Zugl.: Göttingen, Univ., Diss., 2009

Universiẗat, Diss., 2002--Düsseldorf.

In der Industrie gibt es für Phosphonate zunehmend mehr Anwendungsgebiete. Genutzt werden sie unter anderem bei der Öl- und Erdgasgewinnung, in der Baustoffindustrie und bei der Trinkwassergewinnung. Im Rahmen dieser Arbeit wurden aufgrund ihrer Relevanz für die Phosphonate 1-Hydroxyethan-(1,1-diphosphonsäure) HEDP, Amino-tris(methylenphosphon- säure) ATMP, Ethylendiamintetra-(metylenphosphonsäure) EDTMP und Diethylentriamin-penta(methylenphosphonsäure) DTPMP untersucht. Das Hauptziel dieser Arbeit war es, die Löslichkeitskonstanten von Calciumphosphonaten zu bestimmen. Die Bildung von Calciumphosphonat-Salzen wurde bei verschiedenen Bedingungen durchgeführt. Mit den gefällten und unterschiedlichen Calciumphosphonaten wurden die Löslichkeitsuntersuchungen durchgeführt. Die Gleichgewichtsproben wurden chemisch analysiert, um die Zusammensetzung dieser Verbindungen als Cax . Ly . nH2O zu ermitteln. Die Daten ermöglichten die Berechnung der Löslichkeitsprodukte der verschiedenen Calciumphosphonat-Salze. Die für die Berechnung notwendigen Dissoziations- und Komplexbildungskonstanten wurden ebenfalls in dieser Arbeit experimentell bestimmt. Hierzu wurde die pH-Potentiometrie angewandt. Die hier ermittelten Werte stimmen gut mit den Literaturwerten überein. Für DTPMP wurden die Stabilitätskonstanten der Ca-Komplexe erstmalig bestimmt. Im Fall von ATMP und EDTMP wurden Konstanten für erweitere Dissoziations- und Komplexbildungmodelle ermittelt.

Neben den cAMP- und cGMP-abhängigen Proteinkinasen (PKA bzw. PKG) sind als zyklonukleotid-regulierte Effektorproteine die Ionenkanäle CNG1-4, der "guanine nucleotide exhange factor“ Epac sowie die zyklonukleotid-spaltende Familie der Phosphodiesterasen (PDEs) von Bedeutung. Industriell synthetisierte cGMP- und cAMP-Analoga besitzen zwar meist eine hohe Affinität für ihr Zielprotein, über ihre Hydrolysestabilität gegenüber PDEs in der Zelle ist jedoch wenig bekannt. In dieser Arbeit wurden die kinetischen Konstanten von elf der am häufigsten genutzten cAMP-und cGMP-Analoga an verschiedenen Vertretern der PDE-Familien mittels Mikrokaloriemetrie bestimmt. Zudem konnte in den Messungen der inhibitorisch Effekt hydrolysestabiler Derivate auf die PDEs qualitativ und quantitativ ermittelt werden kann. Die Ergebnisse zeigen, dass Phosphodiesterasen in der Lage sind, auch chemisch modifizierte Analogsubstanzen der Cyclonukleotide cAMP und cGMP zu hydrolysieren. Hydrolysestabile Derivate dagegen entwickeln häufig inhibitorische Wirkung auf die PDEs und verursachen dadurch Veränderungen der intrazellulären cAMP und cGMP Konzentrationen. So vermag z. B. die Epac-spezifische Substanz Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS in den in vitro Experimenten die PDEs mit ki-Werten im einstelligen mikromolaren Bereich zu inhibieren. In mit Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS stimulierten Thrombozyten steigt als Folge dieser PDE-Hemmung die cGMP Konzentration in der Zelle an und man beobachtet eine als Folge eine PKG-vermittelte Phosphorylierung des Substratproteins VASP – eine unerwünschte Nebenreaktion. Die erhobenen Daten lassen außerdem Rückschlüsse auf den Inhibitionsmechanismus zu. Einige Analoga inhibieren die cGMP-bindenden GAF-Domänen in den PDEs 2A, 5A, 6cone und 10A sowie die PDE 4D3 nach dem linear-mixed-Typ und beeinflussen daher, neben der katalytischen Aktivität, vermutlich auch regulatorische Zentren dieser Enzyme. Zusammenfassend erleichtern die erhobenen Daten Wissenschaftlern die Auswahl des für ihre Fragestellung am besten geeigneten Derivates. / cAMP and cGMP are critical second messengers that regulate multiple targets including different cAMP/cGMP-dependent protein kinases (PKA/PKGs), exchange proteins directly activated by cAMP (Epacs), phosphodiesterases (PDEs) and cyclic nucleotide-gated ion channels (CNGs). Second and third generation cyclic nucleotide analogs are widely used to elucidate specificity of cellular signaling, mediated by these target proteins. However, the selectivity and stability of these analogs need to be fully understood in order to properly interpret results and rigorously assess the mechanisms by which these analogs work in the cell. To better understand the selectivity and cross-reactivity of these analogs I measured the activation or inhibitory activity of 13 commonly-used cyclic nucleotide analogs 8 different PDEs. To measure their stability to hydrolysis I utilized isothermal microcalorimetry, a method that allows to evaluate whether or not an analog can function as a substrate or inhibitor for PDEs. I demonstrate that indeed some of these analogs can be hydrolyzed by multiple PDEs and others are competitive inhibitors. Herein I provide Ki data for all of the non-hydrolyzable analogs and Km and Vmax values for all of the hydrolyzable analogs. Each of these values, as well as their mode of inhibition can be determined in a single experiment. The data strongly implied that several of these analogs might, in addition to their primary effects, also cause elevation of cAMP or cGMP indirectly by inhibiting PDEs in the cell. Such an effect could of course cloud interpretation of the use of these analogs. Similarly, those that are PDE substrates also might have their duration of action substantially reduced. To illustrate this point we show that Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS, a highly specific non-hydrolyzable Epac activator in vitro, can under certain conditions enhance cGMP/PKG and cAMP/PKA signaling pathways in intact platelets. Specifically we found enhanced VASP phosphorylation at both PKA and PKG phosphorylation sites after the addition of Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS. These data indicate that this “selective Epac activator” is able to indirectly activate the cAMP/PKA and cGMP/PKG signalling pathways presumably through inhibition of platelet PDE5 and/or PDE3. The data together allow to provide recommendations for how best to probe the different cyclic nucleotide signalling pathways using cyclic nucleotide analogs. In summary, the data provide evidence that most cAMP and cGMP analogs have multiple targets. Therefore, interpretation of any effects these analogs have in cells should take into consideration their possible cross-target reactivities.

In der Industrie gibt es für Phosphonate zunehmend mehr Anwendungsgebiete. Genutzt werden sie unter anderem bei der Öl- und Erdgasgewinnung, in der Baustoffindustrie und bei der Trinkwassergewinnung. Im Rahmen dieser Arbeit wurden aufgrund ihrer Relevanz für die Phosphonate 1-Hydroxyethan-(1,1-diphosphonsäure) HEDP, Amino-tris(methylenphosphon- säure) ATMP, Ethylendiamintetra-(metylenphosphonsäure) EDTMP und Diethylentriamin-penta(methylenphosphonsäure) DTPMP untersucht. Das Hauptziel dieser Arbeit war es, die Löslichkeitskonstanten von Calciumphosphonaten zu bestimmen. Die Bildung von Calciumphosphonat-Salzen wurde bei verschiedenen Bedingungen durchgeführt. Mit den gefällten und unterschiedlichen Calciumphosphonaten wurden die Löslichkeitsuntersuchungen durchgeführt. Die Gleichgewichtsproben wurden chemisch analysiert, um die Zusammensetzung dieser Verbindungen als Cax . Ly . nH2O zu ermitteln. Die Daten ermöglichten die Berechnung der Löslichkeitsprodukte der verschiedenen Calciumphosphonat-Salze. Die für die Berechnung notwendigen Dissoziations- und Komplexbildungskonstanten wurden ebenfalls in dieser Arbeit experimentell bestimmt. Hierzu wurde die pH-Potentiometrie angewandt. Die hier ermittelten Werte stimmen gut mit den Literaturwerten überein. Für DTPMP wurden die Stabilitätskonstanten der Ca-Komplexe erstmalig bestimmt. Im Fall von ATMP und EDTMP wurden Konstanten für erweitere Dissoziations- und Komplexbildungmodelle ermittelt.

Die Reaktionspfade und Reaktionsdynamik photoinduzierter bimolekularer Ladungstransferreaktionen werden mit Hilfe der ultraschnellen polarisationsabhängigen UV-Pump/IR-Probe-Spektroskopie charakterisiert. Allgemein akzeptierte Modelle zur Beschreibung von bimolekularen Elektrontranserreaktionen nehmen an, dass Ladungstrennung in polaren Lösungsmitteln zu zwei Arten von Ionenpaaren führt, den lockeren (LIPs) und den engen Ionenpaaren (TIPs). TIPs und LIPs können durch die Beobachtung von Schwingungsmoden spektroskopisch unterschieden werden. Allerdings deuten die multiplen Zeitskalen sowohl für die Bildung von TIPs als auch LIPs darauf hin, dass eine Unterscheidung in zwei Arten von Ionenpaaren mit definierter Geometrie eine erhebliche Vereinfachung ist. TIPs und LIPs sind vielmehr als Grenzfälle zu betrachten, zwischen derer eine kontinuierliche Verteilung verschiedener Ionenpaare existiert. Die Natur der Ionenpaare wird durch die Verteilung der neutralen Reaktionspaare vor Initiation der Reaktion bestimmt. Außerdem wird gezeigt, dass TIPs höchst anisotrop sind. Die Wichtigkeit der beidseitigen Orientierung der Reaktanten wird dabei offengelegt. Weiterhin wird erstmalig ein femtosekundenspektroskopischer Beweis für die Existenz von Kohlensäure in wäßriger Lösung präsentiert. Eine Photosäure wurde verwendet, um die ultraschnelle Protonierung von Bikarbonat optisch auszulösen. Kohlensäure wurde bisher als Feststoff in Eismatrizen und in der Gasphase detektiert. Da Kohlensäure als Intermediat zwischen Kohlenstoffdioxid und Bikarbonat postuliert wird, ist ihre Charakterisierung von immenser Bedeutung für das Verständnis grundlegender Säure-Base Chemie von Karbonaten in wäßriger Lösung. Die Analyse der zeitabhängigen Signale unter Verwendung eines theoretischen Modells erlaubt die Bestimmung der bimolekularen Reaktionsdynamik. Dies ermöglicht einen Einblick in die Säure-Base Chemie von Kohlensäure. / The reaction pathways and dynamics of photoinduced bimolecular charge transfer reactions are characterised with ultrafast polarisation-sensitive UV-pump/IR-probe-spectroscopy. Generally accepted models for bimolecular electron transfer reactions suppose that charge separation in polar solvents leads to two geminate ion pairs, namely loose (LIPs) and tight ion pairs (TIPs). By monitoring vibrational marker modes TIPs and LIPs can be distinguished spectroscopically. However, multiple time scales for the formation of TIPs and LIPs indicate that a distinction between two kinds of ion pairs with well-defined geometries is a considerable simplification. TIPs and LIPs should rather be regarded as limiting cases, as there is a continuous distribution of different ion pairs between these two limits. The crucial parameter governing the nature of the ion pairs is the distribution of neutral reaction pairs subsequent to initiation of the reaction. Furthermore, TIPs are found to be highly anisotropic, revealing the importance of mutual orientation of the reactants. This thesis also presents for the first time femtosecond infrared spectroscopic results proving the existence of carbonic acid in aqueous solution. A photoacid is used to optically trigger the ultrafast protonation of bicarbonate. Carbonic acid has only been detected as solid existing in ice matrices and in the gas phase, so far. Because carbonic acid is often postulated as intermediate between carbon dioxide and bicarbonate its characterisation is of substantial support in understanding fundamental acid-base chemistry of carbonates in aqueous solution as well as in biophysical situations. Analysing the time-dependent signals using a theoretical model to describe bimolecular reaction dynamics an on-contact proton transfer reaction rate is derived. This gives an insight into the acid-base chemistry of carbonic acid.