Les dysferlinopathies sont des maladies musculaires dues à une déficience en protéine dysferline, codée par le gène DYSF. Dans ce travail de thèse, trois approches thérapeutiques ont été évaluées pour ces pathologies, sur des modèles cellulaires et murins. Un variant transcriptionnel court de la dysferline a été vectorisé dans un AAV8r et injecté dans le modèle murin Bla/J, déficient en dysferline. L’analyse des muscles des animaux traités montre une augmentation de la résistance des fibres musculaires au stress mécanique, mais n’apporte pas de correction histologique. Cette étude souligne également la toxicité de cette miniprotéine. L’anoctamine 5, impliquée dans des pathologies et des activités similaires à la dysferline, a été testée en tant que protéine compensatrice. L’anoctamine 5 surexprimée dans le modèle Bla/J ne permet pas la restauration d’un phénotype normal. La compensation de DYSF par ANO5 n’est donc pas une voie thérapeutique à exploiter pour les dysferlinopathies. Enfin, une thérapie génique par chirurgie de l’ARN dysferline a été évaluée en utilisant le trans-épissage médié par le splicéosome (SMaRT). La preuve de principe de la reprogrammation d’un minigène dysferline a été faite (ARN et protéine trans-épissée obtenus in vitro). L’efficacité du SMaRT dans un contexte endogène s’est en revanche révélée faible, et n’a pas permis la restauration d’une protéine dysferline fonctionnelle dans des myoblastes humains. De plus, l’observation de l’expression de protéines directement à partir du RTM (RNA-trans-splicing molecule) a fait apparaître des limites à l’utilisation du SMaRT pour la thérapie génique, et en particulier pour les dysferlinopathies. / Dysferlinopathies are muscular diseases due to mutations in DYSF gene, inducing dysferlin protein deficiency. In this thesis, three therapeutic approaches have been investigated for these pathologies, on cell or mice models. A short transcriptional dysferlin variant has been injected into Bla/J dysferlin deficient mouse model, using AAV8r vector. Muscle fibers of treated animals displayed an increased resistance to mechanical stress without therapeutic benefit. These experiments also pointed out the toxicity of this strategy. A protein compensation approach has been tested using anoctamin 5, known to be involved in pathologies and activities similar to dysferlin’s ones. AAVr mediated Anoctamin 5 overexpression in Bla/J model does not rescue their muscle phenotype. Overexpression of ANO5 does not seem to be a valuable therapeutic strategy for dysferlin deficiency. Dysferlin RNA surgery was evaluated as a possible genetic therapy using Spliceosome-Mediated RNA Trans-splicing (SMaRT). On a Minigene target, SMaRT is able to induce RNA reprogramming by trans-splicing, and produce the corresponding protein. But efficiency is by far decreased in endogenous context and not good enough to restore functional dysferlin in human myoblasts. Moreover, we described proteins resulting from RNA-trans-splicing molecule (RTM) self-expression, limiting the value of SMaRT as therapeutic strategy, especially for dysferlinopathies.

Les dysferlinopathies constituent un groupe de dystrophies musculaires autosomiques récessives comprenantprincipalement la myopathie des ceintures (LGMD) de type 2B et la myopathie distale de Miyoshi. Elles sont causéespar des mutations dans le gène DYSF qui se situe dans la région chromosomique 2p13.1-13.3 (NM_003494). Ce gènecomporte 55 exons répartis sur plus de 230 kb. Il est exprimé principalement dans le muscle squelettique etcardiaque, mais également dans d'autres tissus (placenta...) et types cellulaires tels que lesmonocytes/macrophages. La dysferline (2080 acides aminés, 237 kDa, O75923) fait partie de la famille des Ferlineset comporte 7 domaines C2, senseur de calcium et un domaine transmembranaire C-terminal.La dysferline participe à la formation des tubules-T et à la fusion des myoblastes en myotubes avec lamyoferline (un autre membre de la famille). Elle est localisée au sarcolemme de la fibre musculaire squelettiqueadulte, où elle joue un rôle dans sa réparation. En effet, chez l’homme comme dans les modèles murins, en absencede dysferline, des vésicules, dont la nature n’est pas clairement établie, s’accumulent sous le sarcolemme lésé sansfusionner avec celui-ci. Elle interagirait avec plusieurs protéines membranaires ou cytosoliques, dont certaines(comme la cavéoline 3) sont aussi impliquées dans d’autres formes de LGMD.Au cours de ma thèse, mon travail a été axé d’une part sur l’amélioration des techniques de diagnostic : étudede délétion/duplication dans le gène DYSF par CGH et le développement d’un test permettant d’évaluerl’absence/présence de la dysferline à partir de sang total par des techniques de FACS et d’immunofluorescence.D’autre part j’ai également étudié la pertinence d’approches thérapeutiques. Ainsi, nous avons mis en évidence unelarge délétion homozygote des ¾ du gène DYSF chez une patiente présentant un phénotype modéré dedysferlinopathies. Cette délétion permet cependant la production d’une dysferline tronquée. L’identification decette miniprotéine, la première identifiée à ce jour a permis de mettre en évidence l’aspect en partie modulaire dela dysferline. Une autre donnée sur le caractère modulaire de la dysferline est apparue dans la littérature, cette foismontrant le caractère dispensable de l’exon 32. Sur la base de cette observation clinique, nous avons développéune approche thérapeutique par saut d’exon pour les dysferlinopathies, en démontrant dans un premier temps safaisabilité technique sur l’exon 32.L’ensemble de ces travaux permettront probablement l’amélioration du diagnostic différentiel desdysferlinopathies, tout en fournissant de nouvelles pistes pour comprendre les rôles de la dysferline et offrir ainsides pistes thérapeutiques pour le traitement de patients souffrant de ces pathologies. / Dysferlinopathies are a group of autosomal recessive muscular disorders including mainly limb girdlemuscular dystrophy 2B (LGMD2B) and Miyoshi Myopathy (MM), caused by mutation in DYSF gene (2p13.1-13.3). It is composed by 55 exons spreading on 234 kb of genomic DNA and it is expressed mainly in skeletal and heart muscle and monocytes/macrophages.Dysferlin (2080 amino-acids, molecular weight 237 kDa) belongs to the Ferlin family as Myoferline, which is also expressed in muscle. Dysferlin is involved with Myoferlin in myoblasts fusion and T-tubule formation. In adult skeletal muscle, Dysferlin is localized at the sarcolemma where it plays its main function: the sarcolemma repair after muscular wounding. It has been suggested that Dysferlin allows them to fuse with the plasma membrane in order to provide the required plasma membrane to reseal the wound. During these years, my work was essentially focused on the improvement of diagnosis technique (evaluation of CGH array to detect deletion/duplication event in DYSF gene and development of test able to detect absence/presence of Dysferlin in whole blood), the functional exploration of diagnosis technique (evaluation of CGH array to detect deletion/duplication event in DYSF gene and development of test able to detect absence/presence of Dysferlin in whole blood), and the development of promising therapeutics approaches: AAV gene transfer of a minidysferlin which was identified in patient presenting a mild phenotype and for the first time the demonstration of the feasibility of an exon-skipping therapeutics strategy for dysferlinopathies.

Le diagnostic des maladies génétiques est difficile à émettre. En effet, il est souvent difficile de déterminer comment une mutation va entrainer la pathologie. Le but de cette thèse est de développer des outils permettant de répondre à cette interrogation. Les mutations peuvent entrainer des anomalies à différents niveaux, différentes outils ont ainsi été développées en parallèle afin de pouvoir détecter différents types d'anomalies. Ces outils ont été développés en utilisant comme modèle une maladie génétique appartenant à la famille des myopathies, entrainant une dégénérescence des muscles des patients. Les travaux de cette thèse ont permis de confirmer le caractère délétère de certaines mutations en démontrant des anomalies dans un mécanisme appelé « épissage » qui permet la transmission de l'information contenue dans le génome. Les mutations en empêchant cette transmission vont ainsi être responsables de la maladie. / Diagnosis of genetic diseases is a difficult task. Indeed, it is often difficult to determine if mutations detected in patients will be responsible of the disease. The aim of this thesis is to develop tools allowing answering on this question. Mutations can have deleterious effects to several levels, thus different tools have been develop in parallel in order to detect different kind of abnormalities. These tools have been developed using as model a genetic disease belonging to the family of myopathy, leading to a degeneration of patients muscles. These thesis works have confirmed the deleterious effect on some mutations in a mechanism named "splicing" which allow transmission of the genome's information. Mutations preventing the transmission will thus be responsible of the disease.

L’épissage en cis des précurseurs d’ARN messager (pre-ARNm) est une stratégie intéressante afin de réparer des gènes dont la régulation transcriptionnelle est déterminante pour la fonction de la protéine. Les mutations touchant le gène dysferline (DYSF) sont liées au développement de dystrophies musculaires: la dystrophie musculaire des ceintures de type 2B et la myopathie distale de Miyoshi. Une stratégie à modifier l’épissage en cis des pre-ARNm du gène DYSF est le procédé SMaRT (pour spliceosome-mediated mRNA trans-splicing), une technique de réparation de l'ARN messager au moyen d'un complexe de trans-épissage appelé PTM (pour pre-mRNA trans-splicing molecule). Le procédé SMaRT utilisant le complexe PTM permet le remplacement d’importantes portions de pre-ARNm tout en préservant l’intégrité totale du transcrit. Dans un soucis d’obtenir un trans-epissage efficace, seuls les introns codant pour les pre-ARNm de DYSF présentant de forts signaux d’épissage répartis de façon disparate ainsi que des tailles très différentes furent ciblées par les PTMs dans des myoblasts humains ne possédant pas de dysferlin. Le trans-épissage de deux introns ciblés du gène DYSF engendra une formation correcte de la protéine dysferlin dans des mutants DYSF-/- de souris. Les niveaux de protéine fonctionnelle furent toutefois modérés, mais similaires aux taux de récupération obtenus par des stratégies précédentes de trans-épissage ciblant d’autres gènes. Néanmoins, parmi les introns ciblés avec succès dans cette étude et dans des essais précédents, des critères concordants ont pu être identifiés afin de faciliter le choix des introns à cibler pour de futures stratégies de trans-épissage. / RNA-based therapy is an approach to cure genetic disorders with no intervention into endogenous spatiotemporal gene regulation. I established two approaches for the dysferlin gene, (i) spliceosome-mediated pre-mRNA trans-splicing (SmaRT) and (ii) exon-skipping, in order to rescue dysferlin mutations leading to Limb Girdle Muscular Dystrophy 2B and Miyoshi Myopathy. SmaRT permits the correction of numerous mutations of a gene by a single pre-mRNA trans-splicing molecule (PTM) by exchanging multiple exons of a gene for a healthy mRNA sequence. The PTM binds to intronic sequence and competes with the endogenous pre-mRNA for the binding of the spliceosome. I designed PTMs to exchange the 3’ part of the dysferlin messenger and determined two functioning PTMs bytransduction of human myoblasts and intramuscular injection in wild-type and DYSF-/- mice and could show dysferlin protein rescue in DYSF-/- mice.By exon-skipping exons carrying mutations can be excised from pre-mRNA in masking exon or intron internal sequences defining the exon in the splicing process. I employed antisense oligonucleotides (AONs) of tricyclo-DNA in order to excise dysferlin exon 32. It was shown to be particularly feasible for systemic application, making it suitable for diseases affecting different compartments of skeletal muscle and other organs. The dysferlin exon 32 has been shown to be dispensable for known functions of the dysferlin protein. I designed tc-DNA AONs leading to efficient skipping in patient myoblasts and in wild-type mice following intramuscular injection. I am collaborating to investigate effects of exon 32 skipping in an Exon-32-STOP mouse model.

Les dystrophies musculaires des ceintures (LGMD) sont un groupe hétérogène de dystrophies musculaires à progression lente. Des mutations du gène de la dysferline causent la LGMD de type 2B, mutations dans le gène de la cavéoline-3 (cav-3) causent LGMD de type 1C et des mutations dans le gène anoctamine-5 (ano-5) sont liées aux LGMD. Dans le but d'analyser les mécanismes moléculaires des LGMD et d'étudier les potentielles interactions de la dysferline, de la cav-3 et de l'ano5, des expériences sur des cellules musculaires primaires portant des mutations associées aux gènes DYSF, CAV3 et ANO5 ont été analysées. Les études d'immunomarquage ont montré que la protéine dysferline et la cav-3 sont partiellement colocalisées dans des structures vésiculaires de la membrane plasmique des myotubes primaires humains. La purification biochimique des "detergent-resistant membranes" issus des myotubes différenciés a montré que la dysferline est associée aux " lipid raft " liées aux cytosquelettes d'actine. L'analyse de la microscopie électronique sur les myotubes issus des muscles des patients atteints de LGMD a montré des altérations dans l'abondance des cavéoles à la membrane plasmique qui est en corrélation avec les mutations causant la maladie. L'analyse de l'ultrastructure cellulaire a montré que la dysferline est localisée à la membrane plasmique mais également dans des vésicules cytosoliques. L'immunopurification de ces vésicules contenant de la dysferline a révélé la présence d'environ 500 protéines détectées par LC-MS, ce qui pourrait représenter des protéines structurales vésiculaires, ainsi que des nouveaux partenaires potentiels d'interaction de la dysferline. / Limb-girdle muscular dystrophies (LGMD) are a heterogeneous group of slowly progressive muscular dystrophies with common features such as hyperCKemia and skeletal muscle weakness. Mutations in the dysferlin gene cause LGMD 2B, in the caveolin-3 (cav-3) gene LGMD 1C and in the anoctamin-5 (ano-5) gene LGMD 2L, respectively. In order to reveal the molecular mechanisms underlying LGMD and to investigate the putative interactions of dysferlin, cav-3, and ano5, primary skeletal muscle cell lines with disease-related mutations in DYSF, CAV3, and ANO5 have been analyzed. Immunolabeling studies revealed that dysferlin and cav-3 are partially colocalized in vesicular structures at the plasma membrane. Biochemical purification of detergent-resistant membranes from differentiated myotubes showed that dysferlin is associated with lipid rafts linked to the actin-cytoskeleton. Transmission electron microscopy analysis of myotubes revealed alterations of caveolae abundance at the plasma membrane correlating with disease-causing mutations. Ultrastructural studies revealed localization of dysferlin at the plasma membrane, but also in cytosolic vesicles. These vesicles contained a subset of approximately 500 proteins detected by LC-MS, which might represent vesicular structural proteins, vesicle cargo, and putative new dysferlin interaction partners. Results from this study lead to the conclusion that caveolae play a crucial role in the context of LGMD. Dysferlin and cav-3 seem to be closely linked on structural as well as on functional level. Our results confirm that dysferlin is localized in cytosolic vesicles, which are involved in multiple cellular processes.

Les dysferlinopathies sont des dystrophies musculaires qui se manifestent par la dystrophie musculaire des ceintures de type 2B (LGMD2B) ou la myopathie de Miyoshi (MM). Elles sont causées par des mutations dans le gène dysferline. La dysferline est une protéine membranaire exprimée dans le muscle squelettique, responsable de la réparation des microlésions du sarcolemme. L’absence d’une telle réparation de la membrane entraîne une atrophie musculaire progressive. Ce travail de thèse explore le potentiel thérapeutique d'une stratégie de modulation d'épissage pour le traitement de la LGMD2B causée par la mutation faux-sens c4022T>C dans l'exon 38 du gène dysferline. Des oligonucléotides et des petits ARN U7 délivrés par un vecteur viral de type adéno-associé ont été utilisés comme outils antisens pour induire un saut d'exon in vitro et in vivo. Ce projet de thèse étudie également la capacité de la dysferline tronquée à se localiser de façon appropriée à la membrane et ainsi la réparer. / Dysferlinopathy is a muscular dystrophy that manifests as two major phenotypes: limb-girdle muscular dystrophy type 2B (LGMD2B) or Miyoshi myopathy (MM). It is caused by mutations in the dysferlin gene. Dysferlin is a membrane protein expressed in skeletal muscle. It is responsible for the repair of sarcolemma microlesions produced by muscle contractions. A compromised membrane repair leads to slowly progressing muscle wasting. This thesis explores the therapeutic potential of an antisense mediated splice switching strategy in LGMD2B caused by the missense mutation c4022T>C in the exon 38 of the dysferlin gene. Antisense oligonucleotides and U7 snRNAs delivered by an adeno-associated viral vector were used as antisense tools to trigger exon skipping in vitro and in vivo. The thesis investigates also if the truncated dysferlin maintainsa proper membrane localization and its membrane repair ability.