The knowledge of the three-dimensional structures of proteins and polypeptides is essential to understand their functions. The work shown in this thesis has two objectives. The first one is to develop a new analytical method based on maximum entropy (ME) theory to analyze NMR experimental data such as NOEs and J-couplings in order to reconstitute φ,ψ Ramachandran plots of flexible biomolecules. Two model systems have been used, the flexible polypeptide motilin and the disaccharide α-D-Mannosep-(1-2)-α-D-Mannosep-O-Me (M2M). The experimental data was defined as constraints that were combined with prior information (priors) which were the φ,ψ distributions obtained from either a coil library, the Protein DataBank or Molecular Dynamics Simulations. ME theory was utilized to formulate φ,ψ distributions (posteriors) that are least committed to the priors and in full agreement with the experimental data. Reparamerization of the Karplus relation was necessary to obtain realistic distributions for the M2M. Clear structural propensities were found in motilin with a nascent α-helix in the central part (residues Y7-E17), a left handed 31 helix in the C-terminus (R18-G21) and an extended conformation in the N-terminus. The contribution of each residue to the thermodynamic entropy (segmental entropy) was calculated from the posteriors and compared favorably to the segmental entropies estimated from 15N-relaxation data. For M2M the dominating conformation of the glycosidic linkage was found to be at φH=-40° ψH=33°, which is governed by the exo-anomeric effect. Another minor conformation with a negative ψH angle was discovered in M2M. The ratio between both populations is about 3:1. The second part of the thesis is a structural study of a DNA-binding protein, the C repressor of the P2 bacteriophage (P2 C). P2 C represses the lytic genes of the P2 bacteriophage, thereby directing the P2 lifecycle toward the lysogenic lifemode. The crystal and solution structures of P2 C have been solved by X-ray crystallography and NMR, respectively. Both structures revealed a homodimeric protein with five rigid α-helices made up by residues 5-66 and a β-strand conformation in residues 69-76 in each monomer. 15N-relaxation data showed that the C-terminus (residues 85-99) is highly flexible and fully unstructured. A model representing the P2 C-DNA complex was built based on the structure and available biochemical data. In the model, P2 C binds DNA cooperatively and two homodimeric P2 C molecules are close enough to interact and bind one direct DNA repeat each. / At the time of the doctoral defense, the following papers were unpublished and had a status as follows: Paper 4: In press. Paper 5: Manuscript.

Using reverse genetics, we analyzed a chikungunya virus (CHIKV) isolate of the Indian Ocean lineage lacking direct repeat (DR) elements in the 3′ untranslated region, namely DR1a and DR2a. While this deletion mutant CHIKV-∆DR exhibited growth characteristics comparable to the wild-type virus in Baby Hamster Kidney cells, replication of the mutant was reduced in Aedes albopictus C6/36 and Ae. aegypti Aag2 cells. Using oral and intrathoracic infection of mosquitoes, viral infectivity, dissemination, and transmission of CHIKV-∆DR could be shown for the well-known CHIKV vectors Ae. aegypti and Ae. albopictus. Oral infection of Ae. vexans and Culex pipiens mosquitoes with mutant or wild-type CHIKV showed very limited infectivity. Dissemination, transmission, and transmission efficiencies as determined via viral RNA in the saliva were slightly higher in Ae. vexans for the wild-type virus than for CHIKV-∆DR. However, both Ae. vexans and Cx. pipiens allowed efficient viral replication after intrathoracic injection confirming that the midgut barrier is an important determinant for the compromised infectivity after oral infection. Transmission efficiencies were neither significantly different between Ae. vexans and Cx. pipiens nor between wild-type and CHIKV-∆DR. With a combined transmission efficiency of 6%, both Ae. vexans and Cx. pipiens might serve as potential vectors in temperate regions.

La bactérie Deinococcus radiodurans est connue pour sa capacité à résister à un grand nombre de traitements génotoxiques parmi lesquels on peut citer l’exposition aux rayons ionisants, aux ultra-violets, à la mitomycine C, à la dessication et au stress oxydant. Elle est capable lors d’une exposition à des doses extrêmes de rayons γ générant des centaines de cassures de l’ADN de reconstituer un génome intact en seulement 2 à 3 heures via un mécanisme original, l’ESDSA, impliquant une synthèse massive d’ADN pendant la phase de réparation des cassures de l’ADN. En plus de mécanismes efficaces de réparation de l’ADN, elle possède un kit de survie comprenant une compaction importante du nucléoïde, des mécanismes de protection des protéines contre l’oxydation, une réponse originale aux lésions de l’ADN et des protéines spécifiques induites après irradiation. Tous ces facteurs contribuent au maintien de l’intégrité du génome et à la survie de la cellule lors de l’exposition à différents agents génotoxiques. Souvent considéré comme un organisme ayant une stabilité génomique exceptionnelle, cette bactérie possède dans son génome un grand nombre de séquences répétées et des éléments mobiles et est par ailleurs naturellement compétente. Ce sont autant de facteurs pouvant participer à la variabilité génétique de cette espèce. Je me suis donc intéressée lors de ma thèse à deux processus pouvant participer à l’instabilité génétique chez D. radiodurans : la recombinaison entre séquences répétées et la transformation naturelle.L’introduction dans le génome de D. radiodurans de séquences répétées directes de 438 pb séparées par des régions d’ADN d’une longueur allant de 1479 pb à 10 500 pb m’a permis de mettre en évidence le rôle majeur joué par l’appariement simple brin (Single Strand Annealing ou SSA) impliquant la protéine DdrB, spécifique des Deinococcaceae, joue un rôle majeur dans la recombinaison « spontanée » entre les séquences répétées en absence de la recombinase RecA. L’absence de DdrB dans des souches déficientes pour la recombinaison augmente davantage la perte de viabilité observée dans ces souches ce qui suggère que le SSA participe à la prise en charge de fourches de réplication bloquées, source majeure d’instabilité génétique en absence de stress extérieur, si ces fourches ne peuvent être prise en charge par des voies impliquant des protéines de recombinaison. Je me suis également intéressée à la transformation naturelle et aux protéines impliquées dans ce processus chez D. radiodurans. J’ai pu démontrer que la protéine DprA impliquée dans la protection de l’ADN simple brin et le chargement de RecA sur l’ADN simple brin internalisé lors de la transformation de nombreuses espèces comme Streptococcus pneumoniae, Bacillus subtilis ou Helicobacter pylori, est également impliquée dans la transformation chez D. radiodurans. J’ai pu montrer également qu’en plus de jouer un rôle majeur dans la transformation par de l’ADN plasmidique, DdrB est impliquée dans la transformation par de l’ADN génomique si la protéine DprA est absente. / The bacterium Deinococcus radiodurans is known for its ability to withstand a large number of genotoxic treatments, including exposure to ionizing or ultraviolet radiation, mitomycin C, desiccation, and oxidative stress. It is able, upon exposure to extreme doses of γ-radiation generating hundreds of DNA breaks, to reconstitute an intact genome in only 2 to 3 hours via an ESDSA mechanism, involving massive DNA synthesis during DNA double strand break repair. Together with efficient DNA repair mechanisms, D. radiodurans possesses a survival kit comprising significant compaction of its nucleoid, protection mechanisms against protein oxidation, an original response to DNA damage and specific proteins induced after irradiation. All of these contribute to the maintenance of genomic integrity and cell survival upon exposure to various genotoxic agents. In spite of the idea that D. radiodurans is an organism with outstanding genomic stability, this bacterium has in its genome a large number of repeat sequences and mobile elements and is also naturally competent. All these factors contribute to the genetic variability of species. I was interested in two processes that can play a role in genetic variability in D. radiodurans: recombination between repeated sequences and natural transformation.The introduction, into the genome of D. radiodurans, of 438 bp direct repeated sequences separated by DNA regions ranging from 1,479 bp to 10,500 bp in length allowed me to demonstrate the major role of Single Strand Annealing (SSA) involving the DdrB protein specific for Deinococcaceae, in the "spontaneous" recombination between the repeated sequences in the absence of the RecA recombinase. The absence of DdrB in strains deficient for recombination further increased the loss of viability observed in these strains, suggesting that SSA is required for the management of blocked replication forks, a major source of genetic instability in the absence of external stress when these forks cannot be rescued by pathways involving recombination proteins.I was also interested in the natural transformation and proteins involved in this process in D. radiodurans. I demonstrated that DprA protein involved in DNA single strand protection and loading of RecA on single-stranded DNA internalized during transformation of many species such as Streptococcus pneumoniae, Helicobacter pylori, or Bacillus subtilis, is also involved in this process in D. radiodurans. I also showed that, in addition to playing a major role in transformation by plasmid DNA, DdrB is also involved in transformation by genomic DNA of cells devoid of the DprA protein.

Zusammenfassung Yauhen Karliuk Einfluss der 3' nichttranslatierten Region von Chikungunya-Virus auf die Replikation in verschiedenen Stechmückenarten Institut für Tierhygiene und Öffentliches Veterinärwesen der Veterinärmedizinischen Fakultät, Universität Leipzig Eingereicht im Februar 2022 52 Seiten, 7 Abbildungen, 116 Literaturangaben, 1 Publikation Schlüsselwörter: Chikungunya-Virus; 3′ UTR; direct repeats (DRs); CHIKV 3́ UTR-Deletionsmutante; Vektorkompetenz; Aedes vexans; Culex pipiens Einleitung: Arthropoden-übertragene Viren (Arboviren) spielen weltweit eine große Rolle für die Gesundheit von Menschen und Tieren. Das Chikungunya-Virus (CHIKV) wird v.a. durch Stechmücken der Gattung Aedes übertragen. Die Hauptvektoren sind Aedes aegypti (Ae. aegypti) und Aedes albopictus (Ae. albopictus), wobei letzterer sich zunehmend auch in gemäßigten Breiten etabliert. Ziele der Untersuchungen: Zum einen sollte untersucht werden, ob auch die Stechmückenarten Aedes vexans (Ae. vexans) und Culex pipiens molestus (Cx. pipiens), die in gemäßigten Klimazonen vorkommen, als CHIKV-Vektoren fungieren können. Zum anderen sollte der Einfluss von Deletionen der Sequenzwiederholungen (DR) in der 3‘ nichttranslatierten Region (3‘ UTR) auf die virale Replikation in Zellkultur und in Stechmücken untersucht werden. Tiere, Material und Methoden: Zunächst wurde eine CHIKV 3́ UTR-Deletionsmutante mit einer Deletion von DR1a und DR2a in der 3́ UTR (CHIKV-ΔDR) hergestellt und diese bezüglich der Wachstumskinetik mit Chikungunya-Wildtyp-Virus (CHIKV-WT) in C6/36- und Aag2-Stechmückenzellen sowie in BHK-21/J- Wirbeltier-Zellen verglichen. Um die Vektorkompetenz von beiden Viren in Stechmücken zu untersuchen, wurden Ae. aegypti, Ae. albopictus, Ae. vexans und Cx. pipiens in einem Insektarium gezüchtet. Bei den Infektionsexperimenten im S3-Labor wurden insgesamt 27 Ae. aegypti, 20 Ae. albopictus, 78 Ae. vexans und 62 Cx. pipiens Stechmücken verwendet. In diesen Experimenten wurden diese mit CHIKV-ΔDR und CHIKV-WT sowohl oral mit je 1x 10^6 PFU/ml über eine Fütterungsmembran als auch intrathorakal mit je 200 PFU (zur Umgehung der Mitteldarmbarriere) infiziert und an verschiedenen Tagen nach der Infektion und in verschiedenen Körperteilen sowie im Speichel auf virale RNA mittels Real-Time Reverser Transkription-Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) untersucht. Unterschiede in der Virusreplikation wurden entweder mit Mann-Whitney- oder Fisher’s Exakt-Test überprüft. Das Signifikanzniveau lag bei p < 0,05. Ergebnisse: Beide Viren, das CHIKV-WT und das CHIKV-ΔDR, zeigten ein vergleichbares Wachstum in Wirbeltier-Zellen (BHK-21/J) und erreichten einen Titer von 5x 10^8 PFU/ml. Das Wachstum beider Viren war auch in von Ae. albopictus abgeleiteten C6/36- Stechmückenzellen effizient, wobei CHIKV-WT ein um knapp eine Log-Stufe höheres Wachstum zeigte als CHIKV-ΔDR. In unseren Experimenten zeigte CHIKV-WT ein weniger effizientes Wachstum in von Ae. aegypti abgeleiteten Aag2-Stechmückenzellen, als in Ae. albopictus abgeleiteten C6/36-Stechmückenzellen, obwohl Ae. aegypti als Hauptvektor für CHIKV-WT gilt. In einer intrathorakalen und oralen Infektion konnten sowohl die bekannten CHIKV-Vektoren Ae. aegypti und Ae. albopictus als auch die einheimische Stechmückenarten Ae. vexans und Cx. pipiens erfolgreich infiziert werden. Bei einer intrathorakalen Infektion mit Umgehung der Mitteldarmbarriere wurde bei Ae. vexans oder Cx. pipiens eine effizientere Virusreplikation beobachtet als bei einer oralen Infektion. CHIKV-WT zeigte eine signifikant höhere Replikation in Ae. vexans im Vergleich zu CHIKV-ΔDR am Tag 7 und am Tag 14 nach der Infektion. Bei Cx. pipiens wurden signifikante Unterschiede für CHIKV-WT im Vergleich zu CHIKV-ΔDR nur am Tag 7 beobachtet. Schlussfolgerungen: Das beeinträchtigte Wachstum in C6/36- und Aag2-Zellen von CHIKV-ΔDR deutet darauf hin, dass die deletierten Sequenzwiederholungen spezifisch mit noch unbekannten Faktoren in Stechmückenzellen interagieren. Dennoch konnte CHIKV-ΔDR die bekannten CHIKV-Vektoren Ae. aegypti und Ae. albopictus problemlos nach intrathorakaler und oraler Infektion infizieren. Die Mitteldarm-Entweichungsbarriere scheint also nicht der einzige Faktor zu sein, der die Vektorkompetenz von Stechmücken beeinflusst. Auch die Replikationskinetik des Virus in den Sekundärgeweben scheint bei den verschiedenen Stechmückenarten unterschiedlich zu sein. Zwar umfassten unsere Studien zur oralen Infektion mit CHIKV nur einige einheimische Ae. vexans und Cx. pipiens Stechmücken, jedoch deuten die Ergebnisse darauf hin, dass diese Stechmücken potenziell als Vektoren für CHIKV dienen können.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 2 2.1 Alphaviren 2 2.1.1 Klassifikation 2 2.1.2 Virusmorphologie und Genomaufbau 2 2.1.3 Virusreplikation 4 2.2 Chikungunya-Virus 5 2.2.1 Übertragungszyklus 5 2.2.2 Epidemiologie 7 2.2.3 Genotypen und die 3′ UTR Region 9 2.2.4 Chikungunya-Fieber 12 2.3 Stechmücken 13 2.3.1 Taxonomie und Stechmückenarten in Deutschland 13 2.3.2 Allgemeine Morphologie, Biologie und Ökologie 14 2.3.2.1 Eiablage und Schlüpfen der Larven 15 2.3.2.2 Aquatische Entwicklungsstadien 16 2.3.2.3 Adulte 17 2.3.2.4 Flugverhalten und Überwinterungsstrategien 19 2.3.3 Arboviren in Deutschland 20 3 Publikation 26 3.1 Stellungnahme zum Eigenanteil an den Arbeiten zur Publikation 26 3.2 Publikation 27 4 Diskussion 42 5 Zusammenfassung 49 6 Summary 51 7 Literaturverzeichnis 53 8 Danksagung 66