Influenza A is one of the most prevalent and significant viral infections worldwide, resulting in annual epidemics and occasional pandemics. Upon infection, antiviral drugs targeting the neuraminidase protein and M2 protein are the only treatment options available. However, the emergence of antiviral drug resistance is concerning, therefore the aim of this work was to identify inhibitor molecules that may bind to highly conserved regions of selected internal influenza A proteins. Sequences of the non-structural protein 1 (NS1), nuclear export protein (NEP) and polymerase basic protein 2 (PB2) from all hosts and subtypes were aligned and the degree of amino acid conservation was calculated based on Valdar's scoring method. Missing parts of the experimental structures were predicted using the I-TASSER server and ligand binding hot spots were identified with computational solvent mapping. Selected binding sites in conserved regions were subjected to virtual screening against two compound libraries using AutoDock Vina and AutoDock 4. Two out of twelve top hit compounds predicted to target the NS1 protein showed capability of reducing influenza A H1N1 replication in plaque reduction assays at concentrations below 100 μM, although the target protein and mechanism of action could not be confirmed. For the NEP, conservation analysis was based on 3000 sequences and binding hot spots were located in common areas amongst three structures. Docking results revealed predicted binding affinities of up to -8.95 kcal/mol, and conserved amino acid residues interacting with top compounds include Arg42, Asp43, Lys39, Ile80, Gln101, Leu105, and Val109. For the PB2 protein, conservation analysis was based on ~12,000 sequences and fifteen potential binding hot spots were identified. Docking results revealed predicted binding affinities of up to -10.3 kcal/mol, with top molecules interacting with the highly conserved residues Gln138, Gly222, Ile539, Asn540, Gly541, Tyr531 and Thr530. The findings from this research could provide starting points for in vitro experiments, as well as the development of antiviral drugs that function to inhibit influenza A replication without leading to resistance.

A method of estimating the relative position and orientation of a known target satellite is presented, using only passive imagery. Such a method is intended as a prelude to a system required in future autonomous satellite docking missions. Using a single monocular image, and utilising knowledge of the target spacecraft, estimation of the target's six relative rotation and translation parameters with respect to the camera are found. Pose estimation is divided into modular sections. Each frame is processed to detect the major lines in the image, and correspondence information between detected lines and a-priori target information is estimated, resulting in a list of line-to-model correspondences. This correspondence information is used to estimate the pose of the target required to produce such a correspondence list. Multiple possible pose estimates are generated and tested, where each estimate contains the three rotation and translation parameters. The best estimates go through to the least-squares minimisation phase, which reduces estimation error and provides statistical information for multi-frame filtering. The final estimate vector and covariance matrix is the end result for each frame. Estimates of the target location over time allow the relative orbit parameters of the target to be estimated. Location estimates are filtered to fit an orbit model based on Hill's Equations, and statistical information gathered with each estimate is including in the filter process when estimating the orbit parameters. These orbit parameters allow prediction of the target location with time, which will enable mission planning and safety analysis of potential orbit manoeuvres in close proximity to the target. Testing is carried out by a detailed simulation system, which renders accurate images of the target satellite given the true pose of the target with respect to the inertial reference frame. The rendering software used takes into account lighting conditions, reflections, shadowing, specularity, and other considerations, and further post-processing is involved to produce a realistic image. Target position over time is modelled on orbit dynamics with respect to a defined inertial frame. Transformation between inertial, target, and camera frames of reference are dealt with, to transform a rotating target in the inertial frame to the apparent rotation in the camera frame.

El bioetanol es un combustible complementario a las gasolinas, producido mediante fermentación de azúcares simples derivados de sacarosa, almidón o celulosa. Debido a su gran abundancia el material celulósico es particularmente atractivo como fuente de combustible. La hidrólisis de la celulosa puede realizase utilizando métodos químicos (ácidos o bases) o enzimáticos. La hidrólisis enzimática genera productos más puros y consume menos energía; sin embargo, debido a su bajo rendimiento se requiere usar grandes cantidades de enzima, lo cual eleva considerablemente los costos de producción. Las endoglucanasas son glicosil hidrolasas que rompen enlaces β-1,4 en polímeros de glucosa. Actúan sobre enlaces internos de la celulosa amorfa generando su despolimerización. La estructura de las celulasas incluye un módulo catalítico, unido a un dominio que actúa como centro de anclaje a la celulosa, por lo que se le ha denominado Modulo de Unión a Carbohidrato (CBM por su sigla en Inglés). Estudios previos han demostrado que una alta afinidad a celulosa se correlaciona con un aumento en la hidrólisis de ésta. En el presente trabajo se proponen mutaciones en el CBM de la endo β-1,4 glucanasa de Trametes versicolor (TvEG), que aumenten la adsorción de la enzima sobre celulosa, buscando de este modo aumentar la hidrólisis de ésta. Se generó un modelo tridimensional del CBM de la endoglucanasa de T. versicolor mediante modelación comparativa. La estructura obtenida está formada por tres hojas beta antiparalelas unidas entre sí mediante dos puentes disulfuro. El modelo generado se utilizó para llevar a cabo estudios de Docking Molecular, para identificar regiones de interacción celulosa–CBM. Usando los resultados de la simulación computacional de la interacción CBM-celulosa, se identificaron dos zonas de unión. La primera concuerda con la reportada previamente para CBM’s de la familia I, mientras que no existen reportes en la literatura sobre interacción de la celulosa con la segunda zona identificada. A continuación se simuló mediante Docking Molecular, la interacción de celulosa con variantes de CBM que contenían diferentes aminoácidos en las posiciones clave de la segunda zona de interacción; los valores de energía libre de unión entregados por la simulación permitieron sugerir tres variantes de secuencia de CBM. Las variantes seleccionadas fueron: variante 1 (G7Y, F10W), variante 2 (G7Y, F10W, G12Q) y variante 3 (G7Y, G9Q, F10W, G12Q), donde G es glicina, Y tirosina, F fenilalanina, W triptófano y Q glutamina. Se generó un sistema de expresión recombinante de TvEG mediante clonamiento del gen silvestre de la enzima en el vector pET22b(+) y transformación en E. coli BL21(DE3); la proteína se acumuló intracelularmente en forma activa. Las mutaciones planteadas fueron construidas exitosamente mediante mutagénesis sitio dirigida, utilizando la metodología de mutación por extensión de superposición. De esta forma, se deja planteado un sistema de expresión recombinante de las variantes construidas, de modo de en el futuro cuantificar experimentalmente la adsorción de los CBM mutados y validar los resultados del análisis realizado in sílico. Se concluye que la estrategia utilizada permitió simular apropiadamente la interacción CBM-celulosa. Los resultados permitieron proponer en base a los estudios de DM, una estrategia de doble anclaje del CBM a celulosa, que si bien es cierto debe ser comprobado experimentalmente, resulta ser novedoso. Además, permitió proponer variantes del CBM de TvEG que potencialmente se adsorberán con mayor afinidad sobre celulosa. Si bien estas mutaciones deben ser validadas experimentalmente, fueron planteadas a partir de un diseño racional lo que aumentaría la probabilidad que éstas presenten mayor afinidad a celulosa.

Lors de la conception de médicaments, le criblage in silico est de plus en plus utilisé et lesméthodes disponibles nécessitent d'être évaluées. L'évaluation de 8 méthodes a mis enévidence l'efficacité des méthodes de criblage in silico et des problèmes de construction de labanque d'évaluation de référence (DUD), la conformation choisie pour les sites de liaisonn'étant pas toujours adaptée à tous les actifs. La puissance informatique actuelle le permettant,plusieurs structures expérimentales ont été choisies pour tenter de mimer la flexibilité dessites de liaison. Un autre problème a été mis en évidence : les métriques d'évaluation desméthodes souffrent de biais. De nouvelles métriques ont donc été proposées, telles queBEDROC et RIE. Une autre alternative est proposée ici, mesurant la capacité prédictive d'uneméthode en actifs. Enfin, une petite molécule active sur le TNFα in vitro et in vivo sur souris aété identifiée par un protocole de criblage in silico. Ainsi, malgré le besoin d'amélioration desméthodes, le criblage in silico peut être d'un important soutien à l'identification de nouvellesmolécules a visée thérapeutique. / Since the introduction of virtual screening in the drug discovery process, the number ofvirtual screening methods has been increasing and available methods have to be evaluated.In this work, eight virtual screening methods were evaluated in the DUD database, showingadequate efficiency. This also revealed some shortcomings of the DUD database as thebinding site conformation used in the DUD was not relevant for all the actives.As computational power now permits to address this issue, classical docking runs have beenperformed on several X-ray structures, used to represent the binding site flexibility. This alsorevealed that evaluation metrics show some biases. New evaluation metrics have thus beenproposed, e.g. BEDROC and RIE. An alternative method was also proposed usingpredictiveness curves, based on compound activity probabilityFinally, a virtual screening procedure has been applied to TNFa. A small molecule inhibitor,showing in vitro and in vivo activity in mice, has been identified. This demonstrated the valueof virtual screening for the drug discovery process, although virtual screening methods needto be improved.

SILVA, Ivanice Bezerra da. Caracterização estrutural de uma lectina nociceptiva obtida de sementes da espécie Platypodium elegans VOG. 2017. 107 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia de Recursos Naturais)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Coordenação PPGBiotec (ppgbiotec@ufc.br) on 2017-07-06T13:55:40Z No. of bitstreams: 1 2017_tese_ibsilva.pdf: 8919593 bytes, checksum: 5e3941a217f457be112ce0eb7b62a98c (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-07-10T20:10:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_tese_ibsilva.pdf: 8919593 bytes, checksum: 5e3941a217f457be112ce0eb7b62a98c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-10T20:10:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_tese_ibsilva.pdf: 8919593 bytes, checksum: 5e3941a217f457be112ce0eb7b62a98c (MD5) Previous issue date: 2017 / A native lectin (nPELa), purified from seeds of the species Platypodium elegans, Dalbergieae tribes, was crystallized and structurally characterized by methodologies such as X-ray diffraction crystallography and bioinformatics tools. The obtained crystals (of orthorhombic type) were diffracted with quality and nPELa structure was solved with excellence through molecular substitution, with resolution of 1.6 Å. The nPELa monomer showed an N-glycosylation site at the Asn119 residue, therefore, confirming the literature prediction. In addition, nPELa has a metal binding site and a conserved carbohydrate recognition domain, in a similar way to what was shown by other Dalbergieae tribe lectins, such as PAL (Pterocarpus angolensis) and CTL (Centrolobium tomentosum). As molecular docking analysis suggests high affinity of this lectin for different mannosides, mainly trimanosides, formed by α-1,3 or α-1,6 glycosidic bond, as evidenced by the obtained scores. In addition, molecular dynamics simulations were performed as a way of demonstrating the structural behavior of nPELa in aqueous solution, as isolated lectin or associated with specific ligands. The results demonstrated a high stability of nPELa in solution, and structural modifications presented at its carbohydrate recognition site allow the interaction between the lectin and the different ligands tested. Different modifications were observed during simulations for each one of the glycans tested, which included different number of hydrogen bonds and hydrophobic interactions, through changes in residues involved. In addition, nPELa was evaluated for its nociceptive activity in rats and was reported as a first lectin of the Dalbergieae tribe which exhibited hypernociceptive activity in a manner dependent on the carbohydrate recognition site. / Uma lectina nativa (nPELa), purificada a partir de sementes da espécie Platypodium elegans, tribo Dalbergieae, foi cristalizada e estruturalmente caracterizada, através de metodologias como a cristalografia por difração de raios X e ferramentas de bioinformática. Os cristais obtidos (do tipo ortorrômbico) foram difratados com qualidade e a estrutura de nPELa foi resolvida com excelência através de substituição molecular, em uma resolução de 1,6 Å. O monômero de nPELa apresentou um sítio de N-glicosilação no resíduo Asn119, assim confirmando a predição da literatura, antes baseada apenas em dados de sequência primária. Além deste, nPELa apresenta um sítio de ligação a metais e um domínio de reconhecimento a carboidratos conservados, semelhantes ao demonstrado para outras lectinas da tribo Dalbergieae, como PAL (Pterocarpus angolensis) e CTL (Centrolobium tomentosum). As análises de docking molecular sugerem a alta afinidade desta lectina por diferentes manosídeos, principalmente trimanosídeos, formados por ligações do tipo α-1,3 ou α-1,6, evidenciado através dos escores obtidos. Além disso, simulações de dinâmica molecular foram realizadas, como forma de demonstrar o comportamento estrutural de nPELa em solução aquosa, sendo a lectina isolada ou associada a ligantes específicos. Os resultados obtidos demonstraram a alta estabilidade de nPELa em solução e as modificações estruturais apresentadas em seu sítio de reconhecimento a carboidratos permitem a interação entre a lectina e os diferentes ligantes testados. Diferentes modificações foram observadas durante as simulações para cada um dos glicanos testados, que incluíram variações no número de pontes de hidrogênio e interações hidrofóbicas, através de mudanças nos resíduos envolvidos. Além disso, nPELa foi avaliada quanto a sua ação nociceptiva em ratos, sendo relatada como a primeira lectina da tribo Dalbergieae que apresentou atividade hipernociceptiva, de uma maneira dependente do sítio de reconhecimento a carboidratos.

Made available in DSpace on 2016-08-29T15:35:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_6737_Maicon Delarmelina.pdf: 47315 bytes, checksum: 71d6ef49e51bffadf876359d21c01ed0 (MD5) Previous issue date: 2013-08-30 / O câncer é uma das doenças que mais causam temor na sociedade, por ter se tornado um estigma de mortalidade e dor. Estatisticamente, em pesquisa realizada pela Organização Mundial de Saúde (WHO), o câncer é a segunda causa de óbitos no mundo com 13%, matando cerca de 6,0 milhões de pessoas por ano. Acredita-se que em 2015 o câncer seja responsável por 9 milhões de mortes no mundo. Os avanços verificados nas últimas décadas, na área da quimioterapia antineoplásica, têm facilitado consideravelmente a aplicação de outros tipos de tratamento de câncer e permitido maior número de curas. Entretanto, muitos tipos de câncer são intrinsecamente resistentes a quimioterápicos, enquanto outros inicialmente respondem ao tratamento, porém adquirem resistência aos fármacos. A resistência múltipla ao fármaco (MDR), o quadro mais grave, ocorre quando culturas de células in vitro e in vivo mostram resistência simultânea a diferentes fármacos. Portanto, apesar do grande número de compostos que compõem o arsenal quimioterápico de combate ao câncer, o problema de resistência requer a busca constante por novos fármacos eficazes no combate ao câncer, doença que afeta milhões de pessoas. Em estudos farmacológicos com diversas quinonas foi evidenciado que esta classe de substância mostram variadas atividades farmacodinâmicas, dentre elas, as propriedades citotóxicas e inibidoras de sistemas celulares reparadores, processos nos quais atuam de diferentes formas. Como exemplo, destaca-se o estresse oxidativo que provocam ao induzirem a formação deletéria endógena de espécies bioativas derivadas do oxigênio (ROS). Outra atividade marcante destas substâncias, descoberta recentemente, é a inibição da enzima topoisomerase II, ação que provoca o desencadeamento da apoptose celular. Neste trabalho foram sintetizados em rendimentos que variaram de 52 a 89% onze derivados 1,4-naftoquinônicos contendo grupos oxigenados, nitrogenados e sulfurados nas posições 2 e/ou 3 do núcleo naftoquinônico. Posteriormente estes compostos tiveram as suas citotoxidades avaliadas nas linhagens de câncer humano de pulmão (H460), mama triplo-negativo (MDA-MB-231) e ovário (A2780). Os compostos 25f e 44, 25c e 44, e 25g e 44 apresentaram uma significativa atividade anticâncer in vitro para as linhagens de câncer de pulmão H460, mama triplo-negativos MDA-MB-231 e ovário A2780, respectivamente, demostrando um grande potencial como compostos protótipos para o desenvolvimento de novos agentes antineoplásicos. Efetuou-se também estudos de docking dos quatro compostos mais ativos com os alvos terapêuticos PI3K e topoisomerase II. Os estudos mostraram que um possível alvo terapêutico das subtâncias sintetizadas é a enzima topoisomerase II, resultado das interações estabilizadoras observadas no complexo enzima/ligante. / Cancer is one of the most feared disease in society, which have become a stigma of death and pain. Statistically, a survey conducted by the World Health Organization (WHO), cancer is the second cause of death in the world with 13%, killing about 6.0 million people per year. It is believed that in 2015 cancer will be responsible for over 9 million deaths worldwide. The advances achieved in recent decades in cancer chemotherapy research have greatly facilitated the implementation of other types of cancer treatment and allowed a greater number of cures. However, many cancers are intrinsically resistant to chemotherapy, while others respond to initial treatment, but it acquires drug resistance. The multiple drug resistance (MDR), the most severe case, occurs when in vitro and in vivo cell cultures show simultaneous resistance to different drugs. Therefore, despite the large number of compounds that make up the arsenal of anti-cancer chemotherapy, the resistance problem requires a constant search for effective new drugs in fighting cancer, a disease that affects millions of people. In pharmacological studies with various quinones was evidenced that these substances show different pharmacodynamic activities, among them, cytotoxic properties and inhibiting cellular systems repairers, processes in which they act in different ways. As an example, there is oxidative stress that cause deleterious by inducing formation of endogenous bioactive oxygen species derived (ROS). Another remarkable activity of these substances, recently discovered, is the inhibition of the enzyme topoisomerase II, an action that triggers the onset of cellular apoptosis. In this work were synthesized eleven 1,4-naphthoquinone derivatives containing functional groups, nitrogen and sulfur in positions 2 and/or 3 naphthoquinone core in yields ranging 52-89%. Subsequently these compounds had their cytotoxicity evaluated in strains of human lung cancer (H460), triple-negative breast (MDA-MB- 231) and ovarian (A2780). Compounds 25f and 44, 44 and 25c, and 25g and 44 showed a significant anticancer in vitro activity for the strains of lung cancer H460, triple-negative breast MDA-MB-231 and ovarian A2780, respectively, showing a great potential as lead compounds for the development of new anticancer agents. Docking studies of the four most active compounds with therapeutic targets PI3K and topoisomerase II were performed. Those studies have shown that a 16 possible therapeutic target of synthesized compounds is topoisomerase II enzyme because of the observed enzyme/binder complex stabilizing interactions.

Orientador: Fátima Pereira de Souza / Banca: Karina Alves de Toledo / Banca: Tereza Cristina Cardoso / Resumo: As infecções respiratórias agudas (IRAs) constituem a principal causa de mortalidade infantil no mundo, e o Vírus Respiratório Sincicial Humano (hRSV - Human Respiratory Syncytial Virus) é um dos principais agentes etiológicos das IRAs. Este vírus pertencente à família Paramyxoviridae, é envelopado, de simetria helicoidal, cujo genoma é RNA de fita simples não segmentada. A infectividade do vírus está relacionada com suas proteínas de membrana e dentre elas a glicoproteína G, que é responsável pela ligação do vírus à célula hospedeira e conseqüente instalação da infecção. Esta glicoproteína exerce um importante papel como antígeno de reconhecimento, sendo alvo para identificação do RSV através de anticorpos. Existem evidências de que esta proteína se liga a receptores glicosilados na célula hospedeira, porém ainda não foi descrito um receptor para a proteína G na célula. Para elucidar estes mecanismos de interação, foram realizados estudos experimentais e teóricos desta proteína. Os domínios solúveis da região N-terminal (1 a 38 aa) e C-terminal (67 a 298 aa), com 231 aminoácidos da glicoproteína G do hRSV foram clonados e a região N-terminal foi expressa em bactéria BL21 pLysS. Em paralelo, foi realizada a caracterização teórica desta proteína, e foram avaliados os possíveis sítios de interação da mesma com glicosaminoglicanos (heparina). Foram obtidos dois modelos teóricos para a proteína G do hRSV, bem como dois modelos de interação com heparina, determinando portanto, um possível sítio de ocorrência de interação. O conhecimento da estrutura da proteína G é de grande importância para elucidar a composição da estrutura e os mecanismos de interação com potenciais ligantes e deste modo, em um passo posterior, propor mecanismos de reconhecimento celular pelo hRSV, através de glicosaminoglicanos / Abstract: Acute Respiratory Infections (ARI) are the leading cause of infant mortality in the world, and the Human Respiratory Syncytial Virus (hRSV) is one of the main agents of ARI. This virus belongs to Paramyxoviridae family, has a lipidic envelope, helical symmetry and its genome is a single-stranded RNA. The viral infectivity is related to its membrane proteins and among them the G glycoprotein, which is responsible for binding the virus to the host cell and consequent infection. This glycoprotein plays an important role as antigen recognition, being the target for hRSV identification through antibodies. There are evidences that this protein binds to host cell glycosylated receptors, but it has not been described a receptor for G protein in the cell yet. To elucidate these interaction mechanisms and understand the process of viral infectivity, we performed experimental and theoretical studies of this protein. The soluble domains of the N-terminal (1-38 aa) and C-terminal regions (67-298 aa), with 231 amino acids of the hRSV G glycoprotein have been cloned and the N-terminal region was expressed in BL21 pLysS bacteria. In a later trial these peptides will be purified and biophysical tests will be done. It was also performed a theoretical characterization of this protein, to assess the possible interaction sites with glycosaminoglycan (heparin). It were obtained two theoretical models for the hRSV G protein as well as two interaction models with heparin, in order to determine a possible site of occurrence of interaction. Knowledge of G protein structure is of great importance to elucidate the mechanism of viral infectivity and interaction mechanisms with potential ligants, and the results obtained in this work will allow us, in a later step, to propose mechanisms of cellular recognition by hRSV through glycosaminoglycans / Mestre

Made available in DSpace on 2018-08-01T21:58:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_12266_Cleverton Oliveira Cavalcanti da Silveira.pdf: 4153296 bytes, checksum: 73bbe4bec7871126b277c19bd8153bb7 (MD5) Previous issue date: 2018-03-15 / Quitosanas têm despertado interesse como excipiente mucoadesivo que aumenta o tempo de residência de fármacos junto às mucosas. A interação com a mucina 2 ao longo do intestino determina o grau de mucoadesão, potencializada com a inserção de substituintes tiolados em sua estrutura. Estudou-se as interações entre a glicoproteína mucina 2 e quitosanas tioladas, ranqueando-as a partir da energia livre de interação complexo receptor-ligante. A ausência de trabalhos in silico no estudo da mucoadesão, e possível desenvolvimento de uma metodologia para esse fim, motivou a investigação realizada a partir do desenvolvimento de um modelo de mucina 2 por modelagem comparativa e threading, dinâmica molecular, docking e MMPBSA. Quando se considerou as interações não ligadas, o ligante N-acetil-cisteína-quitosana (AC-Qui) se equiparou em termos de energia livre de ligação ao hexâmero N-tiobutil-amidina-quitosana (TBA-Qui). A quitosana (Qui) apresentou o segundo melhor ΔG(ligação). Esses resultados mostraram que o grau de mucoadesão das quitosanas tioladas assumiu ordem diversa, quando se consideraram apenas as interações não ligadas, diferente dos resultados experimentais que não permitem uma especificação da natureza da interação envolvida no processo.

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