Orientador: Humberto Santo Neto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T14:32:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_JulianoAlves_D.pdf: 20174519 bytes, checksum: cb29b0264ecac77cff508a6dbc1ec270 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Na distrofia muscular de Duchenne (DMD) e no camundongo mdx, a ausência da distrofina no músculo esquelético e cardíaco, desestabiliza o sarcolema e leva a um aumento do influxo de cálcio e consequente mionecrose. A reação inflamatória induzida para remover a fibra muscular necrótica, ativa a produção de citocinas pró-inflamatórias, que por sua vez aumenta o estresse oxidativo e ultimamente levando a formação de fibrose intersticial. A terapia padrão ouro usada no tratamento da DMD é o corticosteroide, tal como a prednisona e o deflazacorte (DFZ). No entanto, eles apresentam valor terapêutico limitado, e sua combinação com drogas já aprovada para o tratamento de outras doenças humanas, como a doxiciclina (DOX) poderia ser uma alternativa no tratamento clínico em pacientes DMD. No presente estudo, investigamos os benefícios da terapia do DFZ associado a DOX em relação ao tratamento padrão ouro DFZ, na atenuação da evolução da distrofinopatia em músculo esquelético e cardíaco de camundongos mdx. As terapias com cada droga isoladamente (DOX 6 mg/mL), (DFZ 1,2 mg/Kg) e com a combinação DOX (6 mg/mL) / DFZ (1,2 mg/Kg) foram administradas na água de beber para mãe e seus recém nascidos, com início no dia do nascimento no grupo tratado de curta duração por 36 dias. No tratamento de longa duração (9 meses), as mesmas terapias e as mesmas doses foram administradas na água de beber, com início aos 8 meses até os 17 meses de idade. Os parâmetros histopatológicos, funcionais e bioquímicos foram avaliados no músculo esquelético (bíceps braquial e diafragma) e coração. A DOX/DFZ apresentou-se vantajosa em relação a monoterapia com DFZ tanto na proteção inicial contra a mionecrose, quanto em retardar a progressão da distrofinopatia nos músculos esqueléticos. Mostrou-se também vantajosa em relação ao DFZ na proteção cardíaca. A combinação da DOX com o DFZ, já utilizada no tratamento de algumas doenças emerge como um tratamento potencialmente útil para DMD / Abstract: In Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) and in mdx mice, absence of dystrophin in skeletal and cardiac muscle disrupts the sarcolemma and leads to increased calcium influx and consequent myonecrosis. The inflammatory reaction elicited to remove muscle fiber debris results in production of pro-inflammatory cytokines which, in turn, increases oxidative stress, and ultimately causes interstitial fibrosis. The gold standard therapy used in the treatment of DMD consists in the use of corticosteroids such as prednisone and deflazacort (DFZ). However, these drugs have limited therapeutic value and their combination with drugs already approved for the treatment of other human diseases such as doxycycline (DOX) could be beneficial in the clinical management of DMD patients. In this study, we investigated the benefits of the association between DFZ and DOX over therapy with DFZ (gold standard), in mitigating the evolution of dystrophinopathy in skeletal and heart muscle in mdx mice. The treatments with the single drug (DOX 6 mg/mL), (DFZ 1,2 mg/Kg) or DOX (6 mg/mL) / DFZ (1,2 mg/Kg) combination were administered in drinking water to mothers and newborns, starting on the day of birth in the short-term treatment group for a period of 36 days. In the long-term treatment group, which was composed of mice 17 months of age, the same treatments were administered in drinking water to mdx mice for 9 months, starting on their 8 month of birth. Histopathological, functional and biochemical parameters were evaluated in skeletal (biceps brachii and diaphragm) and cardiac muscle. DOX/DFZ combination was found to be advantageous over monotherapy with DFZ either by promoting an initial protection against myonecrosis or by slowing the progression of dystrophinopathy of skeletal muscles. It was also advantageous for cardiac protection. The combination of DOX with DFZ, which has already been used in the treatment of some diseases, has emerged as a potential useful therapy for DMD / Doutorado / Anatomia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

As Distrofias Musculares Progressivas (DMP) constituem um grupo de doenças genéticas caracterizadas por uma degeneração progressiva e irreversível da musculatura esquelética. A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é a forma mais comum e grave de DMP. Obedece a herança recessiva ligada ao X e é caracterizada pela ausência de distrofina na membrana das fibras musculares. Atualmente não existe nenhum tratamento efetivo para este grupo de doenças. Deste modo, este trabalho tem como objetivo principal avaliar o potencial terapêutico das células-tronco mesenquimais de tecido adiposo humano (human Adipose-derived Stem Cells - hASCs) visando à regeneração ou diminuição da degeneração muscular. Para tanto, verificamos o potencial miogênico destas células in vitro, utilizando células musculares de pacientes DMD e in vivo utilizando como modelo camundongos distróficos e cães da raça Golden Retriever portadores de distrofia muscular (GRMD - Golden Retriever Muscular Dystrophy). Demonstramos neste estudo que hASCs são capazes de restaurar a expressão de distrofina in vitro, quando co-cultivadas com células musculares de pacientes DMD. Frente a estes resultados, continuamos nossos estudos em modelos animais, in vivo, e demonstramos que as hASCs são capazes de chegar à musculatura de camundongos distróficos e de cães GRMD, quando injetadas por via venosa, e de restaurar a expressão da proteína muscular defeituosa. Foi possível observar uma melhora funcional nos camundongos injetados. Nos cães GRMD encontramos distrofina humana seis meses após a última injeção entretanto é difícil julgar se houve melhora clínica. Todos esses experimentos de xenotransplantes foram feitos sem imunosupressão e não observamos rejeição. Concluímos que o tecido adiposo é uma fonte de células-tronco com potencial para regeneração muscular in vivo. Contudo é de extrema importância repetir os experimentos em um número maior de cães GRMD e ainda investigar novas estratégias visando melhorar os resultados obtidos neste trabalho, antes de começar qualquer teste clínico. / Progressive muscular dystrophies (PMD) are a clinically and genetically heterogeneous group of disorders caused by the deficiency or abnormal muscle proteins, resulting in progressive degeneration and loss of skeletal muscle function. As effective treatments for these diseases are still unavailable, they have been widely investigated as possible candidates for stem cell therapy. Duchenne Muscular Dystrophy (DMD), a lethal X-linked disorder, is the most common and severe form of muscular dystrophies, affecting 1 in 3000 male births. Mutations in the DMD gene lead to the absence of muscle dystrophin. The aim of this study is to evaluate the therapeutic potential of human Adipose-derived Stem Cells (hASCs) for muscle regeneration. First we verified the myogenic potential of these cells in vitro co-culturing them with muscle cells from DMD patients and verifying that hASCs are able to restore dystrophin expression in vitro. Subsequently we repeated this experiment in vivo using the dystrophic mice SJL and the dystrophic golden retriever dogs (GRMD - Golden Retriever Muscular Dystrophy) as animal models. We demonstrated that the hASCs are able to reach the muscles of the dystrophic mice and the GRMD dogs when injected systemically and restore expression of absent muscle protein, without any immunosupression. We observed a functional improvement in the injected mice. We found human dystrophin in injected dogs up to 6 months after the last injection. However it is difficult to evaluate if there was clinical improvement in the GRMD dogs due to their great phenotypic variability. We conclude that the adipose tissue is a source of stem cells with potential for muscle regeneration in vivo and that human cells are not rejected even in xenotransplants without immunosuppression. However it is important to repeat the experiments on a larger number of GRMD dogs and to investigate new strategies to improve our findings before starting any clinical trial.

As distrofias musculares formam um grupo amplo e heterogêneo de doenças genéticas, caracterizado basicamente pela degeneração e fraqueza muscular. Ao longo das últimas décadas muitos estudos vêm sendo realizados para a identificação dos genes causadores dessas doenças. Entretanto, apesar da identificação da mutação responsável pela grande maioria das formas descritas, os processos moleculares subjacentes ao defeito genético primário são muito complexos e ainda precisam ser melhor compreendidos. E a compreensão dos mecanismos de cada uma das formas é muito importante para o desenvolvimento adequado de terapias. A avaliação da expressão gênica global por microarranjos de DNA é uma ferramenta bastante poderosa, capaz de produzir uma grande quantidade de dados, delineando o panorama geral do estado do transcriptoma de um determinado tecido ou célula. Assim, os objetivos desse trabalho foram estudar os perfis de expressão do músculo de três linhagens de camundongos modelos de formas distintas de distrofia muscular (Dmdmdx, Largemyd-/- e Dmdmdx/Largemyd-/-) em diferentes fases da progressão da doença (21 dias, três meses e seis meses de idade), com o intuito de caracterizar o processo distrófico e como o perfil de expressão varia com a progressão da idade e a depender da mutação genética. Em cada um dos modelos e idades estudados identificamos um grande número de genes diferencialmente expressos (GDEs), refletindo a complexidade dessas doenças. A análise dos processos e vias biológicas nas quais esses genes estão envolvidos mostrou o forte envolvimento de componentes do sistema imunológico e inflamação, e também de genes relacionados com os processos de degeneração/regeneração e remodelamento da matriz extracelular. De modo geral, as funções biológicas alteradas são bem semelhantes entre as linhagens, sugerindo que apesar de as mutações serem em genes distintos, com funções diferentes, os processos moleculares que são afetados em decorrência dessas mutações são praticamente os mesmos. As maiores diferenças foram vistas na idade de 21 dias, especialmente na linhagem Dmdmdx que apresentou uma grande quantidade de GDEs, dos quais grande parte relacionada com a maior capacidade regenerativa dessa linhagem e, assim, são genes que podem explicar o porquê desses animais apresentarem um fenótipo benigno em relação aos pacientes humanos. A caracterização do modelo duplo-mutante Dmdmdx/Largemyd-/- mostrou que a junção das duas mutações não ocasiona alterações no transcriptoma distintas das obsevadas nas linhagens parentais, sendo que o perfil do duplo-mutante é mais próximo ao de seu parental Largemyd-/-, não apresentando a mesma capacidade regenerativa que o Dmdmdx / The muscular dystrophies form a large and heterogeneous group of genetic diseases, characterized mainly by progressive muscular degeneration and weakness. In the last decades, many studies have been carried on in order to identify the involved genes in these disorders. However, despite the identification of responsible mutations of the majority of the described forms, the underlying molecular processes to the primary mutation are very complex and are not fully understood. And to understand the mechanisms of each form is of major importance to the development of therapies. Global gene expression profiling by DNA microarrays is a powerful tool, able to yield a huge quantity of data, outlining the general landscape of the transcriptome of a given tissue or cell. In this sense, the objectives of this work were to study the expression profile of the muscles from three mice lineages, models for different forms of muscular dystrophy (Dmdmdx, Largemyd-/- and Dmdmdx/Largemyd-/-) in different phases of disease progression (21-day-old, three-month-old and six-month-old), in order to characterize the dystrophic process and how the expression profile changes according to aging and depending on the genetic mutation. In each model and age studied we identified a substantial number of differentially expressed genes (DEGs), reflecting the diseases\' complexity. The analysis of the biological processes and pathways in which these genes are implicated showed a strong involvement of immune system and inflammation components, and also genes related to degeneration/regeneration and extracellular matrix remodeling processes. Altogether, the altered biologic functions are very similar in lineages, suggesting that although mutations are in different genes, with diverse functions, the affected molecular processes due to these mutations are basically the same. The most notable differences were seen on 21-day-old, especially on Dmdmdx lineage that showed a great quantity of DEGs, many of which are related to the better regenerative capacity this lineage exhibits and, thus, they are genes that could explain why these animals manifest a mild phenotype in comparison to human patients. The characterization of the double mutant Dmdmdx/Largemyd-/- showed that the union of both mutations does not bring on alterations on the transcriptome different from those seen in the parental lineages, with the double mutant profile closer to its parental Largemyd-/-, not bearing the same regenerative capacity that Dmdmdx

As distrofias musculares progressivas (DMP) são um grupo de doenças genéticas hereditárias caracterizadas pela degeneração progressiva e irreversível da musculatura esquelética. A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é a forma mais comum e mais grave de DMP, com prevalência de 1 a cada 3500 a 5000 meninos. Em geral, a perda da ambulação ocorre entre 9 a 12 anos e complicações respiratórias e cardíacas podem levar ao óbito a partir da segunda década. A pesquisa em terapia celular iniciou-se com o objetivo de reverter ou diminuir a progressão do processo distrófico através do repovoamento do músculo com células normais. Atualmente, acredita-se em um benefício terapêutico com base nas propriedades anti-inflamatórias, anti-fibróticas e imunomodulatórias das células tronco adultas (CTA). As CTAs mesenquimais são bastante heterogêneas quanto à sua composição celular o que ocasiona inconsistência de resultados. Por isso, a caracterização e separação de sub-populações através de marcadores específicos e o enriquecimento de culturas de CTA com um subtipo celular de interesse pode aumentar a robustez e o efeito das terapias. Uma dessas subpopulações é o pericito que, ao contrário das CTAs mesenquimais, foi bem descrito quanto à sua localização e função in vivo. Além disso, pericitos derivados de tecido adiposo humano aumentaram a sobrevida de camundongos duplo mutantes para distrofina e utrofina (dko). Dessa forma, este trabalho pretendeu comparar o potencial terapêutico de CTAs mesenquimais e pericitos de um mesmo tecido adiposo em camundongos dko. Conseguimos confirmar o resultado anterior, mostrando que os pericitos tendem a melhorar a sobrevida de animais tratados, sendo ainda melhores do que células mesenquimais, mas a melhora perdura somente durante o tratamento. A sobrevida é maior no começo do tratamento, sugerindo que o quanto antes o tratamento for iniciado, com animais mais jovens e sintomas mais leves, melhor poderá ser o resultado. Outras perguntas a serem pesquisadas na tentativa de melhorar o efeito terapêutico da terapia celular com pericitos são: número de injeções, quantidade de células a serem injetadas, tempo de tratamento e idade das células \"doadoras\" / Progressive muscular dystrophies (PMD) are inherited genetic diseases characterized by progressive muscle loss and weakness. Duchenne muscular dystrophy (DMD) is the most common and aggressive form of PMD, with incidence of 1 in every 3500-5000 boys. In general, patients with DMD are confined to wheelchairs around 9-12 years of age and death occurs due to respiratory and heart dysfunction after the second decade. Cell therapy research at first aimed to recover or slow down the dystrophic process by repopulating the patient\'s muscle with normal cells. However, nowadays it is believed also that therapeutic benefits occur by the anti-inflammatory, anti-fibrotic and immunomodulation properties of mesenchymal stem cells (MSC). MSC are constituted by an heterogeneous cell population and therefore, cell sorting of the subpopulation cell of interest is being done routinely. By doing this enrichment, the effect can be more robust and powerful. One of the cell populations of interest for research is pericyte, which are cells well defined regarding their in vivo function and location, as opposed to MSC. Besides that, pericytes derived from adipose tissue were successful in increasing survival of double knockout mice for dystrophin and utrophin (dko). The present work aimed to compare the therapeutic potential of MSC and pericytes derived from the same adipose tissue sample in the dko mouse model. We confirmed our previous results, showing that pericytes tend to improve the survival of treated mice, and are even better than MSC from the same source but the trend was statistically significant only during the treatment period. Additionally, we also observed that the survival was better in the beginning of treatment, suggesting that earlier treatment may lead to a better therapeutic effect. In an attempt to increase the therapeutic effect of these procedure other questions to be asked are: the number of injections and number of cells per injection, the duration of the treatment and the \"age\" of the donor cells

Novas abordagens terapêuticas vêm sendo introduzidas para doenças musculares genéticas como distrofias musculares e miopatias congênitas, distúrbios que permanecem sem cura até o momento. Estes recentes avanços motivaram um interesse renovado e crescente por métodos não invasivos para a caracterização e monitoramento do músculo afetado, particularmente durante e após intervenções terapêuticas. Neste contexto, modelos animais são essenciais para uma melhor compreensão dos mecanismos das doenças e para testar novas terapias. Recentemente, avanços significativos na avaliação não invasiva de modelos murinos para doenças musculares genéticas foram alcançados. Entretanto, diversas linhagens de camundongos ainda não foram caracterizadas de maneira não invasiva, e ainda é necessário o desenvolvimento de métodos sensíveis para a identificação precoce de alterações sutis no músculo de camundongos afetados. A proposta desta tese é aplicar técnicas não invasivas inovadoras no estudo do músculo de modelos murinos para doenças musculares genéticas com fenótipos variados. Três modelos murinos para distrofias musculares (mdx, Largemyd, mdx/ Largemyd) e um modelo murino para miopatia congênita (KI-Dnm2R465W) foram estudados com métodos de Ressonância Magnética Nuclear (RMN). Duas linhagens distróficas (Largemyd, mdx/ Largemyd) e camundongos normais após injúria foram estudados através de micro-Tomografia Computadorizada (micro-CT). Em RMN, todas as linhagens de camundongos afetados apresentaram aumento de T2 muscular, o que foi relacionado a diversas anomalias na análise histológica, como necrose e inflamação, mas também a conjuntos de fibras em regeneração ou a fibras com citoarquitetura alterada. A combinação de RMN com análise de textura permitiu a identificação não ambígua de todas as linhagens distróficas, sendo que apenas a comparação dos valores de T2 muscular não permitiu esta diferenciação. Camundongos mdx mostraram alterações funcionais e morfológicas na rede vascular do músculo. Estudo piloto em camundongos KI-Dnm2R465W revelou tendências de comprometimento da função muscular. Por fim, imagens de micro-CT não permitiram a detecção de diferenças na composição muscular em camundongos distróficos. Este conjunto de resultados não apenas enriquece o painel de modelos murinos para doenças musculares genéticas caracterizados de maneira não invasiva, mas também demonstra um certo grau de especificidade nas anomalias observadas nas imagens, como revelado pela análise de textura. Estes resultados também mostraram que métodos não invasivos de RMN podem ser suficientemente sensíveis para identificar alterações sutis no fenótipo muscular murino, mesmo em estágios precoces. Esta tese foi desenvolvida sob acordo de co-tutela internacional entre a França e o Brasil, e compreendeu uma importante transferência de conhecimento, com os primeiros estudos não invasivos de músculo murino realizados no Brasil. / Novel therapeutic approaches are being introduced for genetic muscle diseases such as muscle dystrophies and congenital myopathies, all of them having remained without cure so far. These recent developments have motivated a renewed and augmented interest in non-invasive methods for muscle characterization and monitoring, particularly during and after therapeutic intervention. In this context, animal models are essential to better understand the disease mechanisms and to test new therapies. Recently, significant advances in the non-invasive evaluation of mouse models for genetic muscle diseases have been achieved. Nevertheless, there were still several mouse strains not characterized non-invasively, and it was necessary to develop sensitive methods to identify subtle alterations in the murine affected muscle. The purpose of this thesis was to apply non-invasive techniques in the study of murine models for genetic muscle diseases with variable phenotypes. Three mouse models for muscle dystrophy (mdx, Largemyd, mdx/ Largemyd) and one mouse model for congenital myopathy (KI-Dnm2R465W) were studied with Nuclear Magnetic Resonance (NMR) methods. Two dystrophic strains (Largemyd, mdx/ Largemyd) and normal mice after injury were studied through micro-Computed Tomography (micro-CT). On NMR, all affected mouse strains presented increased muscle T2, which could be related to variable features in the histological evaluation, including necrosis and inflammation, but also to clusters of fibers under regeneration or with altered cytoarchitecture. The combination of NMR and texture analyses allowed the unambiguous differential identification of all the dystrophic strains, although it was not feasible when comparing the muscle T2 measurements only. Mdx mice showed functional and morphological alterations of vascular network. In the KI-Dnm2R465W mice, a pilot study revealed tendencies of functional impairment. Finally, micro-CT images were unable to detect differences in muscle´s content in dystrophic mice. Altogether, these results not only increased the number of murine models for genetic muscle diseases non-invasively characterized, it also demonstrated some degree of specificity of the imaging anomalies, as revealed by texture analysis. It also showed that non-invasive NMR methods can be sensitive enough to identify subtle alterations in murine muscle phenotype, even in early stages. This thesis was developed under an international joint supervision between France and Brazil, and comprised an important transfer of technology, with the first non-invasive studies of murine muscles performed in Brazil.

A miostatina é um agente regulador negativo do crescimento muscular. Na terapia de suplementação com testosterona observou-se diminuição na expressão da miostatina. Este trabalho tem como objetivo determinar a influência do esteróides anabolizantes na expressão do gene da miostatina em camundongos normais, C57BL e no modelo distrófico Largemyd. Utilizamos a técnica de PCR em tempo real, para determinarmos a expressão relativa dos genes. Os animais tratados apenas com esteróide apresentaram aumento significativo em sua massa corpórea, com melhora de desempenho nas avaliações funcionais no Largemyd. Não foram observadas diferenças significativas na expressão do genes da miostatina no músculo normal e distrófico. Concluímos que o uso do esteróide anabolizante foi benéfico para o aumento na força do modelo Largemyd, mas o aumento de massa corpórea nestes animais, como no camundongo normal, não deveu-se a inibição da expressão da miostatina. / Myostatin is a negative regulator agent of muscle growth. In the testosterone supplementation therapy we observed decreased myostatin expression. The aim of this project is to determine the influence of anabolic steroids in the expression of myostatin gene in normal C57BL mice and in the dystrophic model Largemyd. We used the Real Time PCR assay to determine the relative expression of genes. Animals treated only with steroids presented significant increase in body mass and Largemyd showed improvement in the functional evaluations. There werent significant differences in the myostatin gene expression in the normal and dystrophic muscle. We concluded that the use of anabolic steroid was benefic to the increase of the strength in the Largemyd model, but the increase of body mass in these animals, as in the normal mice, is not related to the inhibition of myostatin expression.

INTRODUÇÃO: As distrofias musculares progressivas e a amiotrofia espinhal progressiva (AEP) são doenças neuromusculares (DNM) caracterizadas pela degeneração irreversível das fibras musculares, a qual leva à fraqueza muscular e à incapacidade motora. Qualidade de Vida Relacionada à Saúde (QVRS) inclui subjetividade, multidimensionalidade, aspectos negativos e positivos diante da percepção e da expectativa individual de vida; sofre influência cultural. JUSTIFICATIVA: A avaliação da QVRS é essencial para definir a resposta ao tratamento multidisciplinar ou efetivo do paciente com DNM e para sinalizar medidas destinadas a incrementar o sucesso terapêutico. OBJETIVOS: Validar os questionários Life Satisfaction Índex for Adolescents (LSI-A) versão pais e versão paciente e Pediatric Quality of Life Inventory Duchenne (PedsQL DMD) versão pais e versão paciente para o português; avaliar a QVRS dos pacientes com distrofia muscular de Duchenne (DMD), amiotrofia espinhal progressiva (AEP) ou distrofia muscular de cinturas (DMC); avaliar a QV familiar e da mãe/cuidadora. METODOLOGIA: Os questionários LSI-A e PedsQL DMD foram validados obedecendo às etapas de adaptação cultural e validação. Após validação, o questionário LSI-A foi aplicado a pacientes com DMD, AEP ou DMC; o PedsQL Duchenne foi aplicado aos pacientes com DMD e o PedsQL NM a pacientes com AEP ou DMC. Os pais dos pacientes responderam ao FQoL e as mães/cuidadoras ao WHOQOL-Bref. Para cálculo estatístico utilizaram-se: testes alfa de Cronbach, CIC, Pearson, Curva ROC para a validação, e Mann Whitney, Friedman e Dunn para a aplicação. RESULTADOS: Quanto à validação: Probe final do LSI-A versão pais, 97% e versão paciente, 95%; PesdQL DMD versão pais, 99% e versão paciente, 97%, sinalizando compreensão excelente; o teste ? de Cronbach no LSI-A versão pais e paciente, respectivamente, obteve escore geral 0.87 e 0.89; no PesdsQL versão pais e versão paciente, respectivamente, escore geral 0.87 e 0.84. Em ambos foi evidenciado alta confiabilidade dos itens. Quanto à aplicação do LSI-A versão pais e pacientes para avaliação da QVRS, quando comparada aos controles, houve maior número de domínios significantes em pacientes com DMD, AEP ou DMC, nesta ordem. A QVRS mediante aplicação do questionário PedsQL módulo DMD e NM obedeceu a esta mesma sequência. CONCLUSÕES: Conforme os dados psicométricos, os questionários são válidos para serem aplicados a pacientes com DNM e respectivos pais, como segue: LSI-A versão pais e versão paciente a pacientes com DMD, AEP e DMC e respectivos pais, e PedsQL 3.0 Duchenne versão pais e paciente a pacientes com DMD e respectivos pais. A QVRS apresentou-se mais satisfatória nos pacientes com DMC, seguidos pelos pacientes com AEP tipo II e III e, por último, pelos pacientes com DMD. A QV da família apresentou-se reduzida quanto aos aspectos relativos ao bem estar material, particularmente no caso das famílias dos pacientes com DMD. A QV das mães/cuidadoras, decresceu conforme o aumento da idade dos pacientes, quanto aos aspectos psicológicos, sociais e ambientais, em especial a das mães/cuidadoras dos pacientes com AEP / INTRODUCTION: Progressive muscular dystrophies and spinal muscular atrophy (SMA) are neuromuscular diseases (NMD) characterized by irreversible degeneration of muscle fibers which leads to muscle weakness and motor disability. Health-related quality of life (HRQoL) includes subjectivity, multidimensionality, negative and positive aspects on the perception and individual life expectancy; in addition, it suffers cultural influences. BACKGROUND: The assessment of HRQoL is essential to define the response to the multidisciplinary or effective treatment of patients with NMD and to indicate measures to increase the therapeutic success. OBJECTIVES: to validate to the Portuguese the following HRQoL instruments for patients with NMD: Life Satisfaction Index for Adolescents (LSI-A) and Pediatric Quality of Life Inventory Duchenne (PedsQL Duchenne); to evaluate the HRQoL of patients with Duchenne muscular dystrophy (DMD), spinal muscular atrophy (SMA) or limb girdle muscular dystrophy (LGMD), and to assess the family and caregiver QoL. METHODOLOGY: The LSI-A and PedsQL Duchenne questionnaires were validated obeying the stages of cultural adaptation and validation. After validation, the LSI-A questionnaire was administered to patients with DMD, SMA or LGMD, the PedsQL Duchenne to patients with DMD, and the PedsQL NM to patients with SMA or LGMD. Parents of patients responded to FQoL and mothers/caregiver to WHOQOL-Bref. For statistical calculations were used: ? test Cronbach, CIC, Pearson, ROC curve for validation, and Mann Whitney, Friedman and Dunn for the application. RESULTS: Validation: the final \"Probe\" of the LSI-A parents version was 97% and patient version, 95%; PesdQL DMD parents version, 99% and patient version, 97%, indicating excellent comprehension; Cronbach\'s alfa test at LSI-A parents and patients version, respectively, achieved overall score 0.87 and 0.89; at PesdsQL parents and patient version, respectively, were obtained overall score 0.87 and 0.84. At both it was demonstrated high reliability of the items. At the application of LSI-A parents and patients version to measure HRQoL compared to controls, there was a greater number of significant dominions in DMD, SMA and LGMD, in that order. The PedsQL DMD module and NM followed the same sequence. CONCLUSIONS: According with the psychometric data, questionnaires are valid to be applied to parents and patients with NMD, as follows: LSI-A to parents and patients with DMD, SMA and LGMD, and PedsQL 3.0 Duchenne to patients with DMD and parents. The HRQL was more satisfactory in patients with LGMD, followed by patients with SMA and, finally, by DMD patients. The family QOL presented reduction of the aspects concerning material well-being, particularly for families of patients with DMD. The QoL of mothers decreased with the increase of the patients\' age, concerning the psychological, social and environmental aspects, in particular for the mothers of patients with SMA

A Distrofia Muscular de Duchenne/Becker (DMD/BMD) é a doença neuromuscular mais freqüente em crianças, afetando uma em cada 3.500 nascidos vivos do sexo masculino (DMD), e um em cada 20.000 (BMD). A criança nasce aparentemente saudável, com o aparecimento gradual e progressivo dos sintomas desde o primeiro ano de vida. A perda da habilidade de caminhar se dá entre os sete e 12 anos de idade, com sobrevivência rara acima dos 30 anos; e a BMD, de forma mais amena, com os mesmos sintomas aparecendo mais tardiamente. O diagnóstico se baseia nas características clínicas e na investigação genética de deleções e duplicações no gene da distrofina. Um teste preciso ainda é necessário para a identificação de mulheres portadoras. O PCR quantitativo em tempo real seria um bom ensaio para a determinação deste status.O objetivo deste trabalho foi identificar as mulheres portadoras de deleções no gene da distrofina através de PCR quantitativo em tempo real e apresentar informações diagnósticas sobre a população de meninos com DMD/BMD do RS. Informações pertinentes a 123 meninos com diagnostico clínico foram incluídos neste estudo. Após análise dos exames de DNA nos meninos estudados, os exons 47, 48 e 50 se mostraram mais frequentemente deletados na nossa população, confirmando que o segundo "hotspot" gênico é o que mais sofre alterações. Cinco mulheres com filhos com deleções nos exons 45, 47 e 51 foram testadas para estabelecimento do seu status de portadora ou não-portadora. A comparação direta dos exons específicos em relação aos mesmos em outras mulheres, determinou, com uma fácil visualização, a confirmação de três mulheres portadoras e duas não-portadoras, sendo um método preciso e efetivo. É uma abordagem prática e importante para uma utilização em casos de duplicações neste mesmo gene e em outros que necessitem deste tipo de quantificação exata. / Duchenne/Becker Muscular dystrophy (DMD/BMD) is the most frequent neuromuscular disorder in children, affecting one in every 3,500 born male boys (DMD), and one in every 20,000 (BMD). The child is born apparently healthy, with a gradual and progressive appearance of the symptoms during the first year of life. Between the ages of seven to 12, the child demonstrates a loss of the ability to walk, with rare survival above 30 years; and BMD, a milder form, with similar symptoms delayed. The diagnosis is based on the clinical characteristics and a genetic investigation of deletions and duplications in the dystrophin gene. A precise test is still necessary for the identification of carrier women. A quantitative real-time PCR would be a good assay for the determination of this status. The main goals of this study were to identify the carrier women of deletions in the dystrophin gene through the quantitative real-time PCR and to present the diagnostic information available for the population of boys with DMD/BMD in RS. Information pertaining to 123 boys with a clinical diagnosis was included in this study. After the analysis of the boy´s DNA exams, exons 47, 48, and 50 were the most frequently deleted in our population, confirming that the second genetic hospot suffers most of the alterations. Five women that bore children with deletions in exons 45, 47, and 51 were tested for the establishment of their carrier or non-carrier status. A direct comparison of the specific exons to the same ones in other women determined, with an easy visualization, the confirmation of three carrier women and two non-carrier, being a precise and effective method. It is a practical and important approach for the use in cases of duplication in this same gene and in others that may need an exact quantification.

A Distrofia Muscular de Duchenne/Becker (DMD/BMD) é a doença neuromuscular mais freqüente em crianças, afetando uma em cada 3.500 nascidos vivos do sexo masculino (DMD), e um em cada 20.000 (BMD). A criança nasce aparentemente saudável, com o aparecimento gradual e progressivo dos sintomas desde o primeiro ano de vida. A perda da habilidade de caminhar se dá entre os sete e 12 anos de idade, com sobrevivência rara acima dos 30 anos; e a BMD, de forma mais amena, com os mesmos sintomas aparecendo mais tardiamente. O diagnóstico se baseia nas características clínicas e na investigação genética de deleções e duplicações no gene da distrofina. Um teste preciso ainda é necessário para a identificação de mulheres portadoras. O PCR quantitativo em tempo real seria um bom ensaio para a determinação deste status.O objetivo deste trabalho foi identificar as mulheres portadoras de deleções no gene da distrofina através de PCR quantitativo em tempo real e apresentar informações diagnósticas sobre a população de meninos com DMD/BMD do RS. Informações pertinentes a 123 meninos com diagnostico clínico foram incluídos neste estudo. Após análise dos exames de DNA nos meninos estudados, os exons 47, 48 e 50 se mostraram mais frequentemente deletados na nossa população, confirmando que o segundo "hotspot" gênico é o que mais sofre alterações. Cinco mulheres com filhos com deleções nos exons 45, 47 e 51 foram testadas para estabelecimento do seu status de portadora ou não-portadora. A comparação direta dos exons específicos em relação aos mesmos em outras mulheres, determinou, com uma fácil visualização, a confirmação de três mulheres portadoras e duas não-portadoras, sendo um método preciso e efetivo. É uma abordagem prática e importante para uma utilização em casos de duplicações neste mesmo gene e em outros que necessitem deste tipo de quantificação exata. / Duchenne/Becker Muscular dystrophy (DMD/BMD) is the most frequent neuromuscular disorder in children, affecting one in every 3,500 born male boys (DMD), and one in every 20,000 (BMD). The child is born apparently healthy, with a gradual and progressive appearance of the symptoms during the first year of life. Between the ages of seven to 12, the child demonstrates a loss of the ability to walk, with rare survival above 30 years; and BMD, a milder form, with similar symptoms delayed. The diagnosis is based on the clinical characteristics and a genetic investigation of deletions and duplications in the dystrophin gene. A precise test is still necessary for the identification of carrier women. A quantitative real-time PCR would be a good assay for the determination of this status. The main goals of this study were to identify the carrier women of deletions in the dystrophin gene through the quantitative real-time PCR and to present the diagnostic information available for the population of boys with DMD/BMD in RS. Information pertaining to 123 boys with a clinical diagnosis was included in this study. After the analysis of the boy´s DNA exams, exons 47, 48, and 50 were the most frequently deleted in our population, confirming that the second genetic hospot suffers most of the alterations. Five women that bore children with deletions in exons 45, 47, and 51 were tested for the establishment of their carrier or non-carrier status. A direct comparison of the specific exons to the same ones in other women determined, with an easy visualization, the confirmation of three carrier women and two non-carrier, being a precise and effective method. It is a practical and important approach for the use in cases of duplication in this same gene and in others that may need an exact quantification.

A Distrofia Muscular de Duchenne/Becker (DMD/BMD) é a doença neuromuscular mais freqüente em crianças, afetando uma em cada 3.500 nascidos vivos do sexo masculino (DMD), e um em cada 20.000 (BMD). A criança nasce aparentemente saudável, com o aparecimento gradual e progressivo dos sintomas desde o primeiro ano de vida. A perda da habilidade de caminhar se dá entre os sete e 12 anos de idade, com sobrevivência rara acima dos 30 anos; e a BMD, de forma mais amena, com os mesmos sintomas aparecendo mais tardiamente. O diagnóstico se baseia nas características clínicas e na investigação genética de deleções e duplicações no gene da distrofina. Um teste preciso ainda é necessário para a identificação de mulheres portadoras. O PCR quantitativo em tempo real seria um bom ensaio para a determinação deste status.O objetivo deste trabalho foi identificar as mulheres portadoras de deleções no gene da distrofina através de PCR quantitativo em tempo real e apresentar informações diagnósticas sobre a população de meninos com DMD/BMD do RS. Informações pertinentes a 123 meninos com diagnostico clínico foram incluídos neste estudo. Após análise dos exames de DNA nos meninos estudados, os exons 47, 48 e 50 se mostraram mais frequentemente deletados na nossa população, confirmando que o segundo "hotspot" gênico é o que mais sofre alterações. Cinco mulheres com filhos com deleções nos exons 45, 47 e 51 foram testadas para estabelecimento do seu status de portadora ou não-portadora. A comparação direta dos exons específicos em relação aos mesmos em outras mulheres, determinou, com uma fácil visualização, a confirmação de três mulheres portadoras e duas não-portadoras, sendo um método preciso e efetivo. É uma abordagem prática e importante para uma utilização em casos de duplicações neste mesmo gene e em outros que necessitem deste tipo de quantificação exata. / Duchenne/Becker Muscular dystrophy (DMD/BMD) is the most frequent neuromuscular disorder in children, affecting one in every 3,500 born male boys (DMD), and one in every 20,000 (BMD). The child is born apparently healthy, with a gradual and progressive appearance of the symptoms during the first year of life. Between the ages of seven to 12, the child demonstrates a loss of the ability to walk, with rare survival above 30 years; and BMD, a milder form, with similar symptoms delayed. The diagnosis is based on the clinical characteristics and a genetic investigation of deletions and duplications in the dystrophin gene. A precise test is still necessary for the identification of carrier women. A quantitative real-time PCR would be a good assay for the determination of this status. The main goals of this study were to identify the carrier women of deletions in the dystrophin gene through the quantitative real-time PCR and to present the diagnostic information available for the population of boys with DMD/BMD in RS. Information pertaining to 123 boys with a clinical diagnosis was included in this study. After the analysis of the boy´s DNA exams, exons 47, 48, and 50 were the most frequently deleted in our population, confirming that the second genetic hospot suffers most of the alterations. Five women that bore children with deletions in exons 45, 47, and 51 were tested for the establishment of their carrier or non-carrier status. A direct comparison of the specific exons to the same ones in other women determined, with an easy visualization, the confirmation of three carrier women and two non-carrier, being a precise and effective method. It is a practical and important approach for the use in cases of duplication in this same gene and in others that may need an exact quantification.