Las distrofias musculares de cinturas (LGMD) son un grupo heterogéneo de enfermedades neuromusculares hereditarias, definidas por una debilidad muscular progresiva y atrofia. Se caracterizan por un patrón distrófico que afecta a la musculatura de las cinturas. Las mutaciones en el gen DYSF son las responsables de un amplio espectro de fenotipos caracterizados todos ellos por ausencia de disferlina en el músculo esquelético y un modo de herencia autosómico recesivo. Los tres fenotipos principales por su frecuencia de aparición son: Miopatía de Miyoshi (MM), Distrofia muscular de cinturas de tipo 2B (LGMD2B) y distrofia muscular tibial anterior (DMAT). Los objetivos planteados fueron: • Estudiar el gen DYSF en pacientes de población española, ya que este gen no se había estudiado nunca antes en esta población. • Diseñar una estrategia técnica rápida y eficaz para el estudio de DYSF o Optimizar el proceso diagnóstico mediante el estudio de RNA vs DNA o Analizar grandes reordenamientos del gen (duplicaciones o deleciones). • Caracterizar el espectro mutacional de DYSF en población española • Establecer una relación genotipo-fenotipo • Analizar posibles genes modificadores Los resultados derivados de este trabajo han sido publicados en las siguientes revistas científicas: -Abnormal expresión of dysferlin in skeletal muscle and monocytes supports primary dysferlinopathy in patients with one mutated allele. M.Meznaric, L. González-Quereda, E. Gallardo, N. de Luna, P. Gallano, M. Fanin, C. Angelini, B. Peterlin and J. Zidar. European Journal of Neurology 2010. Article first published online: 18 OCT 2010 DOI: 10.1111/j.1468-1331.2010.03240.x -A new phenotype of dysferlinopathy with congenital onset. Paradas C, González-Quereda L, de Luna N, Gallardo E, García-Consuegra I, Gómez H, Cabello A, Illa I, Gallano P. *Authors Paradas C and González-Quereda L contributed equally to this work. Neuromuscul Disord. 2009 Jan;19(1):21-5. Epub 2008 Dec 11. doi:10.1016/j.nmd.2008.09.015 Las conclusiones del trabajo son: • Es posible realizar el estudio mutacional en el RNA total extraído de monocitos circulantes en sangre periférica, evitándose por consiguiente el método invasivo de biopsia muscular • Existe una gran heterogeneidad mutacional en el gen DYSF en pacientes de población española con distrofia muscular de cinturas tipo 2B y miopatía distal tipo Miyoshi. • No es posible establecer una relación genotipo-fenotipo en pacientes con disferlinopatía. • La mutación DYSF c.3191_3196dup es la más prevalente en nuestra población. • La heterogeneidad mutacional en los pacientes de nuestra población, en lo referente a la localización dentro del gen, es elevada y no se han identificado “hotspots” del mismo modo que en otras poblaciones caucásicas. • El estudio de DYSF en mRNA vs DNA genómico permite: o Establecer un diagnóstico molecular de forma más rápida y eficaz. o Detectar un mayor número de mutaciones. o Detectar todas las mutaciones que alteran el proceso de splicing. • No se han identificado mutaciones en el gen MG53, que codifica para mitsugumina-53, en nuestra serie de pacientes con disferlinopatía por lo que hasta la actualidad no puede ser considerado como gen modificador. • Se describe un nuevo fenotipo de disferlinopatía con inicio congénito, ampliándose de este modo el espectro clínico de las disferlinopatías y, añadiendo nuevos datos a la historia natural de la enfermedad. / Limb Girdle Muscular Dystrophies (LGMD) are a heterogeneous group of inherited neuromuscular diseases, defined by progressive muscle weakness and atrophy. They are characterized by a progressive dystrophic pattern involving limb-girdle muscles. Mutations in DYSF gene are responsible for a wide range of phenotypes characterized by the absence of dysferlin in skeletal muscle and an autosomal recessive mode of inheritance. So far, three main phenotypes have been reported: Miyoshi Myopathy (MM), Limb Girdle Muscular Dystrophy type 2B (LGMD 2B), and Distal Myopathy with Anterior Tibial onset (DMAT). The objectives of this work were: • To study the DYSF gene in patients from Spanish population, not previously analysed in this population. o To design a technical strategy to analyse the DYSF gene o To optimize the diagnostic process using RNA vs DNA • To analyse gene rearrangements (deletions or duplications). • To characterize the mutational spectrum in our population • To establish a genotype-phenotype relationship • To analyse possible modifiers genes Results from this work had been published: -Abnormal expresión of dysferlin in skeletal muscle and monocytes supports primary dysferlinopathy in patients with one mutated allele. M.Meznaric, L. González-Quereda, E. Gallardo, N. de Luna, P. Gallano, M. Fanin, C. Angelini, B. Peterlin and J. Zidar. European Journal of Neurology 2010. Article first published online: 18 OCT 2010 DOI: 10.1111/j.1468-1331.2010.03240.x -A new phenotype of dysferlinopathy with congenital onset. Paradas C, González-Quereda L, de Luna N, Gallardo E, García-Consuegra I, Gómez H, Cabello A, Illa I, Gallano P. *Authors Paradas C and González-Quereda L contributed equally to this work. Neuromuscul Disord. 2009 Jan;19(1):21-5. Epub 2008 Dec 11. doi:10.1016/j.nmd.2008.09.015 This thesis drew the conclusions: • It is possible to perform the mutational analysis in RNA isolated from total peripheral blood monocytes, avoiding the invasive method of muscle biopsy. • DYSF gene shows high mutational heterogeneity in patients from Spanish population suffering from Limb Girdle Muscular Dystrophy type 2B and Miyoshi Myopathy. • It is not possible to establish a genotype-phenotype correlation in dysferlinopathy patients. • DYSF c.3191_3196dup is the most prevalent mutation in Spanish population. • Patients from our population show high mutational heterogeneity and it is not possible to identify hotspots as mutations are expanded over the whole sequence of the gene. • The DYSF gene study in mRNA vs genomic DNA allows: o To establish a molecular diagnostic in a quick and efficient way. o To detect a high number of mutations o To detect all mutations changing the splicing process. • Mutations in MG53 have not been identified in our serie of patients, so that, MG53 can not be considered as a modifier gene to date. • It has been described a new phenotype of dysferlinopathy with congenital onset. This new phenotype widens the clinical spectrum of dysferlinopathies and add new data to the natural story of the disease.

A distrofia muscular de cintura 2B (LGMD2B) é uma doença neuromuscular causada pela redução ou ausência da proteína sarcolemal disferlina. A disferlina está envolvida no reparo de membrana por atuar no tráfego e fusão de vesículas após estresse mecânico e, quando deficiente, as alterações nesta via levam à degeneração progressiva e irreversível das fibras musculares. A disferlina também tem sido implicada na inflamação e na miogênese durante a degeneração e regeneração muscular. Recentemente, identificou-se um tricomplexo formado pela disferlina com duas proteínas citoplasmáticas, FAM65B e HDAC6, no início da diferenciação de mioblastos. Investigar a regulação destas interações é importante para avançar na compreensão das funções da disferlina e seu papel na função muscular. Neste estudo, a miogênese e o reparo muscular foram investigados in vivo e in vitro em modelos com deficiência de disferlina. Para estudar o processo regenerativo in vivo, utilizamos um modelo de eletroporação para induzir degeneração/regeneração no músculo distrófico levemente afetado do camundongo disferlina-deficiente SJL/J. A avaliação histopatológica e a expressão relativa dos genes Pax7, Myf5, MyoD e miogenina foram acompanhadas durante a recuperação muscular em diferentes tempos após a lesão. Além disso, investigamos os efeitos da deficiência de disferlina na expressão dos genes Fam65b e Hdac6. Observamos um curso de tempo alterado do processo de degeneração e regeneração, com notável capacidade regenerativa nos camundongos disferlina-deficientes, caracterizada por uma resposta mais rápida e eficaz nos primeiros dias após a lesão, em comparação com os camundongos normais. Além disso, Fam65b e Hdac6 foram ativados nos estágios iniciais da regeneração muscular, também com expressão mais elevada de ambos os genes no camundongo SJL/J. Esses resultados podem estar relacionados à uma possível condição pré-ativada do processo regenerativo no músculo de camundongos distróficos jovens. Para os experimentos in vitro, utilizamos células musculares humanas de pacientes com LGMD2B, com deficiência total de disferlina. A diferenciação muscular induziu a formação de miotubos mais finos e com menor frequência de núcleos por miotubo, sugerindo uma progressão retardada da formação de miotubos em células com LGMD2B. A expressão de mRNA de MYOD e FAM65B não foi aparentemente afetada pela deficiência de disferlina durante a diferenciação, enquanto HDAC6 apresentou um pico transitório após 24 horas, apenas nas células normais. Além disso, o pico da miogenina ocorreu mais cedo nas células normais. Portanto, sugerimos que a disferlina estaria menos envolvida nos eventos iniciais de formação de pequenos miotubos, mas poderia desempenhar um papel importante nos estágios posteriores de diferenciação, que envolvem crescimento e alongamento de miotubos. Estes resultados fornecem dados interessantes para investigações adicionais de como a deficiência de disferlina afeta os reguladores miogênicos durante a diferenciação. Em conjunto, nossos dados sugerem que a deficiência de disferlina provoca alterações temporais na progressão dos eventos de regeneração muscular e de miogênese. A identificação de uma possível regulação dos componentes do tricomplexo pela disferlina pode indicar novas direções para investigar esta via como um potencial alvo para terapias / Limb girdle muscular dystrophy 2B (LGMD2B) is a neuromuscular disease caused by reduction or absence of the sarcolemmal protein dysferlin. Dysferlin is involved in membrane repair by acting on vesicular traffic and fusion after mechanical stress and, when deficient, changes in this pathway lead to progressive and irreversible degeneration of muscle fibers. Dysferlin has also been implicated in inflammation and myogenesis during muscle degeneration and regeneration. Recently, a tricomplex formed by dysferlin with two cytoplasmic proteins, FAM65B and HDAC6, was identified at the earlier stages of myoblast differentiation. Investigating the regulation of these interactions is important to advance in the understanding of the functions of dysferlin and its role in muscle function. In this study, myogenesis and muscle repair were investigated in vivo and in vitro in models with dysferlin deficiency. To study this effect in the regenerative process of muscle in vivo, we used a model of electroporation inducing muscle degeneration/regeneration in the mildly affected dystrophic muscle of dysferlin-deficient SJL/J mouse. The histopathological evaluation and the relative expression of the genes Pax7, Myf5, MyoD and myogenin were accompanied during muscle recovery at different time points after injury. In addition, we investigated the effects of dysferlin deficiency in the expression of genes Fam65b and Hdac6. We observed an altered time course of the degeneration and regeneration process, with remarkable regenerative capacity in dysferlin-deficient mice, characterized by a faster and effective response in the first days after injury, as compared to normal mice. Moreover, Fam65b and Hdac6 were activated at the early stages of muscle regeneration, also with higher expression of both genes in the SJL/J mouse. These results may have been due to a possible pre-activated condition of the regenerative process in the muscle of young dystrophic mice. For the in vitro experiments, we used human muscle cells from patients with LGMD2B, with total deficiency of dysferlin. The muscular differentiation induced the formation of thinner myotubes and reduced frequency of myonuclei per myotube, suggesting a delayed progression of myotube formation in LGMD2B cells. mRNA expression of MYOD and FAM65B was not apparently affected by dysferlin deficiency during differentiation, while HDAC6 exhibited a transient peak, only in healthy cells, after 24 hours. In addition, the myogenin peak occurred earlier in healthy cells. Thus, we suggested that dysferlin would be less involved in the first events of formation of early small myotubes, but could play an important role in the later stages of differentiation, which involves myotube growth and elongation. These results provide interesting data for further investigation of how dysferlin deficiency affects myogenic regulators during differentiation. Taken together, our data suggest that dysferlin deficiency causes temporal changes in the progression of the muscle regeneration and myogenesis events. The identification of possible regulation of tricomplex components by dysferlin may indicate new directions for investigating this pathway as a potential target for therapies