Os cães Golden Retriever com Distrofia Muscular (GRMD) são considerados modelos experimentais para estudo da Distrofia Muscular de Duchenne que acomete humanos, devido serem geneticamente homologas. Utilizamos o ultra-som muscular para avaliar a evolução terapêutica de injeção de células tronco (CT). Para este experimento utilizamos 8, sendo 6 afetados pela doença e 2 não afetados (portadora e macho normal). Avaliamos de forma qualitativa (visual) e quantitativa (digital) os músculos cervicais splenius e semispinalis capitis e o músculo pélvico semitendinosus e realizamos mensurações musculares. Em relação aos músculos cervicais verificamos que não há alteração visual na arquitetura das fibras, porém o cão tratado via arterial apresentou menores escores na análise digital em relação ao cão controle afetado, deixando suspeitas sobre a migração de CT nesse grupo muscular. O splenius apresentou maior ecogenicidade que o músculo semispinalis capitis em 7 animais. Para o músculo semitendinosus, a portadora apresentou ecogenicidade elevada; os afetados apresentaram variáveis graus de alteração da arquitetura muscular e aumento de ecogenicidade; o macho normal apresentou fibras regulares, porém em alguns exames apresentou ecogenicidade elevada podendo ser conseqüência da angulação do transdutor. Quanto às mensurações, há diferença entre os afetados e não afetados para o músculo splenius e devido à hipertrofia que afeta os músculos pélvicos, não foi possível estabelecer diferenças entre os dois grupos. Concluímos que a ultra-sonografia com transdutores de até 7,5 MHz não é viável para acompanhar evolução terapêutica de injeção de CT em músculos com a pseudohipertrofia de GRMD, devido a modificação severa da arquitetura, não sendo possível a detecção de prováveis reparos da musculatura. / The dogs Golden Retriever with Muscular Dystrophy (GRMD) are considered experimental models for study of the Muscular Dystrophy of Duchenne that acomete human, and they are genetically homologue. We use the muscular ultrasound to evaluate the therapeutical evolution of injection of stem cells (SC). For this experiment we use 8, being 6 affected for disease and 2 not affected (carrying and male normal). We evaluate of qualitative form (visual) and quantitative (digital) the cervical muscles splenius and capitis semispinalis and the pelvic muscle semitendinosus and carry through muscular mensure. In relation to the cervical muscles we verify that it does not have visual alteration in the architecture of fibres, however the treat dog saw arterial presented minors props up in the digital analysis in relation the dog has controlled affected, leaving suspicion on the migration of SC in this muscular group. Splenius presented greater echogenicity that the muscle semispinalis capitis in 7 animals. For the muscle semitendinosus, the carrier presented high echogenicity; the affected ones had presented variable degrees of alteration of the muscular architecture and increase of echogenicity; the normal male presented regular fibres, however in some examinations he presented high echogenicity being able to be consequence of the transducer angle. How much to the mensure, it has difference between the affected ones and not affected for the muscle splenius and due to hypertrophy that affects the pelvic muscles, it was not possible to establish differences between the two groups. We conclude that the ultrasonography with transducers of up to 7,5 MHz is not viable to follow therapeutical evolution of injection of SC in muscles with the pseudohypertrophy of GRMD, had the severe modification of the architecture, not being possible the detention of probable repairs of the muscle.

A Distrofia Muscular dos cães Golden Retriever (GRMD), é uma miopatia degenerativa causada pela ausência de uma proteína, a distrofina, geneticamente homóloga à distrofia muscular de Duchenne que acomete humanos, portanto, estes cães são considerados modelos experimentais para estudos que buscam tratamentos para esta doença progressiva e sem cura. Neste trabalho, foram selecionadas sete diferentes medicamentos, entre eles: Sildenafil; Ácido ursodesoxicólico; Acetilcisteína; Losartana Potássica; Micofenolato de Mofetila; Talidomida e Diltiazen, formando um coquetel de medicamentos com a finalidade de tratar os efeitos deletérios causados pela distrofia muscular, proporcionando dessa forma, uma melhor qualidade e sobrevida para os pacientes distróficos. Cada medicamento foi escolhido pela sua ação: sildenafil, aumento do óxido nítrico; ácido ursodesoxicólico, antiinflamatório; Acetilcisteína, antioxidante; Losartana Potássica, antifibrótico e cardioprotetor; Micofenolato de Mofetila, imunossupressor; Talidomida, antiTNF; diltiazen, bloqueador dos canais de cálcio. Para o experimento, foram utilizados 6 cães machos GRMD, sendo 2 controle e 4 experimentais, com o tratamento iniciado aos 80 dias até 10 meses de idade. Os animais foram avaliados em diferentes momentos, com exames séricos, histologia básica, imuno-histoquímica e PCR.Após avaliações, podemos concluir que o coquetel de medicamentos, não causou melhora clínica nos cães do grupo experimental. A dosagem de leucócitos, TGP, CK e a expressão de NFkβ e TGFβ1 foi menor no grupo experimental comparado com o grupo controle, sugerindo uma melhora do processo inflamatório e tardia progressão da distrofia muscular no grupo experimental. / The Golden Retriever Muscular Dystrophy (GRMD), is a degenerative myopathy caused by the absence of a protein, dystrophin, genetically homologous to the Duchenne Muscular Dystrophy that affects humans, so these dogs are considered experimental models for studies that seek treatments for this progressive disease with no cure. In this work, we selected seven different medications, including: Sildenafil, Ursodeoxycholic Acid, Acetylcysteine, Losartan Potassium, Mycophenolate mofetil, Thalidomide and Diltiazem concomitantly forming a cocktail of drugs in order to treat the deleterious effects of muscular dystrophy, thereby providing a better quality and survival for patients dystrophic. Each drug was chosen for its action: sildenafil, increasing nitric oxide; ursodeoxycholic acid, anti-inflammatory; acetylcysteine, an antioxidant; losartan, antifibrotic and cardioprotective; mycophenolate mofetil, an immunosuppressant; thalidomide, antiTNF; Diltiazem, calcium channel blocker. For the experiment, 6 male dogs were utilized GRMD, and two control and four experimental. Treatment started with 80 days to 10 months of age. The animals were evaluated at different times with serum levels, basic histology, immunohistochemistry and PCR. After the evaluations, we conclude that the cocktail of drugs, no clinical improvement in the experimental group. The dosage of leukocytes, ALT, CK and NFkβ and TGFβ1 expression was lower in the experimental group compared with the control group, suggesting an improvement in the inflammatory process and delayed progression of muscular dystrophy in the experimental group.

A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma doença neuromuscular fatal, a mais comum das distrofias musculares, causada pela ausência da proteína distrofina, componente importante do complexo glicoproteínadistrofina, que envolve as células musculares lisas, cardíacas e esqueléticas, estabilizando a membrana dessas células durante contrações e relaxamentos. Por ser uma doença genética ligada ao cromossomo X, acomete indivíduos do sexo masculino, sendo que casos raros de meninas afetadas também são relatados. Indivíduos afetados pela DMD apresentam alterações significantes na composição corpórea, comparados com a população normal. Cães da raça golden retriever que possuem distrofia muscular (GRMD) representam o melhor modelo animal para ensaios terapêuticos na busca do tratamento da DMD, sendo esses animais fundamentais para o estudo do desenvolvimento dessa anomalia, devido ao fato de apresentarem genes e sintomas clínicos homólogos aos dos pacientes humanos. A similaridade entre as duas doenças é surpreendente, ambas são caracterizadas por precoce miopatia degenerativa, com progressiva necrose, fagocitose, deposição de cálcio e fibrose endomisial e perimisial. O foco principal deste trabalho foi esclarecer dúvidas quanto ao comportamento da musculatura lisa dos animais distróficos e portadores da GRMD, para se conhecer os efeitos da doença nesse tipo de tecido. Para avaliação da musculatura lisa uterina foram utilizados quatro úteros de cadelas golden retriever saudáveis, cinco úteros de portadoras do gene e quatro úteros de animais afetados pela GRMD. Analisando as fotomicrografias uterinas dos grupos, podemos notar que não há diferenças morfológicas através dos estudos histológicos convencionais. Porém, quando analisamos as fotomicrografias polarizadas , nota-se nas cadelas saudáveis exclusivamente colágeno do tipo III, de coloração esverdeada. Quanto às portadoras do gene da GRMD, observa-se colágeno predominantemente vermelho, do tipo I, e pouco em verde, tipo III. Fotomicrografias das fêmeas afetadas pela GRMD encontraram colágeno tipo III na parte interna do endométrio, miométrio e perimétrio, e colágeno tipo I em epitélio vascular, porém ambos em menor quantidade. É possível visualizar colágeno entre as fibras musculares através da luz polarizada. Para a avaliação da digestibilidade dos nutrientes em cães GRMD e sua capacidade absortiva, foram utilizados nove cães GRMD, sete fêmeas portadoras e dez animais saudáveis; todos receberam a mesma dieta adicionada de oxido crômico. O período experimental constou de um intervalo de 10 dias, sendo os cinco primeiros dias de adaptação e os cinco restantes de coleta de amostras. Os coeficientes de digestibilidade aparente (CDAs) obtidos pelos grupos estudados foram comparados e analisados: os resultados indicaram que os cães com GRMD avaliados não apresentaram redução do aproveitamento nutricional. Novas pesquisas que avaliem o gasto energético e composição corpórea destes animais são necessárias para melhor compreensão dos mecanismos envolvidos no emagrecimento e perda de peso que apresentam. Para a avaliação do tempo de trânsito gastrintestinal (TTGI) em cães golden retriever saudáveis, portadores e afetados pela distrofia muscular, foram utilizados 18 cães divididos em três grupos animais saudáveis, portadores e afetados pela GRMD, com seis cães cada. Os animais foram acondicionados em canis individuais e receberam a mesma dieta; esferas de polietileno (BIPS) impregnadas com bário foram fornecidas durante a alimentação. Cada animal recebeu 10 marcadores de tamanho grande (5 mm de diâmetro) e 30 marcadores de tamanho pequeno (1.5mm de diâmetro). Os animais foram radiografados nos momentos antes (basal) da 1ª refeição, para confirmação da ausência de conteúdo alimentar e fecal no trato gastrintestinal, e após a alimentação, em intervalos de duas horas, até que os marcadores atingissem o cólon. Resultados apontaram que os cães GRMD avaliados apresentam TTGI mais rápido quando comparados aos demais grupos. Este trabalho comprovou que a mm. lisa de cães distróficos é, de diversas maneiras, afetada pela doença, apresentando tanto alterações morfológicas como morfofuncionais. Muitos estudos nessa área são necessários para melhor compreensão dos mecanismos da enfermidade, bem como maneiras de intervenção para melhoria da qualidade de vida dos indivíduos afetados. Cães GRMD(s) são o melhor modelo animal para estudos pré-clínicos da DMD, assim esses resultados são muito relevantes para aprimoramento e melhora de manejo em biotérios que abrigam esses animais e para extrapolação de dados na própria medicina / Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a fatal neuromuscular disease, it is the most common muscular dystrophy caused by absence of dystrophin protein, an important component of the dystrophin-glycoprotein complex, involving cell membranes of smooth, cardiac and skeletal cells, stabilizing these cells during contractions and relaxations. Because it is a genetic disorder linked to the X chromosome, it affects males, with rare cases of girls affected also reported. Individuals affected by DMD show significant changes in body composition, compared with the normal population. Golden retriever dogs who have muscular dystrophy (GRMD) represent the best animal model for therapeutic trials in the treatment of DMD,; these animals are fundamental to the study of the development of this anomaly, due to the fact that they show clinical symptoms and genes homologous to the human patients. The similarity between the two diseases is staggering; both are characterized by early degenerative myopathy with progressive necrosis, phagocytosis, calcium deposition and endomysial and perimysial fibrosis. The main focus of this thesis was to answer questions about the behavior of smooth muscles of dystrophic animals and carriers of GRMD, to know the effects of the disease in this tissue type. For evaluation of uterine smooth muscle we utilized four uteri of golden retriever healthy bitches, five uteri of gene carriers and four uteri of animals affected by GRMD. Analyzing the uterine photomicrographs of the groups we note that there are no morphological differences in conventional histological studies. However, when we analyze the polarized photomicrographs, we note that in healthy bitches we can see only collagen type III of greenish color. As regards the carriers of the GRMD gene, there is predominantly red collagen , type I, and very little green, type III. Photomicrographs of females affected by GRMD found type III collagen inside the endometrium, myometrium and perimetrium and collagen type I in vascular epithelium, but both in a very little quantity. It is possible to visualize collagen between muscle fibers by polarized light. For the assessment of nutrient digestibility in dogs GRMD and its absorptive capacity, we used nine GRMD, seven carriers females and ten healthy animals and all of them received the same diet with added chromic oxide. The experimental period consisted of an interval of 10 days, with the first five days to adaptation and the last ones to sample collection. The apparent digestibility coefficients obtained by the groups were compared and analyzed; the results showed that dogs with GRMD evaluated showed no reduction in energy utilization. The experimental period consisted of an interval of 10 days, with the first five days to adaptation and the last of them to sample collection. The apparent digestibility coefficients obtained by the groups were compared and analyzed; the results showed that dogs with GRMD evaluated showed no reduction in nutritional absorption. New research to assess energy expenditure and body composition in these animals are needed to a better understanding of the mechanisms involving reduction and weight loss they present. For the assessment of gastrointestinal transit time (TTGI) in golden retriever dogs healthy carriers and affected by GRMD 18 dogs divided into three groups were used - healthy animals, carriers and affected by GRMD, with six dogs each. The animals were placed in individual cages and were fed the same diet; polyethylene spheres (BIPS) impregnated with barium were supplied during feeding. Each animal received 10 markers large size (5mm diameter) and 30 markers small size (1.5mm diameter). Radiographs were taken in the moments before (baseline) the 1 st meal, to confirm the absence of food and fecal content in the gastrointestinal tract and after feeding at two-hour intervals until markers reach the colon. Results indicated that GRMD dogs evaluated showed TTGI faster when compared to the other groups. This thesis has shown that the smooth muscles of dystrophic dogs are, in many ways, affected by the disease, with both morphological and morphofunctional alterations; many studies in this area are needed so we can better understand the mechanisms of disease, as well as ways of intervention to improve the quality of life of affected individuals. GRMD dogs are the best animal model for preclinical studies of DMD, so these results are very relevant to enhancement and improvement of management in bioteries these animals have

A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) tem como característica marcante a substituição do músculo pelo tecido fibroso, sendo este um dos maiores obstáculos para a eficácia de terapias para a distrofia muscular. Intervenções para preveni-la provavelmente poderão ser necessárias como parte de um tratamento eficaz. Correlações significativas entre fibrose e a expressão do TGF-beta, uma citocina fibrogênica multifuncional nas distrofias musculares têm sido relatadas, enfatizando o papel dessa citocina no desenvolvimento da fibrose muscular e sugerindo-a como alvo para terapias antifibróticas. Nesse estudo avaliamos o efeito do Losartan sobre o desenvolvimento da fibrose na musculatura esquelética do modelo canino Golden Retriever Muscular Dystrophy (GRMD). Foi realizado previamente um estudo piloto com um cão distrófico para estipular dosagem e eventuais efeitos colaterais ao medicamento. Foram utilizados cinco cães adultos, sendo dois machos e duas fêmeas e um animal controle. Utilizou-se a dose de 50mg de Losartan, administrada via oral, uma vez ao dia. Os exames clínicos e laboratoriais não evidenciaram reação adversa durante o período do experimento, portanto, o Losartan mostrou-se como uma terapia segura. Os fragmentos da biopsia muscular retirados antes de iniciar com o Losartan (T0) e após (Tf) foram utilizados para histologia e imuno-histoquimica do TGF-beta1 para comparação destes dois tempos. As avaliações de goniometria e perimetria juntamente com os resultados de imuno-histoquimica e quantificação do colágeno ajudaram a inferir sobre o efeito do Losartan na fibrose do músculo distrófico. Não foi encontrada diferença significativa para os valores de goniometria e perimetria. Já a porcentagem da área de deposição de colágeno dos animais nos Tf foi estatisticamente menor do que o T0. A diminuição da presença do TGF-beta1 evidenciada nas imagens de imuno-histoquimica, com a diminuição do depósito de colágeno, após o período de uso do Losartan, sugerem um efeito inibitório do medicamento sobre esta citocina nos músculos dos cães GRMD estudados. / Duchenne Muscular Dystophy (DMD) has the substitution of the muscle by connective tissue as its most relevant characteristic. Once fibrotic proliferation is a major obstacle to the efficacy of therapies for muscular dystrophies, early interventions to prevent it will probably be necessary as part of an effective treatment. A significant correlation between fibrosis and the expression of TGF-beta 1, a multifunctional cytokine, in Duchenne muscular dystrophies has been reported, emphasizing the role of this cytokine in the development of muscle fibrosis, and suggesting it as target for fibrotic therapies. In this study we evaluated the effect of Losartan over the development of the connective tissue on the skeletal musculature of the canine model GRMD. One dystrophic dog was previously used in the pilot study to estipulate the dosage and any side effects caused by Losartan. Five adults dystrophics dogs, two male and two female and one control animal were used in the experiment. A dose of 50mg of Losartan was orally given once a day. The clinical and laboratorial exams did not show any adverse effect through the experimental period, therefore Losartan utilization showed to be a safe therapy. Muscle biopsy fragments have been removed before starting Losartan (T0) and after (Tf) were used for histology and TGF-beta1 imunohistochemistry to compare this two times. The evaluations range of motion and limb circumference measures within imunohistochemistry and colagen quantification results helped to infer about Losartan effect in the dystrophic muscle fibrose. Range of motion and limb circumference values did not show statistical difference. Although the percentage of connective tissue deposition area in the animals in Tf was statistically lower than T0. The decrease of TGF-beta1 signalization showed in imunohistochemistry pictures within the decrease of connective tissue deposition, after Losartan, suggest an inhibitory effect of this medication through this cytokine in the studied GRMD muscle.

As distrofias musculares em crianças e adolescentes acometem 1 em cada 3000 nascimentos. A distrofia de Duchenne é de origem genética e herança recessiva ligada ao cromossomo X, sendo determinada pela ausência da proteína distrofina, apresenta caráter invariavelmente progressivo, natureza mórbida e fim letal. Até o momento não se conhece tratamento efetivo, mesmo com todo o conhecimento que se tem da etiopatogenia. O objetivo deste estudo foi avaliar, no modelo animal, utilizando cães golden retrievers normais portadores e afetados pela distrofia muscular progressiva, a existência de alterações na função glomerular, através da comparação entre os clearances de creatinina, clearance do radionuclídeo EDTA-cromo e da concentração sérica de uréia e creatinina. Os animais foram divididos em 3 grupos de 9 animais sendo grupo 1 controle, grupo 2 portador e grupo 3 afetados. Todos os animais foram submetidos ao mesmos protocolos de exames. Não foram identificadas alterações significativas entre os grupos ou individualmente, sendo que todos os resultados encontraram-se dentro dos limites de normalidade. Sendo assim lesões renais primárias, obscuras aos testes convencionais, descartando-se uma correlação entre a distrofia muscular e lesão na musculatura dos vasos renais que pudessem levar a alterações da função do órgão. / The muscular dystrophys in children and teenagers is taken in 1 each 3000 births. The Duchenne`s dystrophy is from genetics origin and recessive heritage linked to X cromossome, and also determined by the lacre of dystrophyne protein; it shows progressive characteristics, morbid nature and a letal end. So far there is no known effective treatment, even with all the ethiopatogein knowledge. The goal of use of normal golden retrievers dogs, bling then carriers and affected by the progressive muscular dystrophy, the changing existence in the glomerular function through the comparison between the creatinine clearance, EDTA-crome clearance and seric urea and creatinine. Aiming the early diagnostic of the renal pathology. The animals were divided in 3 groups of 9 animals, bling group 1 control animals, group 2 carriers animals and group 3 affected animals. All of then were submitted to the some examinations protocols Their was no relevant identification between the groups or either individually, as all the results were within the expected and natural limits. Likewise, renal primary wounds are not clear in traditional tests made in dystrophyc animals, mainly caused by the muscular wounds in reanal vases harming this way the organ function.

Esta pesquisa teve como objetivo estudar a aplicação de células-tronco do epitélio olfatório de coelhos com o uso da videolaparoscopia na face costal do músculo diafragma do modelo mdx. A cirurgia laparoscópica foi utilizada como recurso visualizador da cavidade abdominal, com finalidade de guiar precisamente a aplicação de células-tronco no tecido lesionado. Foram utilizados 10 animais controles, BALB/C57 (grupo A) para padronizar a intervenção cirúrgica; 03 mdx controles (grupo B) que não receberam terapia celular e 03 mdx que receberam terapia celular (grupo C). Padronizou-se a videolaparoscopia em decúbito dorsal com elevação de vinte graus dos membros torácicos e realizou-se 1 aplicação de células-tronco do epitélio olfatório de coelhos, 3x105. Após 8 dias estes animais foram eutanasiados com overdose anestésica e o músculo diafragma e intercostal foram coletados. Na análise estrutural do músculo diafragma no grupo A, observou as fibras musculares com mesmo diâmetro e núcleos das células periféricos. Os fascículos musculares encontravam-se organizados com presença de fibras reticulares em pequena quantidade. As mesmas características estruturais foram observadas no músculo intercostal. No grupo B, as fibras musculares apresentavamse com diferentes diâmetros, núcleos celulares centralizados, com presença de fibrose perimisial. O músculo intercostal apresentou os mesmos achados, entretanto de forma mais branda. Os fascículos musculares tanto do m. diafragma e intercostal estavam desorganizados e observou-se uma grande quantidade de fibras colágenas e reticulares. No grupo C, observou-se uma leve diminuição do infiltrado inflamatório, porém os núcleos das células ainda se apresentavam centrais. Diferentemente dos dois grupos descritos acima, no grupo C observou-se a presença de células de degranulação e de cordões de mioblastos, demonstrando uma moderada reorganização muscular. Em relação aos fascículos musculares e a quantidade de fibras colágenas e reticulares, estes se mantiveram com as mesmas características do grupo B. Na análise de migração das células-tronco, observamos a marcação positiva da Proteína verde fluorescente (GFP) no músculo diafragma a fresco e na análise imunoistoquímica confirmando os achados estruturais obtidos. Contudo não houve marcação positiva para os cordões de mioblastos. Sugerimos que a aplicação local de células-tronco do epitélio olfatório de coelhos utilizando a videolaparoscopia foi capaz de implantar células-tronco no músculo diafragma. Entretanto, não podemos atribuir os resultados estruturais obtidos nos animais que receberam terapia celular às células-tronco. Acredita-se que alguma sinalização até o momento desconhecida, possa ter estimulado tais alterações histológicas. Portanto, este experimento pode acrescentar novas perspectivas na utilização futura das célulastronco no modelo distrófico canino, por exemplo, o GRMD (Golden Retriever Muscular Dystrophy), além de estimular a pesquisa para maior esclarecimento sobre as células do epitélio olfatório de coelho. / This research aimed to investigate the application of stem cells from the rabbit olfactory epithelium with the use of laparoscopy in the diaphragm costal face of the of the mdx model. Laparoscopic surgery was used as a visualizer resource of the abdominal cavity; with the purpose to precisely direct stem cells application in the injury tissue. Were used 10 control animals, BALB/C57 (group A) to standardize the surgical intervention, 03 mdx controls (group B) that did not receive cell therapy and 03 mdx that received cell therapy (group C). The laparoscopic technique was standardized in the supine position with twenty degrees elevation of the thoracic members, subsequently was held an application of stem cells from the olfactory epithelium of rabbits, 3x105. After 8 days the animals were euthanized by using anesthetic overdose and the diaphragm and intercostal muscles were collected. The structural analysis of the group A diaphragm presented muscles fibers with same diameter and the cells nuclei presented peripheral. The muscle fascicles were organized with the presence of reticular fibers in small quantities. The same structural characteristics were observed in the intercostal muscle. The group B, presented muscle fibers with different diameters, centralized nuclei cell, with perimisial fibrosis. The intercostal muscle showed similar findings, less severely though. The muscle fascicles of both diaphragm and intercostal muscles were disorganized and presented a large amount of collagen and reticular fibers. In group C, were found a slight decrease of the inflammatory infiltrates, but, at this point, the cells nuclei were central. Differently from the two groups described above, the group C presented cell degranulation and myoblasts cords, demonstrating moderate muscle reorganization. The muscle fascicles and the amount of collagen and reticular fibers remained with the same characteristics of the group B. When examining the stem cells migration, it could be observed, in the fresh diaphragm, a positive marking of green fluorescent protein (GFP). The immunoistochemical analysis confirmed the findings obtained. However, the myoblasts cords were not positive stained. It could be suggested that the rabbit olfactory epithelium stem cells application using the laparoscopic technique was able to conduct stem cells to the diaphragm. Meanwhile, this cannot attribute the structural results obtained from animals which received cell therapy. It is believed that some signaling until the moment unknown may have stimulated these histological changes. Therefore, this experiment can add new perspectives for cell therapy in dystrophic canine model, for example, GRMD (Golden Retriever Muscular Dystrophy).

Orientador: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T04:45:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Simoes_GustavoFerreira_M.pdf: 2366815 bytes, checksum: 82cb16f0270cd2eef68425035fd6bf9f (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma doença de caráter recessivo, onde o cromosso X sofre mutações e não codifica o gene responsável pela produção da distrofina. Atinge aproximadamente 1 em cada 3500 nascidos vivos. A distrofina, juntamente com o complexo glicoproteína-distrofina, tem as funções de manter as ligações entre o citoesqueleto e a matriz extracelular, manter a integridade da membrana celular, promover a distribuição de forças laterais entre as fibras musculares e a comunicação entre o meio intra e extra-celular. A DMD é normalmente diagnosticada entre 2 e 5 anos de idade sendo caracterizada por degeneração progressiva e fraqueza da musculatura esquelética,que é substituída por tecido adiposo e fibroso. Os pacientes vão a óbito por volta dos 20 anos devido à falência estrutural e funcional do músculo diafragma e/ou cardíaco. Atualmente, muito se sabe sobre o acometimento muscular na DMD, mas poucos estudos estão voltados para os efeitos no Sistema Nervoso Central (SNC), mais especificamente no microambiente do motoneurônio medular. Sabe-se que durante a evolução da doença, o terminal axonal, na junção neuromuscular, entra em um ciclo de denervação (retração) e reinervação (brotamento). Evidências recentes mostram que neurônios e células gliais expressam moléculas anteriormente tidas como exclusivas do Sistema Imunológico. No entanto, a presença desses elementos no (SNC) parece estar relacionada a outras funções. Um exemplo é o complexo de histocompatibilidade principal classe I (MHC I) que apresenta papel importante no refinamento sináptico durante o desenvolvimento do SNC e também é fundamental na resposta após uma lesão nervosa no adulto. Nesse contexto, estudos recentes sugerem que a expressão de MHC I desempenhe importante papel na manutenção das conexões sinápticas, bem como na comunicação neurônio/glia após lesão. No presente trabalho, foram utilizados camundongos MDX, que exibem lesões histológicas similares à distrofia muscular no homem e seu controle, C57BL/10, com o intuito de investigar os processos de plasticidade ciática e astrogliose reativa no microambiente da medula espinhal. Para tal, os camundongos das duas linhagens foram submetidos a uma transecção unilateral do nervo isquiático. Uma semana após a axotomia, os animais foram submetidos à eutanásia e suas medulas espinhais lombares processadas para imunohistoquímica (anticorpos para MHC I, Sinaptofisina e GFAP - Glial Fibrillary Acidic Protein) e microscopia eletrônica de transmissão (MET). Os lados contralaterais à lesão foram utilizados como controle para cada linhagem. A imunohistoquímica mostrou aumento da expressão de MHC I e GFAP e diminuição da expressão de sinaptofisina no lado ipsilateral à lesão nas duas linhagens. Nos camundongos MDX, os lados contralateral (não lesionado) e ipsilateral (lesionado) apresentaram uma diminuição significativa da expressão de sinaptofisina e aumento significativo de GFAP em relação aos mesmos lados nos camundongos C57BL/10. Ainda, a análise ultraestrutural quantitativa indicou maior retração ciática na linhagem MDX, antes e após a transecção do nervo isquiático. Através dessas observações, podemos sugerir que essa redução de sinapses nos motoneurônios alfa-medulares e aumento da astrogliose circunjacente aos neurônios alfa-medulares, seja decorrente da desconexão parcial entre o orgão alvo e o corpo neuronal durante o período de ciclos de degeneração/regeneração muscular que ocorrem a partir das primeiras semanas de vida nos camundongos MDX. Estes ciclos podem repercutir retrogradamente nos corpos celulares dos motoneurônios alfa-medulares, provocando uma série de alterações (como, por exemplo, o edema do corpo celular, a retração de terminações sinápticas, o deslocamento do núcleo para a periferia e a dissolução da substância de Nissl) denominadas cromatólise. Houve aumento da expressão de MHC I, em graus variáveis, nas duas linhagens. Os resultados da imunohistoquímica mostram uma correlação entre a reatividade glial subseqüente à axotomia e o processo de retração sináptica que ocorre ao nível da medula espinhal. Logo, reforçam a idéia de que os astrócitos são elementos ativos no processo de plasticidade sináptica. / Abstract: The Duchenne muscular dystrophy (DMD) is characterized by muscle degeneration and structural defects in the neuromuscular synapse that are caused by mutations in dystrophin. It is an X-linkend recessive and progressive musclewasting disease. It affects approximately 1/3500 male births. Diagnosis of the DMD is usually made between the ages from 2 to 5 years old. Life expectancy is between the late teens and early twenties. At present, a lot is known about the muscular injuries in the Duchenne muscular dystrophy, but few studies are focused on the effects of the disease in the Central Nervous System, more specifically in the microenvironment surrounding the alpha motoneurons. The aim of this study was to investigate eventual synaptic alterations and glial reactivity changes in the microenvironment surrounding the alpha motoneurons in a Duchenne muscular dystrophy animal model, namely the MDX mice. In this sense, six weeks old, male, MDX mice, were subjected to the left sciatic nerve transection. The axotomy was performed after the cycles of muscular degeneration/regeneration, previously described in such model of muscular dystrophy. C57BL/10 mice were used as controls. Seven days after surgery, the animals were sacrificied and their lumbar spinal cords processed for immunohistochemistry (anti-MHC I, anti-Synaptophysin and anti-GFAP glial fibrillary acidic protein antisera were used. Overall MHC-I expression increased in both strains after axotomy. Nevertheless, MDX mice displayed a significantly smaller MHC I upregulation (MDX, 18,90 ± 0,60, mean + se; C57BL/10, 24,34 ± 1,06, p>0,05). Regarding GFAP expression, MDX showed a stronger astrogliosis in comparison to C57BL/10 mice (MDX, 16,0 ± 1,06; C57BL/10, 9,7 ± 0,43; p<0,01). In MDX mice the imunostaining demonstrated significant decreased of synaptophysin expression (MDX, 4,250778 ± 0,300686; C57BL/10, 5,694914 ± 0,283379; p< 0,05). Indeed, ultrastrutural quantitative analysis showed more intense synaptic detachment in MDX mice, indicating a reduction of synaptic activity before and after axotomy. We conclude that the reduction of active inputs to the alpha motoneurons and increased astrogliosis in MDX mice maybe associated with the cycles of muscle degeneration/regeneration that occur postnatally. Also, the decreased MHC I expression in MDX mice may indicate a lower regenerative potential after lesion. / Mestrado / Anatomia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Elaine Minatel / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T07:56:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tonon_Erika_M.pdf: 1677236 bytes, checksum: e065259ff1028e91f63695538acbe0e8 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A peroxidação lípidica causada pelo aumento de espécies reativas de oxigênio (EROs) no período que antecede o início da degeneração muscular no camundongo mdx, sugere que o estresse oxidativo pode ser um dos mecanismos primários da degeneração muscular distrófica, ao invés de ser um efeito secundário deste processo. No presente trabalho verificamos se o tratamento com ácido ascórbico antes que se iniciem os ciclos de degeneração/regeneração diminui a degeneração muscular em camundongos mdx. Camundongos mdx com 14 dias de vida pós-natal receberam por gavagem doses diárias de 0,1mg/kg de Ácido Ascórbico diluído em água por 7 (grupo mdx T7) e 14 dias (grupo mdx T14) e/ou dose de 200mg/kg por 14 dias (grupo mdx T14AA). Animais mdx controle receberam solução salina. Após este período, os músculos tibial anterior (TA), esternomastóide (STN) e diafragma (DIA) foram retirados. Na análise histológica, o ácido ascórbico diminuiu a degeneração muscular nos músculos TA do grupo mdx T7 e no DIA do grupo mdx T14AA (P<0,05, Student's t Test) quando comparados ao controle. Não houve diferença significativa nos níveis séricos de creatina quinase entre os grupos analisados (P>0,05, Student's t Test). Aumento significativo no conteúdo de TNF-", pela técnica de Western Blotting, foi observado nos músculos dos camundongos mdx tratados com ácido ascórbico. Os resultados indicam que o tratamento precoce de camundongos mdx com o ácido ascórbico diminuiu significativamente a mionecrose nos músculos tibial anterior e diafragma. O presente trabalho também sugere que o aumento do TNF-" não está necessariamente correlacionado ao aumento da mionecrose. / Abstract: Increased production of reactive oxygen species (ROS) can cause lipid peroxidation in the period preceding muscle necrosis in the mdx mice. This suggests that ROS may be involved as a primary, rather than secondary, cause of degeneration. In the present study, we verified whether ascorbic acid treatment before the cycles of muscle degeneration-regeneration decreases muscular degeneration in mdx mice. Mdx mice at 14 days of age received 0.1mg/kg of acid ascorbic daily in the water for 7 (group mdx T7) or 14 days (group mdx T14) and/or 200mg/kg for 14 days (group mdx T14AA). Control mdx mice received saline. After this period the tibialis anterior (TA), sternomastoid (STN) and diaphragm (DIA) muscles were removed. Hislogical analysis showed that ascorbic acid significantly decreased muscle degeneration in the TA of mdx T7 group and in the DIA of mdx T14AA group (P<0,05, Student's t Test) compared to control. There were no changes in serum CK activity in the ascorbic acid-treated mice compared to control (P>0,05, Student's t Test). Immunoblots showed a significant increase in the content of TNF-" in the muscles of the treated mdx mice. The present results indicate that ascorbic acid treatment before the cycles of muscle fiber degeneration-regeneration significantly decreases myonecrosis in TA and DIA dystrophic muscles. The present findings also sugest that increase TNF-" not necessarily correlates with increased myonecrosis. / Mestrado / Anatomia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é uma importante e severa doença músculo degenerativa causada pela mutação do gene da distrofina. Na ausência da distrofina, o sarcolema das células torna-se vulnerável devido a danos induzidos por ciclos contínuos de degeneração e regeneração. Consequentemente, a força muscular diminui e as miofibras são substituídas por tecido fibrótico. Dentre os músculos esqueléticos afetados, o diafragma, destaca-se por ser o principal músculo respiratório acometido na DMD. Similarmente a DMD humana, o modelo mdx, apesar de exibir um fenótipo suave, este apresenta um severo acometimento no músculo diafragma, assim como observado em nosso estudo prévio, aqui descritos. Entretanto, este é considerado um modelo pobre, porque ele não consegue reproduzir, o fenótipo severo observado nos pacientes. O camundongo mdx/utrn+/- (dystrophin-null heterozygous urtrophin mice) com haploinsuficiência da utrofina, tem sido hipotetizado como um modelo com um fenótipo intermediário, ganhando popularidade nos laboratórios. Porém, infelizmente, até os dias de hoje, não existe evidências fisiológicas e funcionais suficientes que justifiquem a escolha deste modelo para as terapias experimentais. Portanto, neste estudo objetivou-se esclarecer a real contribuição do camundongo mdx/utrn+/- para as terapias experimentais. Para testar esta hipótese, elegeu-se analisar a morfologia e a função muscular do músculo diafragma do mdx e mdx/utrn+/- com 2 e 6 meses de idade. Para elucidar a morfopatologia do diafragma foi utilizado microscopia de luz e análises de imunohistoquímica. A função muscular do diafragma foi analisada através da avaliação das propriedades contráteis e passivas. A forma de como executar a função muscular do diafragma foi atualizada através da criação de dois clips, os quais permitiram avaliar o músculo de forma segura. A adaptação de um novo protocolo de avaliação da função muscular mostrou-se eficaz e capaz de ser utilizada para avaliar as propriedades contráteis e passivas. Aos 2 meses de idade, as colorações de Hematoxilina e eosina, Tricômio de Masson e Alizarina vermelha revelaram que o mdx/utrn+ apresentou maior quantidade de infiltrado inflamatório, tecido conectivo e áreas de calcificação do que o mdx. Já aos 6 meses de idade, não houve diferença morfológica entre o mdx e o mdx/utrn+/-. Na análise de imunohistoquímica para eMyHC (miosina embrionária de cadeia pesada eMyHC), não foi observada diferença entre o mdx e o mdx/utrn+/-aos 2 e 6 meses de idade. Entretanto, os resultados obtidos em ambas as idades, demonstraram a presença de regeneração muscular. Na marcação da proteína distrofina e utrofina, as células inflamatórias e os tipos de fibras musculares também foram detectados por imunohistoquímicas. A marcação da proteína distrofina, mostrou-se ausente no mdx e mdx/utrn+/- com 2 e 6 meses de idade. A marcação da proteína utrofina mostrou-se mais evidente no mdx do que no mdx/utrn+/-, videnciando a haploinsuficiência nos mdx/utrn+/-. Macrófagos foram encontrados em maior quantidade no camundongo mdx/utrn+/- com 2 e 6 meses do que no mdx, mostrando que o processo de inflamação encontrou-se aumentado nos mdx/utrn+/- Neutrófilos encontraram-se aumentados no mdx/utrn+/- com 2 meses, evidenciando a fase aguda da inflamação. Entretanto nos animais de 6 meses, quantidades semelhantes de neutrófilos foram detectadas no mdx/utrn+/- e mdx. Fibras marcadas pelas isoformas MyHC- I, IIa e IIx foram detectadas em maior porcentagem no BL10 do que no mdx e mdx/utrn+/- aos 2 meses de idade, demonstrando que a diminuição destas, no mdx e mdx/utrn+/- pode colaborar para a diminuição da força nestes animais. Aos 6 meses, porcentagem similares de MyHC- I foram detectadas no BL10, mdx e mdx/utrn+/-. MyHC-IIa não foram encontradas nos animais de 6 meses. MyHC-IIx encontraram-se em maior porcentagem no BL10 do que no mdx e mdx/utrn+/- com 6 meses de idade. Baixa porcentagem de isoformas de MyHC- I/IIa foram detectadas no mdx e mdx/utrn+/- aos 2 e 6 meses de idade e encontraram-se ausentes no BL10 de mesma idade. Fibras marcadas pela isoformas MyHC-IIa/IIx apresentaram-se aumentadas no mdx e mdx/utrn+/- aos 2 e 6 meses, podendo este aumento auxiliar na manutenção da força muscular. MyHC-IIx-IIb foram detectadas em maior porcentagem no mdx, reduzidas no BL10 e ausentes no mdx/utrn+/- com 2 meses de idade. Estas não foram identificadas nos animais de 6 meses. As propriedades contráteis do camundongo mdx/utrn+/- aos 2 meses de idade apresentaram-se mais comprometidas do que no mdx. Pt (contração isométrica máxima), sPt (força específica de Pt), Po (Força tetânica máxima) e sPo (força específica de Po) exibiram-se mais afetadas no mdx/utrn+/- do que no mdx. Porém aos 6 meses de idade não houve diferença significativa de força entre o mdx/utrn+/- e o mdx. As propriedades passivas do mdx/utrn+/- com 2 meses apresentou mais acometida do que no mdx. Entretanto, aos 6 meses, esta propriedade não se diferenciou entre o mdx/utrn+/- e o mdx. Em suma, conclui-se que o mdx/utrn+/- representa um modelo superior ao mdx com 2 meses de idade, uma vez que este apresentou morfologia, propriedades contráteis e passiva mais comprometidas do que no mdx. Aos 6 meses as propriedades contráteis e passivas e morfológicas do camundongo mdx/utrn+/- não se diferenciou do mdx. Sugerimos que o uso do mdx/utrn+/- com 2 meses de idade pode potencializar os testes pré-clinicos / Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is an important and severe muscle wasting disease caused by a dystrophin mutation. In the absence of dystrophin, sarcolemma becomes vulnerable to damage due a damage caused by continuous cycles of degeneration regeneration. Consequently, the muscle force reduces and the myofibers are replaced by fibrotic tissue. Between the skeletal muscles, the diaphragm is main affected muscle in DMD. Similarly, to a human DMD, despite the mdx model exhibit a milder phenotype, he presents the diaphragm muscle severely affected, as it was observed in our previous study, here described. However, it is also considered a poor model because it cannot reproduce the severe dystrophic phenotype seen in patients. An utrophin heterozygous utrophin mice (mdx/utrn+/- ), has been hypothesized as an intermediate model and they are gaining popularity in many laboratories. However unfortunately there is currently, no physiological enough evidence to justify the choice of this model for experimental therapies. Therefore, in this study, we aimed to elucidate the real contribution of the mdx/utrn+/- for the experimental therapies. To test this hypothesis, we evaluated the diaphragm muscle morphology and muscle function of the mdx and mdx/utrn+/- with 2 and 6 months. To elucidate the diaphragm morphology, we used light microscopy techniques and immunostaining analysis. Muscle function was evaluated through the active and passive properties. The clamps allowed to safe evaluate the diaphragm function. The update of the new protocol was efficient and able to evaluate the active and passive properties. At 2 months, the Hematoxylin and eosin, Masson Thrichome, Alisarine red, revealed that the mdx/utrn+ showed more inflammatory infiltrate, connective tissue and more areas with calcification than mdx model. At 6 months, there was no significant differences between mdx and mdx/utrn+. In the immunohistochemical analysis for eMyHC (embryonic myosin heavy chain), there was no difference between mdx and mdx/utrn+/- at 2 and 6 months. However, the results obtained in both ages, showed muscle regeneration Marking for dystrophin and utrophin protein, inflammatory cells and fiber type were also detected by immunohistochemistry. Marking for dystrophin was absent in mdx and mdx/utrn+/- with 2 and 6 months. Marking for utrophin protein was more evident in mdx than in mdx/utrn+/- mice, evidencing the utrophin haploinsufficiency in mdx/utr+/-. Macrophages were increased in mdx/utrn+/- than in mdx mice with 2 and 6 months, showing an inflammation. Neutrophils were increased in mdx/utrn+/- at 2 month-old, evidencing the acute phase of inflammation. However, at 6 months similar amounts of neutrophil were detected in mdx and mdx/utrn+/-. Fibers marked by MyHC-I, IIa and IIx were detected in a higher percentage in BL10 than in mdx and mdx/utrn+/- at 2 months, showing that this change could collaborate with force decrease in these animals. At 6 months, similar percentage of MyHC-I was detected in BL10, mdx and mdx/utrn+/-. MyHC-IIa animals were not found at 6 months. Higher percentage of MyHC-IIx was found in BL10 than in mdx and mdx/utrn+/- with 6 months. Low percentage of MyHC- I/IIa was detected in mdx and mdx/utrn+/- at 2 and 6 months and it was absent in BL10 in the same age. Fibers marked by MyHC-IIa/IIx isoforms were increased in mdx and mdx/utrn+/- with 2 and 6 months. These changes could help to maintain the muscle force. MyHC-IIx-IIb was detected in higher percentage in mdx, reduced the BL10 and it was absent in mdx/utrn+/- with 2 months. MyHC-IIx-IIb was not identified in the animals with 6 months. Contractile properties in mdx/utrn+/- at 2 months were more affected than in mdx mice. Pt (maximal twitch force), sPt (specific twitch force), Po (maximal tetanic force) and sPo (specific tetanic force) showed more severely affected in mdx/utrn+/- than in mdx mice. At 6 months there were no significant difference in Pt, sPt, Po and sPo between mdx/utrn+/- and mdx mice. Passive properties of mdx/utrn+/- with 2 months presented more affected than the in mdx mice. However, at 6 months, this property did not differ between mdx/utrn+/- and mdx mice. In summary, we concluded that the mdx/utrn+/- at 2 month represent a superior model than the mdx with matched-age, since they presented morphology and contractile and passive properties more compromised than mdx mice. At 6 months, the mdx/utrn+/-contractile and the passive properties and morphology did not differ from the mdx mice age-matched. We suggest that the use of mdx/utrn+/- with 2 months-old would represent would represent a better model to test the potential of the therapies than mdx mice

A ecocardiografia com Doppler tecidual (EDT) e suas derivadas, o Strain Rate (StR) e o Strain (St), têm por finalidade mensurar a velocidade e a deformação miocárdicas, avaliando assim as funções sistólica e diastólica do miocárdio. Devido à grande semelhança entre a distrofia muscular de Duchenne (DMD), que acomete o homem e se caracteriza por contínua degeneração, necrose e fibrose de tecidos musculares esquelético e cardíaco e apresenta caráter recessivo ligada ao cromossomo X, e a distrofia muscular canina (DMC), considerada geneticamente análoga à DMD, alguns modelos experimentais com cães da raça Golden Retriever têm sido desenvolvidos com a finalidade de auxiliar os estudos relacionados com as referidas enfermidades. No presente estudo, 24 cães da raça Golden Retriever, divididos em três grupos denominados controle, portadores e afetados foram avaliados por meio da ecocardiografia convencional bem como por Doppler tecidual, Strain Rate e Strain com o objetivo de avaliar os índices das funções sistólica e diastólica de cães com distrofia muscular, a fim de aprimorar o diagnóstico e, conseqüentemente, o tratamento dos casos de DMD, assim como os de cães com DMC. Observaram-se diferenças entre alguns parâmetros das funções sistólica e diastólica, principalmente entre o grupo controle e o grupo dos animais afetados, sendo então possível afirmar que cães da raça Golden Retriever, afetados pela DMC e sem manifestações clínicas de insuficiência cardíaca congestiva (ICC), apresentam alterações dos índices tanto da função sistólica como da função diastólica, passíveis de serem detectadas pela EDT, St e StR. / Tissue Doppler imaging (TDI), strain rate, and strain allow for recording myocardial velocity and deformity, for assessment of systolic and diastolic function. There is great similarity between Duchennes muscular dystrophy (DMD) that affects humans, characterized by continuous degeneration, necrosis and fibrosis of skeletal and cardiac muscle and is recessive, linked to X-chromosome, and canine muscular dystrophy (CMD), which is considered genetically analogous to the DMD. Some experimental models have been developed in order to study these diseases. In this study, 24 Golden retriever dogs, allocated to 3 different groups (control, bearer and affected) were evaluated by conventional echo and TDI, strain rate (StR) and strain (St) aiming to evaluate systolic and diastolic function indices of dystrophic dogs in order to improve diagnosis and treatment of DMD cases, as well as CMD. Differences were observed in some variables of systolic and diastolic function specially between control and affected groups. It was possible to confirm that Golden Retriever dogs, affected by CMD and without clinical signs of congestive heart failure, present changes in systolic and diastolic indices, detected by TDI, StR and St.