Les méthionine sulfoxyde réductases (Msr) sont des enzymes ubiquitaires impliquées dans la résistance au stress oxydant, les processus de vieillissement mais également dans la virulence de certaines bactéries pathogènes. Deux classes de Msr : MsrA et MsrB, structuralement distinctes, catalysent respectivement la réduction des stéréoisomères S et R de la fonction sulfoxyde de la méthionine sulfoxyde selon un même mécanisme catalytique en trois étapes impliquant la formation d’un intermédiaire acide sulfénique suivie de celle d’un pont disulfure intramoléculaire ensuite réduit par la thiorédoxine (Trx). Des études de relation structure-fonction, ont permis 1) de caractériser les résidus du site actif de la MsrB de Neisseria meningitidis (N. meningitidis) impliqués dans la reconnaissance du substrat, et dans la catalyse de l’étape réductase conduisant à la formation de l’intermédiaire acide sulfénique, et de proposer un scénario pour la catalyse de l’étape réductase dans lequel le résidu His 103 joue un rôle majeur de catalyseur acide / base; 2) de caractériser le mécanisme des autres sous-classes de MsrB, qui diffèrent de la sous-classe représentée par la MsrB de N. meningitidis par l’absence de la Cys de régénération en position 63, notamment celui de la MsrB de Xanthomonas campestris, qui possède une Cys de régénération en position 31 située dans une boucle flexible ; et 3) de caractériser la protéine PilB de N. meningitidis, protéine à trois domaines, localisée dans le périplasme portant non seulement les activités MsrA et MsrB mais aussi une activité disulfure oxydoréductase au niveau de son domaine N-terminal dont le rôle est de régénérer les activités Msr. / Ubiquitous enzyme methionine sulfoxide reductases (Msrs) are involved in oxidative stress resistance, aging process but also in bacteria pathogenicity like for Neisseria genius. The two Msrs classes: MsrA and MsrB structural-unrelated catalyze the reduction of the two stereoisomeric forms R and S of the sulfoxide function from the methionine sulfoxide. They share a similar three-step chemical mechanism including formation of a sulfenic acid intermediate following by intramolecular disulfide bond formation, reduced in the last step by the thioredoxin (Trx). The structure function studies are conduced to 1) characterization of active site amino acids involved in substrate recognition and reductase step catalysis leading to sulfenic acid formation in Neisseria meningitidis (N. meningitidis) MsrB, we have proposed a scenario for the reductase step with a major role of the acid / base catalyst His 103 2) characterization of different MsrB sub-classes mechanisms, Xanthomonas campestris MsrB present a Cys 31 located in a flexible loop compare to the Cys 63 from N. meningitidis MsrB also located in a flexible loop, the Mycoplasma pulmonis MsrB don’t posses recycling Cys; and 3) characterization of the N. meningitidis PilB, a three domains protein located in the periplasm, PilB possess MsrA and MsrB activities, and a oxydoreductase activity carried by the N-terminal domain, moreover this domain can reduced the oxidized MsrA and MsrB domains.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les espèces Neisseria gonorrhoeae et Neisseria meningitidis, sont des bactéries pathogènes obligatoires de l'Homme, qui ont acquis différents mécanismes de défense pour détecter et combattre le stress oxydant généré par les mécanismes de défense de l'hôte lors de l'infection. La protéine PilB périplasmique, ferait partie de ces mécanismes et serait de ce fait associée à leur pathogénicité. PilB est composée de trois domaines : un domaine N-terminal (Nter) à activité disulfure oxydoréductase, et les domaines central et C-terminal à activité Méthionine Sulfoxyde Réductase (Msr) respectivement de classe A et B. L'étude des domaines isolés de PilB avait montré que le domaine Nter réduit sélectivement le domaine MsrB. Par ailleurs, le domaine Nter présente un repliement de type DsbE. Les DsbE sont des disulfure oxydoréductases périplasmiques impliquées dans la maturation des cytochromes c. En particulier, la DsbE1 de N. meningitidis a été identifiée par le Dr Adeline Gand lors de son doctorat.Lors de ma thèse, l'étude des protéines PilB de N. meningitidis et de Fusobacterium nucleatum m'a permis de montrer que : 1) la sélectivité de réduction du domaine Nter pour le domaine MsrB n'est pas conservée, 2) la sélectivité de réduction des domaines Nter observée sur les domaines isolés n'est pas retrouvée sur les PilB entiers ; et 3) dans tous les PilB, la réduction du domaine MsrB par le domaine Nter peut se faire selon un mécanisme intramoléculaire. De plus, nous avons étudié in vivo l'effet de la délétion du gène pilB sur la survie d'une souche de N. meningitidis en présence d'agents oxydants. D'autre part, le domaine N-terminal de la protéine DsbD (nDsbD) de N. meningitidis a été identifié comme étant le réducteur périplasmique de PilB et de la DsbE1 de N. meningitidis. Enfin, la caractérisation de l'activité apocytochrome c réductase de la DsbE1 de N. meningitidis a été complétée par des approches in vitro et in vivo chez N. meningitidis / The Neisseria gonorrhoeae and Neisseria meningitidis species are human obligatory pathogenic bacteria, which acquired various defense mechanisms to detect and fight oxidative stress generated by mechanisms of host defense during infection. The periplasmic PilB protein, specific to these bacteria, would be part of such mechanisms and would be associated with their pathogenicity. PilB is composed of three domains: an N-terminal domain (Nter) with disulfide oxidoreductase activity, and central and C-terminal domains with Methionine sulfoxide reductase activity (Msr) of A and B class respectively. The study of isolated domains of PilB showed that the Nter domain selectively reduced MsrB domain. Moreover, this Nter domain presents a DsbE-fold. The DsbE are periplasmic disulfide oxidoreductases involved in the maturation of cytochrome c. In particular, Dr. Adeline Gand identified the DsbE1 from N. meningitidis during his PhD. During my PhD, the study of PilB proteins from N. meningitidis and Fusobacterium nucleatum allowed me to show that: 1) the selective reduction of Nter domain for the MsrB domain is not conserved, 2) the selective reduction of Nter domains observed on the isolated domains is not found in entire PilB, and 3) in all PilB, the MsrB domain reduction by Nter domain could be an intramolecular mechanism. Moreover, we studied the in vivo effect of the pilB gene deletion on the survival of a strain of N. meningitidis in the presence of oxidants. And, the N-terminal domain of DsbD protein (nDsbD) from N. meningitidis was identified as the reducing partner of periplasmic PilB and DsbE1 of N. meningitidis. Finally, the characterization of apocytochrome c reductase activity of DsbE1 N. meningitidis was complemented by in vitro and in vivo approaches in N. meningitidis

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La protéine périplasmique PilB est décrite jouer un rôle in vivo dans la résistance des bactéries pathogènes du genre Neisseria au peroxyde d’hydrogène généré par les macrophages de l’hôte. PilB est composée de trois domaines : un domaine N-terminal (N-ter) à activité disulfure oxydoréductase, un domaine central à activité méthionine sulfoxyde réductase (Msr) de classe A, et un domaine C-terminal à activité Msr de classe B. Les MsrA et MsrB catalysent la réduction des méthionine sulfoxydes (MetSO) incluses dans des protéines, en méthionines (Met). Les deux classes A et B de Msr sont structuralement distinctes et réduisent respectivement l’isomère S et R de la fonction sulfoxyde du substrat. Elles présentent un mécanisme catalytique similaire à trois étapes impliquant la formation d’un intermédiaire acide sulfénique, suivie de celle d’un pont disulfure intramoléculaire, qui est ensuite réduit par la thiorédoxine (Trx) dans le cas des Msr cytoplasmiques et par le domaine N-ter dans le cas des domaines Msr de PilB. Le domaine N-ter présente un repliement de type DsbE. Les DsbE sont des disulfure oxydoréductases périplasmiques impliquées dans la maturation des cytochromes c. Les études réalisées au cours de ma thèse ont permis de caractériser les résidus du site actif de la MsrA de N. meningitidis impliqués dans la reconnaissance du substrat sulfoxyde et la catalyse de l’étape réductase. L’étude des disulfure oxydoréductases périplasmiques de N. meningitidis a également été entreprise afin de caractériser in vitro la DsbE de N. meningitidis et de pouvoir identifier les facteurs structuraux et moléculaires impliqués dans la reconnaissance de leurs cibles et/ou partenaires. / The periplasmic protein PilB is described to be involved in vivo in the resistance of pathogens from Neisseria genus to hydrogen peroxide generated by the host macrophages. PilB is composed of three domains : the N-ter domain (N-ter) that display a disulfure oxidoreductase activity, the central and the C-terminal that display methionine sulfoxide reductase A and B activities. MsrA and MsrB catalyse the reduction of protein bound methionine sulfoxide (MetSO) back to methionine (Met). These two classes of Msr A and B are structurally unrelated and are specific for the reduction of the S and R isomer of the sulfoxide function respectively. They share a similar catalytic mechanism consisting of three steps that involve the formation of a sulfenic acid intermediate followed by the formation of an intramolecular disulfide bond that is then reduced by thioredoxin for cytoplasmic Msrs and by the N-ter domain for the Msrs domain of the PilB protein. The N-ter domain display a DsbE fold. These proteins are periplasmic disulfure oxidoreductases involved in the cytochrome c maturation pathway. The results obtained during my PhD have lead to the characterisation of residues of the actove site of Neisseria meningitidis involved in the recognition of the sulfoxide substrate and in the catalysis of the reductase step. The study of periplasmic disulfure oxidoreductases from N. meningitidis was undertaken in order to characterise in vitro the DsbE from N. meningitidis. The structural and molecular factors involved in the recognition of their targets and/or partners could then be determined.

Les thiol-disulfure oxydoréductases sont des protéines qui jouent un rôle majeur dans la cellule. Elles sont impliquées dans l'activité de nombreuses protéines cytoplasmiques, ainsi que dans la maturation et la stabilité des protéines extracytoplasmiques. Les particularités structurales conservées chez les TDORs, comme le repliement thiorédoxine et le motif CxxC, les propriétés physico-chimiques, leur environnement physiologique et leurs substrats sont autant de facteurs qui influencent la capacité de ces protéines à catalyser préférentiellement la réduction, l'oxydation, ou l'isomérisation des ponts disulfures in vivo.Je me suis intéressée aux TDORs atypiques cytoplasmiques pouvant présenter une activité thiol-oxydase ou disulfure-isomérase dans le cytoplasme des bactéries. J'ai caractérisées deux thiorédoxines atypiques, l'une provenant de l'organisme anaérobie Desulfovibrio vulgaris Hildenborough, Dtrx, et l'autre provenant de la bactérie pathogène Pseudomonas aeruginosa PAO1, PsTrx. Dtrx, possédant une séquence consensus thiol-oxydase CPHC, présente des propriétés in vitro en accord avec cette séquence. Nous avons proposé un mécanisme qui peut être appliqué de façon réversible dans le sens de la réduction et de l'oxydation des cystéines des substrats.PsTrx contient une séquence consensus CGHC dans son site actif, qui est généralement conservée chez PDI, protéine eucaryote. Les propriétés physico-chimiques, et la structure tridimensionnelle déterminées pour PsTrx par RMN, présentent des caractéristiques identiques à celles observées pour le domaine catalytique de PDI. / Thiol/disulfide oxidoreductases catalyze important redox reactions in the cell. They are implicated in the reduction of disulfide bonds in cytoplasm, and disulfide bond formation during folding of secreted proteins. All of the members of this family share the thioredoxin fold and an active site with two conserved cysteine residues that specify the biological activity of the protein in the reduction, oxidation or isomerisation of disulfide bond in vivo.In this work, I have studied atypical cytoplasmic TDORs catalyzing the oxidation or isomerisation of disulfide bond in bacteria. I have characterized two atypical thioredoxin proteins, one from the anaerobe Desulfovibrio vulgaris Hildenborough, Dtrx, and one from the pathogenic Pseudomonas aeruginosa PAO1, PsTrx.Dtrx, with the CPHC active site, presents important activities in the thiol-oxidation of proteins. We proposed a reversible mechanism for the disulfide-reduction or thiol-oxidation of substrate proteins.PsTrx presents the CGHC active site shown in the eukaryote PDI protein. Physico-chemical properties and tridimensional structure solved by NMR are the same that those of the catalytical domain of PDI.This work presents the properties of the two atypical thioredoxins, Dtrx and PsTrx. These proteins have similar functional and structural characteristics in vitro, but probably different redox functions in vivo.

Neisseria meningitidis est le principal agent responsable de méningites bactériennes. Les interactions hôte-pathogène dépendent du repliement correct de nombreuses protéines de surface, qui nécessite souvent la formation de ponts disulfures. Chez les bactéries à Gram-négatif, la synthèse de ces ponts est catalysée par l'oxydoréductase de thiol-disulfure DsbA. N. meningitidis possède trois gènes qui codent pour trois DsbA actives : DsbA1, DsbA2 et DsbA3. DsbA1 et DsbA2 sont des lipoprotéines impliquées dans la virulence alors que DsbA3 est une enzyme soluble périplasmique non reliée à la virulence. Les travaux de cette thèse se rapportent aux caractérisations biochimiques de ces trois enzymes et structurales de DsbA1 et DsbA3. DsbA1 et DsbA3 adoptent le repliement classique de DsbA d'Escherichia coli. La caractéristique la plus étonnante partagée par ces trois enzymes est leur exceptionnel pouvoir oxydant. Avec un potentiel redox de -80 mV, les DsbA de Neisseria sont les enzymes de la famille des thiorédoxines les plus oxydantes connues à ce jour. En accord avec cela, les études de stabilité thermales indiquent que leur forme réduite est extrêmement stable. Pour chacune de ces enzymes, les études montrent que le résidu Thréonine, retrouvé dans la région du site actif, joue un rôle clé dans la détermination de cet extraordinaire pouvoir oxydant. L'ensemble de ces résultats montrent comment des résidus situés en dehors du motif actif CXXC peuvent influencer le potentiel redox de membres de la famille des thiorédoxines. Ils montrent également que le phénotype associé à DsbA3 chez N. meningitidis ne peut être expliqué par une différence d'activité redox ou de structure.

Magnetic resonance imaging has developed into a powerful diagnostic technique characterized by a very high spatial resolution and an inherently relatively low sensitivity. In order to improve the contrast of MRI images, contrast agents are commonly injected into the patients before an examination. These substances are paramagnetic, superparamagnetic, or ferromagnetic compounds that shorten the relaxations times of the water hydrogen atoms. At present, most of the contrast enhanced clinical exams are performed with gadolinium complexes. They are particularly useful as their ability to change the relaxation rate (or relaxivity) can be very high. Several factors have a strong influence on the relaxivity of MRI contrast agents but the water exchange time τm and the rotational correlation time τr are particularly important for obtaining an increased relaxivity. These parameters can be adjusted by suitable chemical modifications of the Gd(III) complexes. For instance, decreasing the tumbling rate by linking a Gd(III) complex to a macromolecule leads to an increased relaxivity. This goal can be achieved through a covalent or a noncovalent linkage with synthetic polymers, particles or biomacromolecules. However, the covalent bonding has a detrimental effect on the clearance of the metal complexes thus exposing the patient to the toxicity of released Gd(III) ions and metabolites. This problem could be circumvented by using covalent links that are cleaved by endogenous biomolecules or after administration of exogenous compounds following the exam. In this context, our approach was to bind Gd(III) chelates to macromolecules through disulfide links as the latter are known to be reduced in vivo by thiols present in the body. Towards this aim, we have developed two bifunctional chelator agents bearing a methanethiosulfonate group (MTS) which reacts specifically with thiols, thus spontaneously establishing a disulfide bond between the Gd(III) chelate and the thiolated macromolecule. The first ligand that we have prepared (MTS-ADO3A) is a monoamide derivative of DOTA with an ethyl-MTS substituent. This compound is relatively easily synthesized but amide arms such as the one it features are known to have a detrimental effect on relaxivity through the lengthening of water exchange times. The conjugate obtained by binding Gd(III) chelates of this ligand to albumin or to polythiolated silica nanoparticles has been studied by nuclear magnetic relaxation dispersion (NMRD),17O NMR and luminescence analyses. These measurements confirm that the method is suitable to increase the relaxivity (20 mM-1s 1, 20 MHz, 25°C) but that this relaxivity increase (of 300%) is limited by a slow water exchange (660 ns). To overcome this limitation, a second ligand called MTS-CyDOTA has been synthesized. This ligand is a DOTA ligand grafted with a cyclohexyl ring featuring a MTS function. The synthesis is more demanding but faster water exchange times are expected because of a more sterically crowded coordination sphere. Moreover, this second ligand has a more rigid structure that could limit the independent rotation of the chelate from the macromolecule. As expected, the water exchange time of the Gd(III) chelate of this ligand (120 ns) is clearly lower than the one determined for Gd MTS-ADO3A. After binding to albumin or to silica nanoparticles a notable relaxivity increase was expected. Unfortunately, if the obtained relaxivity is higher (30 mM-1s 1, 20 MHz, 25°C), its not as high as it could have been expected in view of the size of the conjugate and of the water exchange time of the free chelate. Results obtained in this work suggest that fixation on silica nanoparticles or on albumin drastically decreases the water exchange rate which remains the limiting parameter. This effect has already been reported for Gd(III) chelates linked to albumin by non-covalent bonds and has been assigned to stable layers of water molecules on the macromolecule surface. Thanks to the high loading of the silica nanoparticles (10000 Gd(III) per particle), we have reached very high molecular relaxivities (>200000 mM-1s-1). Stability tests carried out on the disulfide links formed suggest that the small amount of free thiols in the circulation is not sufficient to cause a significant degradation of the disulfide bond in the conjugate within a reasonable length of time. An injection of glutathione would be necessary to achieve a complete degradation. To avoid the problem of water exchange lenghtening, we propose to increase the distance between Gd(III) chelates and macromolecules without loss of rigidity by developing double anchor chelates with substituents grafted on the side of the ring. Considerable synthetic efforts have devoted to the synthesis of such a system and are discussed in chapter VI. At present, this work is still in progress in the laboratory and recent results suggest that it should be possible to evaluate this double arms system in a near future. On the fringe of this synthesis, we present a relaxometric study on the interaction between HSA and a hydrophobic Gd(III) chelate obtained during the preparation of our double anchor chelate. Finally, a chapter of this work is devoted to the study of two compounds, phenEDTA and phenDTPA, which are ditopic chelates featuring a dihydro-1,10-phenanthroline unit that spontaneously self-assemble in the presence of a transition metal ion. The tris-complex generated by this process rotates more slowly in solution and thus presents an increased relaxivity (+130%). As part of this work, we have determined by potentiometric titration the acidity constants of phenEDTA and its stability constant with Gd(III). Moreover, the protonation scheme of this ligand has been studied by NMR titration. The particular behavior of Gd phenDTPA and Fe(Gd phenDTPA)3 in the presence of Zn(II) has also been studied by relaxometry, luminescence and EXAFS.

Une des sources d'énergie les plus abondantes est le soleil, d'où l'importance de développer des techniques efficaces pour convertir les rayons solaires en électricité. Plusieurs dispositifs peuvent être employés, dont les cellules photovoltaïques électrochimiques (CPE). Le fonctionnement de certains types de CPE repose sur une jonction entre un semi-conducteur de type n et un électrolyte gel. Le semi-conducteur, une des composantes majeures des CPE, peut être amélioré. Dans ce travail, il est question du développement d'une nouvelle méthode de préparation du semi-conducteur CulnS₂ en couche mince. Elle consiste à électrodéposer galvanostatiquement le film sur un substrat de titane. L'optimisation de la méthode inclut le choix du courant de déposition, de la méthode de recuit et du traitement chimique au KCN. Le courant de déposition a été optimisé à -40 mA, menant à des films homogènes possédant des pourcentages de CulnS₂ et de cristallinité intéressants. Un recuit sous vide à 425°C permet d'obtenir des films plus cristallins, pratiquement non-oxydés et plus purs. Enfin, un traitement chimique au KCN 0,25 M à température pièce pendant environ 10 secondes, qui permet de diminuer la quantité de cuivre dans les films, a donné les meilleurs résultats. La structure du CulnS₂ a été définie comme étant tétragonale chalcopyrite avec des paramètres de maille de 5,549 Å pour a et b, et de 11,02 Å pour c. Le facteur de rugosité moyen des films est de 19 avant traitement chimique et de 13 après traitement au KCN, avec une épaisseur moyenne de 4,2 µm. La valeur de la bande interdite a été déterminée à 1,51 eV, ce qui est comparable à la théorie. Pour les films ayant subi un traitement au KCN, une densité de porteurs de charge majoritaires de 3,8x10¹⁹ cm⁻³ a été calculée, ainsi qu'un potentiel de bandes plates de -0,45 V vs ENH. Deux piles de configuration n-CuInS₂ | PVdF (20% massique) / DMF/DMSO (60%/40% volumique), CsT 1,3 M/T₂ 0,13 M (80 % massique) | ITO ont été caractérisées dans l'obscurité. PVdF représente le polyvinylidène de fluor, CsT le 5-mercapto-1-méthyltétrazolate de césium et T₂ son disulfure. Une semi-conductivité de type n a été observée, comme attendue, avec un facteur de rectification de 2,82 (à 0,5 V) lorsque le CuInS₂ était traité au KCN. La densité de courant d'échange a été calculée à 2,7 µA/cm₂, la résistance shunt à 46 kΩ et la constante d'idéalité à 2,6 pour la même cellule. Les résultats montrent que les films ayant subi un traitement au KCN présentent une interface CulnS₂/électrolyte gel de meilleure qualité. Les films semi-conducteurs préparés dans ce projet semblent améliorer la qualité de cette interface par rapport aux films obtenus par électrodéposition potentiostatique. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Semi-conducteur, CuInS₂, pile solaire, électrodéposition galvanostatique.

Un revêtement photoréparable à base de 4 constituants, dont de l’huile de lin époxydée et du disulfure de 4,4’-diphényldiamine, a été élaboré via une réaction époxy/amine selon un procédé en deux étapes. Le caractère photoréparable est assuré par la présence de ponts disulfures qui, sous irradiation UV, peuvent être photolysés de manière réversible. Le revêtement obtenu renferme environ 46% en masse de composés biosourcés et 24% en masse de molécules photosensibles. Comparé à un matériau homologue sans pont disulfure, ce revêtement présente une densité de réticulation plus faible et un allongement à la rupture plus élevé. Une réparation significative d’un endommagement de 100 μm de profondeur a pu être réalisée. Un recouvrement de 42% de l’allongement à la rupture a ainsi été observé en seulement 3h d’irradiation UV a 100°C. / A biobased photohealing coating has been developed from 4 components, including epoxidized linseed oil and 4,4’- diphenyldiamine disulfide. The process has been carried out in two steps via an epoxy/amine reaction. The photohealing character is ensured by the presence of disulfide bridges which, under UV irradiation, can be photolyzed reversibly. The obtained coating contains about 46 wt-% of biobased compounds and 24 wt-% of photosensitive molecules. Compared to an analogous material without disulfide bond, the coating exhibits a lower crosslinking density and a higher fracture elongation.A significant repair of a 100 μm depth scratch has been occurred. An increase of 42% of tensile strength has been observed in only 3 hours of UV irradiation at 100°C.