Titre de l'écran-titre (visionné le 20 mars 2023) / La transducine est une protéine G, composée de trois sous-unités (alpha, $G_α$t; bêta, $G_β$t; gamma, $G_γ$t). La liaison entre la rhodopsine et la $G_{αβγ}$t provoque l'échange du GDP pour le GTP au niveau de la sous-unité $G_α$t, résultant en la dissociation entre les sous-unités $G_α$t et $G_{βγ}$t. Ce projet de recherche est centré sur l'étude des sous-unités $G_β$t et $G_γ$t et du complexe formé par ces deux sous-unités ($G_{βγ}$t), afin de déterminer la stabilité de leur structure individuelle ainsi que celle de l'hétérodimère $G_{βγ}$t. La sous-unité $G_γ$t a été surexprimée dans E. coli en fusion avec deux étiquettes de purification et a ensuite été purifiée par chromatographie d'affinité. L'ADN de la sous-unité $G_β$t a été synthétisé commercialement, individuellement et en fusion avec des étiquettes. Des essais de surexpression de la sous-unité $G_β$t ont été faits dans divers types de cellules hôtes. Toutefois, de faibles quantités de la sous-unité $G_β$t ont été obtenues sous une forme soluble, nécessitant l'utilisation du détergent dodécylsulfate de sodium (SDS) pour optimiser sa production. La sous-unité $G_β$t a ensuite été purifiée en utilisant le même protocole que dans le cas de la sous-unité $G_γ$t. Des travaux ont été faits pour reconstituer l'hétérodimère $G_{βγ}$t en procédant au mélange équimolaire de la sous-unité $G_γ$t purifiée et de la protéine de fusion de la $G_β$t purifiée avec ses étiquettes. Des mesures additionnelles de chromatographie d'exclusion de taille et d'immunobuvardage de type western seront nécessaires pour confirmer la formation de l'hétérodimère $G_{βγ}$t. Des segments externes des bâtonnets ont été purifiés à partir d'yeux bovins afin de purifier la forme farnésylée des sous-unités $G_{βγ}$t pour comparer ses propriétés avec celles de l'hétérodimère $G_{βγ}$t reconstitué. Finalement, ces travaux ont permis de mettre au point un protocole afin de surexprimer et de purifier les sous-unités $G_β$t et $G_γ$t ainsi que pour tenter de former l'hétérodimère $G_{βγ}$t, / Transducin is a G protein composed of three subunits (alpha, $G_α$t; beta, $G_β$t; gamma, $G_γ$t). The binding between rhodopsin and $G_{αβγ}$t causes the exchange of GDP for GTP on the $G_α$t subunit, which results in the dissociation between the $G_α$t and the $G_{βγ}$t subunits. This research project focuses on the study of the $G_α$t and the $G_{βγ}$t subunits as well as the complex formed by these two subunits ($G_{βγ}$t), in order to determine the stability of their individual structure as well as that of the $G_{βγ}$t heterodimer. The $G_γ$t subunit was overexpressed in E. coli in fusion with two purification tags. This subunit was then purified by affinity chromatography.The DNA of the $G_β$t subunit has been synthesized commercially, individually as well as in fusion with purification tags. The $G_β$t subunit has been overexpressed using various types of host cells. However, low amounts of the soluble $G_β$t subunit were obtained, which required the use of the detergent sodium dodecyl sulfate (SDS) to optimize its production. The $G_β$t subunit was purified using the same protocol as that used for the $G_γ$t subunit. Work has been done to reconstitute the $G_{βγ}$t heterodimer by preparing equimolar mixtures of the $G_γ$t subunit and the $G_β$t fusion protein after their purification. Additional measurements of size-exclusion chromatography and western blot will be necessary to confirm the formation of the $G_{βγ}$t heterodimer.Rod outer segments were purified from from bovine eyes to prepare farnesylated $G_{βγ}$t in order to compare its properties with that of reconstituted $G_{βγ}$t heterodimer. Finally, this research work allowed to develop a protocol in order to overexpress and purify the $G_β$t and $G_γ$t subunits as well as to tentatively reconstitute the $G_{βγ}$t heterodimer.

Le cotransporteur Na⁺-K⁺-Cl⁻ de type 2 (NKCC2) appartient à la famille des cotransporteurs cation-Cl⁻ (CCC). Il existe en tant que trois variants d'épissage, appelés A, B et F, qui ne diffèrent entre eux que de 32 acides aminés et qui sont tous localisés sur la membrane apicale de l'anse ascendante de Henle (AAH) à l'état homodimérique. Ils sont cependant exprimés de façon différentielle : NKCC2F se retrouve à la partie initiale de l'AAH où il assure une réabsorption importante du NaCl pour le maintien du volume extracellulaire alors que NKCC2A et NKCC2B se retrouvent à la partie distale de l'AAH et dans la macula densa où ils assurent une réabsorption plus modeste du NaCl pour aider au maintien du volume extracellulaire et soutenir la rétroaction tubuloglomérulaire. Comme « A » et « B » se retrouvent dans des types cellulaires communs, nous nous sommes demandé : 1) s'ils pouvaient former des hétérodimères AB dont les caractéristiques de transport ionique différaient de AA et BB et 2) si les quantités relatives de AA, AB et BB pouvaient être régulés pour permettre à l'AAH distale et à la macula densa d'opérer adéquatement à l'intérieur d'un éventail de concentrations ioniques plus large. L'objectif de recherche a donc été de générer des constructions d'ADNc où deux variants sont connectés entre eux par un « linker » inerte pour forcer la formation de dimères AA, AB ou BB, d'exprimer le produit de ces constructions dans des ovocytes de Xenopus laevis et d'en caractériser la cinétique de transport. Nous avons trouvé que des hétérodimères déployaient des caractéristiques fonctionnelles uniques (différentes par rapport à AA ou BB). Les vitesses maximales de transport atteintes par l'hétérodimère AB étaient beaucoup plus élevées que les homodimères AA et BB. Nos données suggèrent ainsi que les sous-unités assemblées coopèrent entre elles durant le processus de transport. Nos données ouvrent aussi la voie sur la possibilité que la quantité d'hétérodimères formés puisse être régulée de manière à permettre un spectre de réponses en fonction des besoins à combler. / The Na⁺-K⁺-Cl⁻ cotransporter type 2 (NKCC2) belongs to the cation-Cl⁻ cotransporter (CCC) family. It exists as three splice variants called A, B and F that differ among each other by 32 residues and that are all localized on the apical membrane of the thick ascending loop of Henle (TALH) as homodimers. However, they are differentially distributed along this nephron segment: NKCC2F is localized in the initial part of the TALH where it ensures substantial NaCl reabsorption to maintain the extracellular fluid volume and NKCC2A and NKCC2B are localized in the distal part of the TALH where it ensure more modest NaCl reabsorption to help in the maintenance of the extracellular fluid volume and support the tubuloglomerular feedback. As "A" and "B" are localized in the same cellular types, we asked ourselves: 1) whether they could form AB heterodimers with transport characteristics that differ from AA and BB and 2) whether the relative quantities of AA, AB and BB formed could be regulated to allow the distal TALH and macula densa to operate adequately within a wider range of ionic concentrations. My research objective was thus to generate cDNA constructs in which the A and/or B variants are connected to each other by an inert "linker" to force the formation of AA, AB or BB by proximity, to express the product of these cDNA constructs in Xenopus laevis oocytes and to characterize the transport kinetics of the NKCC2 produced. We found that AB heterodimers exhibited unique functional characteristics (relative to AA or BB). In particular, maximal transport rates were much higher for the AB heterodimers than for the AA and BB homodimers. Our data therefore suggest that the assembled subunits cooperate with each other during the transport cycle. Our data also pave the way towards the possibility that the quantity of AB heterodimers formed is regulated such that an array of responses are allowed as a function of the needs to be met.

Les dimères interbrins sont des lésions de type complexe, où les deux brins d'ADN sont pontés de façon covalente. Par conséquent, ce type de lésion est très toxique pour la cellule, car il nuit à la séparation des brins d'ADN nécessaire à des processus cruciaux pour la cellule, comme la réplication et la transcription. De plus, des expériences récentes montrent que la réparation des dimères interbrins passe par la formation d'un bris double brin, une autre lésion avec un potentiel toxique élevé. Ce n'est que tout récemment qu'on a montré que la radiation ionisante menait à la formation de dimères interbrins dans l'ADN cellulaire. On en sait donc encore très peu sur les conditions dans lesquelles se produisent les dimères et comment ils sont réparés. Récemment, à la suite d'une exposition aux radiations ionisantes, notre groupe a mis en évidence la formation de dimères interbrins dans un ADN où une thymidine avait été remplacée par le 5-bromo-2'-désoxyuridine (BrdU). Ces dimères n'étaient formés que lorsque le BrdU se trouvait au centre d'une zone mésappariée. Puisque c'était la première fois que ce type de dommage était observé lors d'une exposition de l'ADN bromé à la radiation ionisante, ma thèse a porté sur l'exploration de la formation du dimère interbrin, particulièrement sur les conditions qui favorisaient sa formation.Les trois articles présentés dans cette thèse montrent que la forme de l'ADN (forme A vs forme B), la séquence, ainsi que le type de radiation employé ont une influence importante sur le type et la fréquence du dommage produit. Ces résultats montrent qu'on en sait encore très peu sur le mécanisme réel de radiosensibilisation de l'ADN bromé dans les cellules. Cependant, ils mettent aussi en évidence la réactivité distincte des régions rnésappariées de l'ADN, ainsi que leur fort potentiel pour la formation de dimères. Or, ces régions mésappariées ne représentent qu'une fraction des structures secondaires et tertiaires de l'ADN présentes dans la cellule.

Ce mémoire est présenté à la Faculté de médecine et des sciences de la santé de l'Université de Sherbrooke en vue de l'obtention du grade de maître ès sciences (M.Sc.) en radiobiologie (2009). Un jury a révisé les informations contenues dans ce mémoire. Il était composé de professeurs de la Faculté de médecine et des sciences de la santé soit : Darel Hunting PhD, directeur de recherche (département de médecine nucléaire et radiobiologie), Léon Sanche PhD, directeur de recherche (département de médecine nucléaire et radiobiologie), Richard Wagner PhD, membre du programme (département de médecine nucléaire et radiobiologie) et Guylain Boissonneault PhD, membre extérieur au programme (département de biochimie). Le 5-bromodéoxyuridine (BrdU), un analogue halogéné de la thymidine reconnu depuis les années 60 comme étant un excellent radiosensibilisateur. L'hypothèse la plus répandue au sujet de l'effet radio sensibilisant du BrdU est qu'il augmente le nombre de cassures simple et double brin lorsqu'il est incorporé dans l'ADN de la cellule et exposé aux radiations ionisantes. Toutefois, de nouvelles recherches semblent remettre en question les observations précédentes. Ces dernières études ont confirmé que le BrdU est un bon radiosensibilisateur, car il augmente les dommages radio-induits dans l'ADN. Mais, c'est en étant incorporé dans une région simple brin que le BrdU radiosensibilise l'ADN. Ces recherches ont également révélé pour la première fois un nouveau type de dommages produits lors de l'irradiation de l'ADN contenant du BrdU : les dimères interbrins. Le but de ces travaux de recherche est de déterminer si la présence de bromodéoxyuridine dans l'ADN augmente l'induction de bris simple et / ou double brin chez les cellules irradiées en utilisant de nouvelles techniques plus sensibles et spécifiques que celles utilisées auparavant. Pour ce faire, les essais comètes et la détection des foci H2AX phosphorylée pourraient permettre d'établir les effets engendrés par le BrdU au niveau cellulaire. Notre hypothèse (basée sur des résultats préliminaires effectués dans notre laboratoire) est que l'irradiation de l'ADN cellulaire en présence de BrdU augmentera le nombre de bris simple brin sans toutefois augmenter le nombre de bris double brin. Les résultats présentés dans ce mémoire semblent corroborer cette hypothèse. Les nouvelles méthodes d'analyse, soient l'essai comète et la détection des foci [gamma]-H2AX remettent en question ce qui a été dit sur le BrdU au sujet de l'induction des cassures double brin depuis plusieurs années. L'ensemble de ces nouveaux résultats effectué à l'aide de cellules ayant incorporées du BrdU sont en corrélation avec de précédents résultats obtenus dans notre laboratoire sur des oligonucléotides bromés. Ils réaffirment que l'irradiation combinée au BrdU augmente l'induction de bris simple brin mais pas de bris double brin. L'investigation approfondie des mécanismes d'action non élucidés du BrdU au niveau cellulaire et son utilisation à des moments stratégiques pendant le traitement de radiothérapie pourraient accroître son efficacité à des fins d'utilisation clinique.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

L'utilisation de liens non covalents forts entre des chaînes polymères améliore considérablement les propriétés des matériaux. Ainsi, il est possible d'obtenir des propriétés polymères avec des petites molécules fonctionnalisées. Nous décrivons la synthèse d'un nouveau groupe associatif supramoléculaire simple à synthétiser, le groupe amidoéthylimidazolidone. En synthétisant la 1-(2-aminoethyl)-2-imidazolidone, ainsi que d'autres dérivés réactifs comportant notre groupe associatif, on peut envisager la synthèse de matériaux comportant ce motif et s'adapter à tout type de chimie. Le greffage de ce sticker de manière contrôlée sur des dimères d'acides gras donnent des molécules qui, malgré leur petite taille, se comportent comme des polymères et des réseaux supramoléculaires semi-cristallins dans les propriétés peuvent être modulées selon le grade de dimère choisi. En fondu, les systèmes se comportent comme des polymères ramifiés en cours de gélification. De façon encore plus originale, le greffage d'urée sur des dimères d'acides gras déjà fonctionnalisés donne également des petites molécules, mais qui se comportent comme élastomères et qui ont en plus la propriété d'auto-cicatrisation. Ce phénomène est interprété par un mécanisme de reformation des liaisons H rompues lors de la fracture.

Cette thèse présente une étude expérimentale de la fluorescence induite par laser analysée par un spectromètre à transformée de Fourier haute résolution de la molécule KLi. Des courbes de potentiel précises ont été calculées pour l'état fondamental, X1+, de 39K7Li et 39K6Li. Une étude simultanée de ces deux isotopologues a établi une brisure de l'approximation de Born-Oppenheimer faible mais significative. Nous avons aussi détecté 6 niveaux vibrationnels élevés de l'état a3+, également corrélé à l'asymptote atomique Li(2s) + K(4s). Bien que les données ne couvrent que 25 % du puits de potentiel, une expression analytique donne une bonne extrapolation vers le minimum du potentiel et ajuste toutes les données dans limites de l'incertitude expérimentale. Une expérience similaire de CuCl2 formé en jet supersonique a conduit à déterminer la constante de spin-orbite de l'état X2g de CuCl2. Des spectres de polarisation de NaLi ont été aussi analysés, donnant des informations préliminaires sur deux états excités

Les dimères d'alcalins ont été largement étudié ces dernières années par les techniques de spectroscopie et par la photoassociation d'atomes froids. <br />L'un des objectifs de ce travail consiste en l'obtention de données moléculaires adaptées à l'interprétation de processus collisionnels. Nous avons entrepris une étude systématique des ions moléculaires alcalins, en nous attachant à évaluer la précision des résultats en fonction des hypothèses retenues. Nous avons comparé nos résultats obtenus avec une méthode de pseudopotentiel, pour les ions lourds Rb2+, Cs2+ et RbCs+ à ceux obtenus avec une méthode de potentiel modèle.<br />Les taux de photoassociation de paires d'atomes mixtes d'alcalins et les taux de formation de molécules froides des dimères dans leur état fondamental ont été calculés avec une approche perturbative où les fonctions d'onde sont exactement déterminées. Ces taux ont la même grandeur pour tous les dimères contenant les atomes Rb et Cs. <br />Les taux de formation de molécules froides sont similaires à ceux mesurés et calculés pour les molécules de Cs2. Nous avons étudié le cas spécifique de la photoassociation dans deux états excités couplés par une interaction spin-orbite mettant en relief le rôle du couplage résonnant dans la formation de molécules froides stables dans des niveaux peu excités.

Le modèle de dimères est un système de mécanique statistique qui modélise l'adsorption de molécules diatomiques sur la surface d'un cristal, représenté par un réseau périodique plan biparti. On attribue à chaque type d'arête une énergie. Pour une telle distribution d'énergie, il existe une famille à deux paramètres de mesures de Gibbs, dont les comportements sont classifiés en trois phases : gazeuse, liquide, solide.<br /><br />Dans la première partie, on étudie le comportement d'un tel système près de la transition liquide-solide. En examinant le cas du réseau hexagonal, nous exhibons deux types de comportements limites. Le premier est une collection de chemins aléatoires conditionnés à s'éviter. Le deuxième, le modèle du collier de perles, est un processus ponctuel sur ZxR. Ces deux modèles limites ont pour marginales le processus déterminantal sur R avec noyau sinus, décrivant aussi les valeurs propres des grandes matrices aléatoires de l'ensemble GUE. Le modèle du collier de perles est universel : on montre qu'il est la limite de tout modèle de dimères sur un graphe planaire biparti périodique.<br /><br />Dans une deuxième partie, on étudie la statistique des motifs dessinés par des dimères. Les fluctuations de densité d'un motif convergent à la limite d'échelle vers un champ gaussien. Dans le cas liquide, l'objet limite est la somme d'une dérivée du champ libre et d'un bruit blanc indépendant. Pour une mesure gazeuse, la limite est juste un bruit blanc.<br /><br />Enfin, on aborde un problème de dénombrement de chemins sur le graphe-échelle, lié à l'étude du noyau de la chaleur sur le groupe de l'allumeur de réverbères, ainsi qu'à celle des opérateurs de Schrödinger aléatoires.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal