45% de volumoso. A inoculação com LB alterou de forma moderada a composição das silagens. A silagem controle apresentou teor de etanol três vezes superior aos tratamentos inoculados (1,53 vs 0,45% da MS). A adição de ingredientes concentrados às silagens foi efetiva em melhorar substancialmente as variáveis de estabilidade aeróbia. Silagens aditivadas proporcionaram elevação na ingestão (23,0%) e no ganho de peso dos animais (12,7%), em relação às rações com silagem controle. O comportamento ingestivo dos animais experimentais foi afetado pelos tratamentos, sendo que rações contendo silagem controle necessitaram de maior tempo para ingestão, ruminação e mastigação, em relação aos tratamentos inoculados. A presença de aditivos na ensilagem da cana-de-açúcar foi efetiva em controlar perdas e preservar o valor nutritivo da forragem conservada. / The goal of this trial was to evaluate ensiling associated factors influencing sugar cane (Saccharum officinarum L.)silages, mainly the use of chemical and microbial additives on the chemical composition, fermentative losses, nutrient digestion and performance of beef cattle. On the first trial, sugar cane varieties were evaluated across harvesting forage ages, storage time and the addition of urea over the chemical composition, fermentative parameters and losses. A factorial 3x2x2x2 design was applied upon experimental silos. The nutrient composition of silages was affected by the studied factors. The silages from IAC86-2480 variety showed lower fiber and dry matter contents and higher in vitro digestibility contents than the silage made of IAC87-3184 variety. Plants that were cut at the age of 15 months led to lower DM losses. The urea addition on ensiling was effective on decreasing total DM losses and did not change the ethanol or acetic acid contents, however increased the mean lactic acid content of silages. On a second trial, the chemical additives, urea and Na-benzoate, were evaluated and the microbial inoculants Lactobacillus plantarum (LP) and L. buchneri were also studied on sugar cane ensiling, compared to the control sugar cane silage, by using ruminally cannulated steers fed TMR rations in a digestion trial. The additives altered the composition and the DM recovery rate of the silages. Overall DM intake, apparent in vivo digestibilities and animal behavior were not affected by treatments. The ruminal parameters were slightly affected by treatments, which averaged molar concentrations of acetic, propionic and butyric acids of 60.9, 19.3 and 10.2 mM, respectively. The urea, LB and Na-benzoate treatments promoted moderate increase on DM effective degradabilities of silages. On the third trial, sugar cane silage without additives and LB added silages were studied on the feedlot beef cattle rations. Fifty six Nellore or Canchim beef bulls were assigned to treatments and fed with 45% forage rations. The LB silages had small changes on the chemical composition and the control silage showed a three times increased content of ethanol when compared to inoculated silages (1.53 vs 0.45% of DM). The concentrates added to silages were effective on improving the aerobic stability parameters. The rations containing LB added silages provided increase on the DM intake (23.0%) and daily weight gain of animals (12.7%), when compared to the control silage ration. The ingestive behavior of experimental bulls was affected by treatments, where control silage ration showed increased feeding, rumination and chewing time, when compared to the inoculated silages. The additives on sugar cane ensiling were effective to prevent losses and to preserve the nutritive value of ensiled forage.

Objetivou-se com este trabalho avaliar o efeito de fontes e teor de fibra no consumo voluntário, no comportamento ingestivo, na efetividade de fontes de fibra, na cinética digestiva e alguns aspectos do metabolismo ruminal de bovinos de corte. Foram utilizados seis bovinos machos castrados da raça Nelore contendo cânula no saco dorsal do rúmen, alojados em gaiolas metabólicas, em delineamento do tipo quadrado latino 6x6, contendo 19 dias de período experimental cada. Seis rações foram formuladas com diferentes teores e fontes de fibra: CN (controle negativo com 10% da fração FDN de silagem de milho); CP (controle positivo com 20% da fração FDN de silagem de milho); e quatro rações contendo 10% da fração FDN de silagem de milho e 10% da fração FDN de cada uma das seguintes fontes: bagaço in natura de cana-de-açúcar (BAG), cana-de-açúcar (CAN), casca de soja (CSOJ) e torta de algodão desengordurada (TALG). Comparado ao tratamento CP, observou-se CMS semelhante (P>0,05) entre os tratamentos CAN, CSOJ e TALG (9,20, 8,60, 8,83 e 9,52 kg.dia-1, respectivamente). Contudo, tratamento BAG promoveu depressão no CMS (6,97 kg.dia-1). Ração contendo menor teor de fibra (CN) apresentou resultado intermediário quanto ao CMS. Para estimar o fator de efetividade física (fef) ou fator de efetividade (fe) foram utilizados os métodos de bioensaio preconizado por Armentano e Pereira (1997). Além disso, foram utilizados métodos laboratoriais recomendados por Mertens (1997) e Lammers; Buckmaster; Heinrichs (1996) para estimar o fef de fontes de fibra (fef1,18 ou fef>8,0 mm, respectivamente). Ao calcular o fef das fontes de fibra utilizando métodos laboratoriais, foi possível evidenciar grande divergência entre estes e os valores calculados pelos métodos de bioensaio. Medidas de efetividade física calculadas por meio de métodos laboratoriais (fef1,18 ou fef>8,0 mm) apresentaram baixa ou nenhuma correlação (P>0,05) com tempo de ruminação, tempo de mastigação, pH ruminal e mat ruminal. Por outro lado, ao avaliar os fef calculados conforme Armentano e Pereira (1997), coeficientes de correlação adequados foram observados (P<0,05) quando relacionados com tempo de ruminação, tempo de mastigação e mat ruminal. Equações de regressão envolvendo cálculos de efetividade física utilizando métodos laboratoriais e bioensaio foram sugeridas para que se pudesse oferecer aplicabilidade em condições de campo. Os valores médios de pH ruminal foram influenciados pelo nível e fonte de fibra. A concentração total de ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) foi significativamente alterada (P<0,05) em função dos diferentes tratamentos. Rações contendo fontes e teores de fibra não alteraram o tempo médio de digestão da MS e da fração FDN (P>0,05), como também, não provocaram alteração (P>0,05) nas frações A e U referente à MS avaliadas pelo ensaio de degradabilidade in situ. Teor e fontes de fibra alteraram (P<0,05) a taxa de passagem do pool de partículas escapáveis no rúmen retículo (ke), o TMRRp e o TMRTp. Não houve diferença (P>0,05) na taxa assintótica de líquidos (L, h-1), no tempo de trânsito da fase líquida (TTL, h), como também, no TMRRL e TMRTL entre os tratamentos avaliados (média de 0,11 h-1, 8,73, 20,6 e 29,6 horas respectivamente). / This study aimed to evaluate the effect of different sources of fiber on voluntary intake, ingestive behavior, on effectiveness fiber sources, on digestive kinetics and some aspects of the rumen metabolism in beef cattle. Six ruminally canulated Nellore steers, housed in tie-stall barns, were used in a 6 x 6 Latin square design with 19 days of experimental periods each. Each experimental period consisted of 10 days of adaptation to the experimental diet and 9 days of data collection. Six diets were formulated with different contents and sources of fiber: NC (negative control - with 10% of the NDF fraction from corn silage), PC (positive control - with 20% of the NDF fraction from corn silage) and four diets containing 10% of NDF fraction from corn silage and 10% of the NDF fraction from each the following sources: sugarcane (SC), sugarcane bagasse (SCB), soybean hulls (SH) and high oil cottonseed meal (HOCM). In comparison to the PC treatment, it was observed similar dry matter intake (DMI) (P>0.05) between the treatments SC, SH e HOCM (9.20, 8.60, 8.83 and 9.52 kg.day-1, respectively). However the SCB treatment decreased DMI (6.97 kg.day-1). The diet containing lower fiber level (NC) presented an intermediate result in relation to DMI. To estimate physical effectiveness factor (pef) or effectiveness factor (fe), bioassay methods recommended by Armentano and Pereira (1997) were used. Also, laboratory methods recommended by Mertens (1997) and Lammers; Buckmaster, Heinrichs (1996) to estimate the effectiveness factor of physical fiber sources (fef1,18 or pef>8.0mm, respectively) were used. There was a large discrepancy between physical effectiveness factor of fiber sources when calculated by laboratory or bioassay methods. Measurements of physical effectiveness calculated by laboratory methods (fef1.18 or fef>8.0mm) showed low or no correlation (P> 0.05) with rumination time, chewing time, rumen pH and ruminal mat. On the other hand, when pef was calculated according to Armentano and Pereira (1997), appropriate correlation coefficients were observed (P <0.05) between pef and rumination time, chewing time and ruminal mat. Regression equations involving calculations of physical effectiveness using laboratorial methods and bioassays have been proposed to provide applicability in field conditions. The mean ruminal pH levels were influenced by the content and source of fiber. The concentration of total short-chain fat acids (SCFA) were significantly altered (P<0.05) according to the different treatments. Diets containing different sources and contents of fiber did not change the average time of digestion from the DM and NDF fraction (P>0.05), also they did not cause changes (P>0.05) in the A and U fractions of the DM evaluated by the in situ degradability study. Content and fiber sources changed (P<0.05) the ke, the TMRRp and the TMRTp. No difference was observed (P>0.05) on asymptotic rate of fluid (L, h- 1), along the transit time of the fluid phase (TTL, h) and TMRRL and TMRTL between different treatments (average of 0.11 h-1, 8.73, 20.6 and 29.6 hours, respectively).