A proteína hnRNP K é conhecida por seu papel nos múltiplos processos que compõe a expressão gênica, incluindo funções nos estágios de splicing, transcrição e tradução, desempenhadas, principalmente, através da ligação de seus domínios KH a nucleotídeos. A ativação inadequada da hnRNP K tem relação direta com a gênese de alguns tipos de câncer, sobretudo de cabeça e pescoço, mama e colo-retal, evidenciando a mesma como um atrativo alvo molecular para o desenvolvimento de novos fármacos antineoplásicos. Com o auxílio de técnicas in silico, foram identificados dois compostos orgânicos, um derivado de benzimidazol e outro derivado de fenilbenzamida, capazes de impedir a ligação da proteína hnRNP K a oligonucleotídeos in vitro. Aliando as técnicas de docking, campos de interação e dinâmica molecular foi possível sugerir que tais compostos apresentam características estruturais que permitem a realização de interações na fenda de ligação do domínio KH3, principalmente com os resíduos R40 e R59, os quais são considerados chaves no reconhecimento molecular de nucleotídeos. Os derivados de benzimidazol e fenilbenzamida constituem novos compostos de partida na busca de novos antineoplásicos que tem como alvo a proteína hnRNP K. Do ponto de vista de metabolismo e toxicidade, o derivado de fenilbenzamida parece ser mais promissor quando se investiga uma molécula para aplicação terapêutica, uma vez que gerou poucos alertas críticos de toxicidade, ao contrario do derivado de benzimidazol, que apresenta maior potencial genotóxico. Apesar de se ligarem aos domínios KH da hnRNP K e impedir sua complexação a nucelotídeos, ensaios com culturas de células mostraram apenas tênue atividade antitumoral para tais compostos, com maior redução de viabilidade celular, ao redor de 18% a 8,4 M, exibida pelo derivado de fenilbenzamida. Seguindo o princípio do análogo ativo, simulações de triagem virtual na busca de análogos dos ligantes da hnRNP K revelaram 21 novos derivados de benzimidazol ou fenilbenzamida na base de dados EXPRESS-Pick, dos quais 5 foram testados in vitro com a proteína e 3 novos ligantes identificados. Com o intuito de otimizar tais derivados, foram sugeridos in silico substituintes (potenciais bioisósteros) para os anéis dioxopirrolidínicos dos ligantes já identificados, guiando, assim, a futura síntese de novas substâncias com potencial atividade antitumoral. Além disso, o trabalho foi complementado através da proposição de síntese de novos derivados benzoxazepínicos acoplados a purinas, os quais também tem aplicação como antineoplásicos, entretanto por mecanismos que não envolvem a hnRNP K. A grande limitação desses derivados é a presença de um grupo nitro aromático, o qual é reconhecido por sua toxicidade pronunciada. Com o intuito de otimizar tais derivados, foram sugeridos in silico potenciais bioisósteros capazes de substituir o grupo nitro e guiar a síntese e novos derivados com atividade antitumoral e toxicidade reduzida. / hnRNP K protein is known for its role in the multiple processes that compose gene expression, including functions during splicing, transcription and translation, developed, mainly, by the binding of nucleotides to KH domains. Inadequate activation of hnRNP K induces the development of some types of cancer, including head and neck, breast and colorectal. In this way, hnRNP K is an attractive molecular target for antineoplastic drug design. Using in silico strategies, we have identified two organic compounds, a benzimidazole and a phenylbenzamide derivatives, able to prevent the natural binding of nucleotides to hnRNP K in vitro. Applying docking, molecular interaction fields and molecular dynamics simulations it was possible to propose that such compounds present structural characteristics capable to support intermolecular interactions inside KH3 domain binding cleft, mainly with R40 and R59 residues, which are extremely important during molecular recognition of nucleotides by hnRNP K. The benzimidazole and phenylbenzamide derivatives identified are novel lead compounds that can guide the design of new antineoplastic drugs targeting hnRNP K. Considering metabolic and toxicity predictions, the phenylbenzamide seems to be more promising than the benzimidazole derivative as a drug, once the benzimidazole presents genotoxic potential. Although both derivatives prevent the binding of nucleotides to hnRNP K, biological assays with tongue cancer cell lines revealed only a mild antitumoral activity for such compounds. Higher level of cell viability reduction, 18% at 8.4 M, was observed for the phenylbenzamide derivative. Following the similarity principle, virtual screening simulations were made intending to find novel benzimidazole and phenylbenzamide derivatives inside EXPRESS-Pick database. The search revealed 21 compounds, 5 of which were tested in vitro with hnRNP K, where 3 of them were active. Intending to optimize benzimidazole and phenylbenzamide derivatives in order to design more potent chemical entities, we have suggested in silico substituents as potential bioisosteric groups of the dioxopyrrolidine rings of hnRNP K ligands, guiding the future synthesis of novel compounds with enhanced antitumoral activity. Moreover, complementary work proposition was performed through the synthesis of benzoxazepin-purines, which also present antitumoral activity but not through hnRNP K pathway. The major limitation of such derivatives is the presence of a nitro aromatic group, which can be very toxic. 20 potential bioisosteric groups were proposed as fragment candidates to replace the nitro one in order to design novel antitumoral derivatives with reduced toxic potential.

A doença de Chagas é uma doença negligenciada, endêmica, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, parasita intracelular obrigatório, que necessita de seres vivos de duas classes totalmente diferentes (insetos, o mais comum, Triatoma infestans, e mamíferos, como, por exemplo, o homem) para completar seu ciclo. Em 2009, a doença completou 100 anos de conhecimento pela humanidade, no entanto não há motivos para comemoração, uma vez que, apesar de quase totalmente descrita desde sua descoberta por Carlos Chagas, não há um fármaco que seja ativo na fase crônica. Sabendo que a fase aguda é de difícil diagnóstico e devido à ausência de sintomas indicativos, pode-se dizer que a doença de Chagas é praticamente incurável. Os fármacos utilizados na terapêutica, benznidazol e nifurtimox, são os mesmos há várias décadas. É, portanto, imperioso se buscar candidatos a fármacos antichagásicos que possam suprir o arsenal terapêutico altamente escasso da parasitose. O hidroximetilnitrofural (NFOH), derivado sintetizado em nosso laboratório, se mostrou antichagásico promissor, com maior atividade in vitro em relação ao benznidazol, além de ser quatro vezes menos tóxico que o nitrofural, seu precursor. Por outro lado, o bioisosterismo consiste na substituição de elementos ou grupos a fim de se obter melhores propriedades biológicas do fármaco protótipo, caracterizando-se, assim, como forma de modificação molecular. Assim sendo, o objetivo do presente trabalho foi a aplicação de bioisosterismo no anel furânico do NFOH, sintetizando derivados imidazólicos e triazólicos, além do mesmo tipo de modificação molecular na cadeia lateral, através da formação de semicarbazonas e tiossemicarbazonas. Dessa forma, pretendeu-se sintetizar compostos que atuariam sobre o parasita por três diferentes vias: a geração de peróxido de hidrogênio, tóxico por ser dificilmente reduzido pelo parasita, através de reações de oxidorredução mediadas pelo grupo nitro; a inibição da enzima cruzaína (presente somente no Trypanosoma cruzi) e inibição da14-α esterol desmetilase, enzima fundamental na cascata de reações de formação de ergosterol, componente da parede celular do parasita. A síntese dos imidazóis, prevista para ser realizada em cinco ou seis etapas (há possibilidade de realizar em dez etapas através de outra rota), teve duas etapas completadas, com a proteção, utilizando tritila, do nitrogênio 1 do 4-carboxialdeído imidazol e a produção do agente nitrante. Houve problemas na proteção do hidrogênio ligado à carbonila do mesmo composto, necessária para o êxito da nitração ao carbono 2, seguida de reação de acoplamento com a semicarbazona (e tiossemicarbazona) e hidroximetilação. No caso da síntese dos triazóis, também prevista para ser realizada em cinco etapas, concluíram-se duas delas - oxidação do grupo amina a nitro do 3-aminotriazol e hidroximetilação no nitrogênio 1, utilizando formaldeído. A etapa seguinte, de oxidação e formação da carbonila, a fim de permitir reação com semicarbazona, não foi bem-sucedida, uma vez que o composto não se mostrou estável nas condições da reação. Tentativas com diferentes métodos foram realizadas, mas não houve sucesso na formação da carbonila ligada ao nitrogênio 1. Análogos do nitrofural contendo anéis nitrobenzênicos e imidazólicos (sem nitro) foram sintetizados e poderão ser ensaiados no prosseguimento deste trabalho. Através de Modelagem Molecular, realizou-se avaliação comparativa entre a capacidade de redução do grupo nitro dos quatro compostos propostos no projeto em relação aos análogos já sintetizados e conhecidos (contendo anel furânico e tiofênico), além de outros catorze compostos propostos contendo mudanças no anel aromático e na semicarbazona/tiossemicarbazona. Foi possível prever a atividade por um dos mecanismos propostos, que podem estar envolvidos também com toxicidade. Dentre os 22 derivados, o composto imidazólico contendo semicarbazona, que está sendo sintetizado, mostrou-se com maior capacidade de sofrer redução no grupo nitro. Dinâmica molecular associada ao docking foi utilizada como ferramenta a fim de se avaliar o mecanismo de inibição sobre a cruzaína. Assim, selecionaram-se o NFOH, além de outros sete bioisósteros, dentre eles os quatro que foram propostos neste projeto. Após dinâmica molecular de 3 ns, observou-se que a CYS25 da proteína se distanciou da carbonila do NFOH, sugerindo dificuldade ao ataque proposto na literatura para outros compostos contendo esta região da molécula. Estudos adicionais sobre a forma de inibição do NFOH à cruzaína se fazem necessários. / Chagas\' disease is an endemic, neglected disease caused by Trypanosoma cruzi protozoan, which is an intracellular parasite that requires another type of completely different species (insects, the most common, Triatoma infestans and mammals as human being, for example) to complete its cycle. In 2009, this sickness completed 100 years of discovery, however there is no reason for a happy celebration. In spite of being completely described by Carlos Chagas since that time, there is not even one drug that is active in the chronic phase. As the acute phase is very hard to diagnose, and due to the absence of symptoms, nowadays Chagas\' disease is practically incurable. The drugs used in the therapeutics are the same since decades ago, benznidazole and nifurtimox. So, it is peremptory to find new candidates of antichagasic drugs that may supply the scarce of therapeutic options to this parasitosis. Hydroxymethylnitrofurazone (NFOH), which is already synthesized in our laboratory, has shown to be promising antichagasic with higher activity and four times less toxic in vitro when compared to benznidazole, its precursor. On the other hand, bioisosterism is a useful kind of molecular modification that consists of substitution of elements and groups in order to obtain better biological properties of a prototype. Therefore, the aim of this work was the application of bioisosterism in the furan ring of NFOH by synthesizing imidazole and triazole aromatic ring compounds. Bioisosterism is also applied in the side chain, while semicarbazone and thiosemicarbazone compounds were designed for these possessing nitrogen aromatic rings. So, it was attempted to synthesize compounds that are able to kill the parasite by three different ways: generation of hydrogen peroxide by nitro group, which is highly toxic to the parasite that have problems to neutralize it; inhibition of cruzain, a major cysteine-protease that is present in some catalytic ways of the parasite, and inhibition of 14-α sterol demethylase, a fundamental enzyme in the pathway of ergosterol production, which is a cell wall component. In the imidazole synthesis route, two of the five or six steps (there is possibility to achieve in ten steps, by another route), planned were completed, with the trityl protection of the nitrogen 1 of 4-carboxaldehyde imidazole and the nitrating agent was also produced successfully. Some problems were observed in the protection of the hydrogen bound to the same compound carbonyl by ketal production, which is necessary to provide the nitration in the carbon 2, followed by coupling reaction to the semicarbazide or thiosemicarbazide and the hydroxymethylation, which is the last step of synthesis. In the triazole synthesis, which was predicted to be achieved in five steps, only two were also concluded oxidation of the amino group to produce 3-nitrotriazole and hydroxymethilation of the nitrogen 1, using formaldehyde. The next step, oxidation to produce carbonyl, in order to allow reaction with the thio or semicarbazone moiety, was not well succeeded, because this compound was not stable in the reaction conditions. Different methods were tempted, but no success was observed for the carbonyl formation on the nitrogen 1. Nitrofurazone (NF) analogs containing nitrobenzenic and imidazolic nucleus (without nitro presence) were synthesized and now are able to be tested in a possible continuation of this work. By using molecular modeling, a comparative evaluation of the nitro reduction capacity by the nitrocompounds designed in this project related with other bioisosters that were already synthesized by our group have been made, in addition to other selected bioisosters. It was possible to predict the activity of these compounds by one of the proposed mechanisms, which can also be evolved with toxicity. Among the 22 calculated compounds, the imidazole compound with sulfur in the side chain presented higher ability to nitro reduction. Molecular dynamics, associated with docking, was used as a tool in order to evaluate the inhibition mechanism over the cruzain. So, NFOH and seven other bioisosters were chosen. After 3 ns of simulation, it was observed that the CYS 25 residue of the protein was distant to the NFOH carbonyl, suggesting difficulty in the proposed in the literature interaction for other compounds containing the moiety. Additional studies to clarify the inhibition form of NFOH to cruzain are necessary.

A doença de Chagas é uma doença tropical negligenciada de alta prioridade nos programas de pesquisa e desenvolvimento da Organização Mundial da Saúde. Grave problema de saúde pública, é uma das maiores causas de desordens cardíacas em vários países da América Latina. A inexistência de um tratamento satisfatório faz urgente a busca por novas alternativas terapêuticas. Nesse contexto, o objetivo dessa tese de doutorado foi o desenvolvimento de inibidores da enzima cruzaína de Trypanosoma cruzi, alvo molecular validado para a doença de Chagas, utilizando de forma integrada várias estratégias experimentais e computacionais de química medicinal e planejamento de fármacos. Duas classes de inibidores foram utilizadas como compostos líderes: derivados benzimidazólicos e imídicos. Diversas etapas de planejamento, síntese química e avaliação biológica foram realizadas de forma iterativa até que a otimização da potência dos compostos fosse alcançada. Modificações em diversas regiões de cada composto líder foram exploradas, levando ao entendimento de requerimentos de SAR essenciais para a inibição enzimática. O mecanismo de inibição de novas séries de compostos foi determinado. Estudos preliminares de toxicidade, em linhagens celulares e in vivo, mostraram que os compostos apresentam um perfil seguro. Por meio da realização de um estágio de doutorado sanduíche no departamento de metabolismo de fármacos e farmacocinética da empresa farmacêutica norte-america AbbVie, foi realizada a determinação de parâmetros farmacocinéticos dos compostos investigados. Além disso, foi possível a utilização de uma metodologia recentemente implementada na empresa, com foco na otimização de múltiplos parâmetros de um composto teste. Este método foi utilizado para a identificação de candidatos a novos fármacos com um equilíbrio favorável entre potência e parâmetros farmacocinéticos, que são absolutamente essenciais para o desenvolvimento de um novo fármaco eficaz e seguro. Por fim, foi criada uma estratégia mais racional e efetiva para a triagem de candidatos a novos antichagásicos, que apresentem uma combinação otimizada de potência e propriedades de ADME. / Chagas\' disease is considered a high priority neglected tropical disease by the World Health Organization in its research and development programs. It is a serious public health problem, being among the main causes of cardiac disorders in many countries in Latin America. The absence of an effectite treatment makes urgent the pursue of novel therapeutic options. In this way, the goal of this PhD thesis was to develop inhibitors of the enzyme cruzain, the main cysteine protease from Trypanosoma cruzi, a validated target for Chagas\' disease drug discovery. This work involved the combination of experimental and computational approaches in medicinal chemistry and drug design. Two sets of inhibitors were used as lead compounds: benzimidazole and imide derivatives. The design, chemical synthesis and biological evaluation of several compounds were performed iteratively, until the optimization of potency was achieved. Modifications in different regions of each lead compound were explored, making it possible to understand the SAR requirements for enzyme inhibition. The mode of inhibition of the compounds was determined. Preliminary toxicity studies were caried out using cellular lineages and mice, showing that the compounds possess a safe profile. A PhD internship at the department of metabolism and pharmacokinetics at the U.S. pharmaceutical company AbbVie led to the determination and optimization of the pharmacokinetic profile of the inhibitors. Besides, a methodology recently implemented in the company was employed in this work, which aims a multi parametric optimization of the test compounds. This method was used to identify drug candidates with a favorable balance between potency and pharmacokinetic parameters, which are absolutely essential to develop a new, safe and effective drug. Finally, it was created a rational and more effective strategy for the screening of new antichagasic drug candidates, presenting an optimized combinaiton of potency and ADME properties.

Thesis advisor: Evan R. Kantrowitz / A full understanding of an enzyme's catalytic mechanism and a crystal structure representative of its in vivo form are powerful tools in computational drug screening and design. In the case of aspartate transcarbamoylase (ATCase), an allosteric enzyme, the mechanism and allosteric transition are still being explored. The crystallization of the ATCase mutant Asp236 to alanine, a T-state destabilized mutant, in the presence of phosphonoacetamide (PAM) by microdialysis was successful at pH 5.7. The enzyme crystallized in the R-state in the presence of only one substrate analogue. Globally the enzyme had converted to R, but the active site domains are more open than previously observed. Due to the ordered nature of the reaction, the R-state active site exists with a variety of small molecules bound at different times through out the course of the reaction. This structure shows an R-state active site with only one substrate analogue bound, and may therefore represent the R active site after catalysis has occurred and the active site is binding new substrates to perform its reaction again. Docking studies of small molecules can be conducted using this more open, emptier active site as it may be more representative of an in vivo conformation of the enzyme just before catalysis. Additionally, Arg296, previously unobserved as part of the active site, makes a hydrogen bonding interaction with the PAM molecule. The role of this residue will require further investigation. / Thesis (BS) — Boston College, 2005. / Submitted to: Boston College. College of Arts and Sciences. / Discipline: Chemistry. / Discipline: College Honors Program.

A incidência de infecções hospitalares tem aumentado substancialmente, resultando no aumento de morbidade e mortalidade nas últimas décadas. Embora as infecções hospitalares estejam intimamente ligadas à assepsia e à higiene do ambiente nosocomial, não se pode deixar de considerar a susceptibilidade já instaurada dos doentes acometidos por estas infecções. Os avanços tecnológicos relacionados à procedimentos invasivos, diagnósticos ou terapêuticos, ajudaram na disseminação das infecções microbianas. Em decorrência desta evolução, surgiram micro-organismos multirresistentes ao atual arsenal de agentes farmacológicos utilizados rotineiramente na quimioterapia, tornando estas infecções grave problema de Saúde Pública. A necessidade de pesquisar novas alternativas para o combate destes micro-organismos é evidente, sendo que derivados nitro-heterocíclicos apresentam-se como alternativa bastante viável para estudos de novos compostos com potencial atividade antimicrobiana. Baseado nestes fatos o presente trabalho propõe o planejamento, síntese e avaliação da atividade antimicrobiana de derivados tiofilidênicos com estruturas azometínica e oxadiazolínica frente a micro-organismos responsáveis por algumas das principais infecções hospitalares instauradas em hospitais em todo o mundo. A escolha dos grupos substituintes dos compostos planejados foi baseada no digrama de Craig, tendo sido planejado e sintetizados vinte derivados tiofilidênicos, estruturalmente identificados e avaliados quanto à atividade antimicrobiana frente às cepas padrão de Staphylococcus aureus (ATCC 29213) e multirressitente (VISA 3), Escherichia coli (ATCC 25922), Candida albicans (ATCC 573Y), Klebsiella pneumoniae (ATCC 70060), Enterococcus faecalis (ATCC 29212), Enterobacter cloacae (ATCC 23355) e Serratia marcescens (ATCC 14756). Observou-se que os compostos sintetizados apresentaram atividade bastante promissora frente às bactérias Gram positivas (S. aureus ATCC 29213, S. aureus VISA 3 e E. faecalis ATCC 29212) e para o fungo (C. albicans ATCC 573Y), enquanto que para bactérias Gram negativas não foi observado atividade antibacteriana significativa. Estudos de Relação Estrutura Atividade (REA) foram realizados, com objetivo de determinar quais propriedades físico-químicas auxiliam na atividade biológica. Pode-se observar que o equilíbrio lipo-hidrofílico, juntamente com as propriedades eletrônicas, estereoquímicas e topológicas foram as propriedades que contribuíram para a atividade antimicrobiana dos compostos estudados. Revelando esta classe de compostos como promissora opção no delineamento de novos fármacos no combate às infecções hospitalares com caráter de multirresistência. / Incidence of nosocomial infections has increased substantially, resulting in increased morbidity and mortality in recent decades. Although nosocomial infections are closely connected to asepsis and hygiene of the nosocomial environment, one cannot fail to consider the already established susceptibility of patients affected by these infections. Technological progress related to invasive procedures, diagnostic or therapeutic, helped in spreading microbial infections. However, as a consequence of this advancement, microorganisms that are multidrug resistant to the current arsenal of pharmacologic agents used in antibiotic therapy emerged and these infections became a serious public health problem. The need for new alternatives to fight these microorganisms is evident and nitro-heterocyclic derivatives are considered as viable for studies of new compounds with potential antimicrobial activity. Based on those events the present study proposes the design, synthesis and antimicrobial activity of thiophylidene derivatives with azomethine and oxadiazole structures against microorganisms responsible for some of the main nosocomial infections observed in hospitals worldwide. The choice of the substituent groups of compounds was based on the Craig diagram, having been designed and synthesized twenty thiophylidene derivatives, structurally identified and evaluated for antimicrobial activity against the strains standard Staphylococcus aureus (ATCC 29213) and mutiresistant (VISA 3), Escherichia coli (ATCC 25922), Candida albicans (ATCC 573Y), Klebsiella pneumoniae (ATCC 70060), Enterococcus faecalis (ATCC 29212), Enterobacter cloacae (ATCC 23355) and Serratia marcescens (ATCC 14756). It was observed that the synthesized compounds show very promising activity on the Gram positive bacteria (S. aureus ATCC 29213, S. aureus VISA 3 and E. faecalis ATCC 29212) and against the fungus (C. albicans ATCC 573Y), while for Gram negative bacteria significant antibacterial activity was not observed. Structure Activity Relationship (SAR) Studies were performed with the objective of determining which physicochemical properties help in the biological activity. It can be observed that the lipophilic-hydrophilic balance, together with the stereochemistry, electronic and topological properties were contributed to the antimicrobial activity of the studied substances. Revealing this class of compounds as a promising option in designing of new drugs to fight nosocomial infections with multidrug resistance character.

O câncer é umas das principais causas de morte no mundo. Com a falta de critério individual para o tratamento de câncer metastático, a quimioterapia ainda é realizada com fármacos de toxicidade significativa como antraciclinas e taxanos. Portanto, a busca por novos fármacos é de suma importância. Os alquilfosfolipídios constituem uma nova classe de fármacos antineoplásicos, tendo como protótipo a miltefosina, empregada para o tratamento tópico de metástases cutâneas de câncer de mama. No entanto, este fármaco apresenta toxicidade gastrointestinal e ação hemolítica. Neste trabalho, investigou-se a rota sintética da miltefosina, bem como a síntese de novos análogos cicloalquílicos possivelmente menos hemolíticos e menos tóxicos. Para a síntese da miltefosina, 4 etapas foram realizadas: a) obtenção do Dicloreto de fosforoexadecila; b) obtenção de 2-(hexadeciloxi)-3-metil-oxa-1,3,2- oxazofosfolano; c) obtenção do fosfato de 2-(metilamino) etil hexadecila; d) obtenção da miltefosina (hexadecilfosfocolina); sendo o fármaco obtido com sucesso. Em seguida, metodologias de monossubstituição em dióis simétricos foram investigadas para obtenção de ω-hidroxidecil-cicloalquilmetil éteres a serem empregados na rota da miltefosina visando análogos alcoxicicloalquilicos. Diversas tentativas foram empregadas sem sucesso, impedindo-nos de dar continuidade à síntese destes análogos. Partindo-se do reagente cicloexanoetanol e empregando-se a rota de síntese aprimorada da miltefosina, obtivemos o intermediário fosfato de 2-(metilamino)etil cicloexila puro. A última etapa, referente à metilação da amina, resultou em composto dimetilado ao invés do trimetilado esperado. Um ajuste dos parâmetros reacionais como, por exemplo, aumento da concentração dos reagentes de partida, deve resultar no composto planejado. Tanto o intermediário obtido quanto o análogo desejado poderão ser futuramente ensaiados quanto à atividade antitumoral e potencial hemolítico. / Cancer is one of the major causes of death worldwide. Due to the lack of individual standard treatment for metastatic cancer, chemotherapy is still based in the use of significantly toxic drugs like anthracyclines and taxanes. Hence, there is a need to search for new anticancer agents. Alkylphospholipids recently emerged as a new antitumor class and its lead compound, miltefosine, has been used for the topical treatment of cutaneous metastasis in breast cancer. However, this drug exhibits gastrointestinal toxicity and hemolytic activity. We investigated miltefosine synthetic route as well as the synthesis of cycloalkyl analogues possibly less toxic and hemolytic. We started from miltefosine synthesis, which included four steps: a) generation of hexadecyl phosphorodichloridate; b) generation of 2-(hexadecyloxy)-3-methyl-oxo-1,3,2-oxazaphospholane; c) generation of hexadecyl 2-(methylamino) ethyl phosphate; d) production of the final product miltefosine (hexadecylphosphocholine). The route was optimized, resulting in the desired drug. After that, several methods for symmetrical diols monoprotection were investigated aiming at the generation of ω-hydroxydecyl cycloalkylmethyl ethers to be further employed in miltefosine synthetic route aiming at alkoxycycloalkyl analogues. Several attempts were realized however unsuccessfully, preventing us to move on in these analogues synthesis. In a different approach, we started from cyclohexylethanol and, employing the synthetic route of miltefosine, obtained the third intermediate, 2-cyclohexylethyl 2- (methylamino)ethyl phosphate pure. The methylation step, last one to obtain the cycloalkyl analogue, resulted in a dimethyl analogue instead of a trymethyl one. We believe that adjusting the reaction parameters, such as increasing reagents concentrations, should result in a successful methylation step. The intermediate obtained as well as the analogue planned might be future evaluated in terms of hemolytic potential and antitumor activity.

A Doença de Chagas, endêmica na América Latina, é causada pelo parasito tripanossomatídeo Trypanosoma cruzi e atualmente já se espalha para o restante do mundo devido à migração humana. Os dois medicamentos disponíveis para o tratamento dessa doença, o Nifurtimox, (banido do Brasil), e o Benzonidazol, são eficazes somente na etapa aguda da doença e possuem efeitos colaterais severos. Recentemente, três novas substâncias para o tratamento chegaram à fase clínica de testes contra essa doença, mas ainda é necessária a pesquisa de novas moléculas contra esse parasito. A enzima Gliceraldeído-3-fosfato Desidrogenase (GAPDH) foi selecionada como alvo para busca de moléculas potencialmente tripanossomicidas. De forma a inibir essa enzima, a busca de moléculas baseou-se na abordagem de fragmentos moleculares para encontrar substâncias com elevada eficiência de ligante. A partir de um banco de dados comercial de 500 mil moléculas, filtros moleculares de solubilidade e da Regra dos Três foram aplicados para montar uma biblioteca focalizada de moléculas. Essa biblioteca foi submetida a estudos integrados baseados na estrutura do alvo macromolecular (docagem) e do substrato da enzima (similaridade química e eletrostática) e a inspeção visual dos fragmentos bem classificados em ambas técnicas foi realizada de modo a selecionar cinco compostos de classes químicas diversas. Essas substâncias foram submetidas a ensaios enzimáticos in vitro por meio de espectroscopia de fluorescência, sendo encontrado então um fragmento com Ki de (425 ± 53) μM e eficiência de ligante de 0,33, valor bastante promissor para abordagem baseada em fragmentos moleculares. Estudos de simulação por Dinâmica Molecular (MD) foram feitos para as cinco moléculas adquiridas, com energia de interação ligante-enzima calculada usando o método MM-GB/SA. A classificação das moléculas por essa energia foi idêntica à obtida experimentalmente. Além disso, a MD possibilitou a predição de modo de interação dos fragmentos no sítio ativo da TcGAPDH e a identificação de uma nova cavidade passível de modulação de sua atividade. Uma segunda série de fragmentos foi selecionada baseada no fragmento ativo de modo a construir uma relação estrutura-atividade (SAR) teórica por MD. A SAR sugere que a presença de um átomo nitrogênio capaz de doar ligações de hidrogênio é importante para a interação, com o resíduo de aminoácido Asp210. Este resíduo de aminoácido desponta como um possível ponto de seletividade para a enzima humana, que possui uma leucina nessa posição. Além disso, a posição na substituição do anel central também está diretamente relacionada à interação da molécula com a enzima, com uma substituição 2,3 em um anel de cinco membros a mais favorável. Este trabalho identificou pela primeira vez um fragmento molecular com alta eficiência de ligante para a enzima TcGAPDH, com o auxílio do uso conjunto de técnicas baseadas na estrutura do ligante e do alvo, para seleção de moléculas, e espectroscopia de fluorescência para identificação de atividade inibitória frente à enzima. Método de simulação por MD conseguiu reproduzir os resultados experimentais e prover informações teóricas de SAR para o composto ativo. / Chagas disease is a parasitic illness endemic in Latin America caused by the trypanosomatid parasite Trypanosoma cruzi that spreads around the world due to people migration. Nowadays, Benznidazole and Nifurtimox (banned in Brazil), are used for the treatment of this disease but causes severe side effects to patients. Recently, three new molecules have reached clínical trials phase in the development of drugs against Chagas disease but it is still necessary to develop new drugs. In this studies, the enzyme Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase (GAPDH) was used as a target for the search of new antitrypanosomatid molecules. It belongs to the glycolytic pathway, the major one for parasite\'s energy generation. With the aim searching a new molecule that inhibits this enzyme, the fragment-based approach guided the search of molecules with high ligand efficiency. A focused compound library was assembled from a database of 500,000 molecules using molecular and solubility filters and the Rule of Three. The integrated use of ligand (chemical and electrostatic similarity) and target (molecular docking) based drug design was carried out to rank the molecular fragments by a consensual score. Through visual inspection of the top 500 molecules five diverse fragments were selected for the in vitro enzymatic assays using fluorescence spectroscopy. One of these molecules shows a Ki equals to (425 ± 53) μM and ligand efficiency equals to 0,33, a promising value for the fragment-based approach. Additionally, Molecular Dynamics simulations (MD) were carried out with these fragments and the predicted energy of interaction for fragment-enzyme complex was able to rank the molecules as using the experimental results. Furthermore, the MD was useful to predict the mode of interaction of the fragments in the active site of enzyme and to reveal a new cavity close to the substrate binding site. A second generation of compounds was selected based on the structure of the active fragment to construct theoretical structure-activity relationship (SAR) using MD. SAR indicates that the presence of a nitrogen with hydrogen-bond donor property is important to the interaction, making hydrogen-bonding with the amino acid residue Asp210. In addition, MD shows the influence of different substituent posítion in the central ring in the energy of the interaction, with a 2,3 substitution at five-atom ring the most favorable. This study identifies the first molecular fragment with high ligand efficiency for the enzyme TcGAPDH, with the combined use of ligand and target-based tools and fluorescence spectroscopy, for selection and identification of active compounds against the enzyme. MD was able to reproduce experimental results and generate theoretical information of SAR to the active molecular fragment.

A incidência de infecções hospitalares tem aumentado substancialmente, resultando no aumento de morbidade e mortalidade nas últimas décadas. Embora as infecções hospitalares estejam intimamente ligadas à assepsia e à higiene do ambiente nosocomial, não se pode deixar de considerar a susceptibilidade já instaurada dos doentes acometidos por estas infecções. Os avanços tecnológicos relacionados à procedimentos invasivos, diagnósticos ou terapêuticos, ajudaram na disseminação das infecções microbianas. Em decorrência desta evolução, surgiram micro-organismos multirresistentes ao atual arsenal de agentes farmacológicos utilizados rotineiramente na quimioterapia, tornando estas infecções grave problema de Saúde Pública. A necessidade de pesquisar novas alternativas para o combate destes micro-organismos é evidente, sendo que derivados nitro-heterocíclicos apresentam-se como alternativa bastante viável para estudos de novos compostos com potencial atividade antimicrobiana. Baseado nestes fatos o presente trabalho propõe o planejamento, síntese e avaliação da atividade antimicrobiana de derivados tiofilidênicos com estruturas azometínica e oxadiazolínica frente a micro-organismos responsáveis por algumas das principais infecções hospitalares instauradas em hospitais em todo o mundo. A escolha dos grupos substituintes dos compostos planejados foi baseada no digrama de Craig, tendo sido planejado e sintetizados vinte derivados tiofilidênicos, estruturalmente identificados e avaliados quanto à atividade antimicrobiana frente às cepas padrão de Staphylococcus aureus (ATCC 29213) e multirressitente (VISA 3), Escherichia coli (ATCC 25922), Candida albicans (ATCC 573Y), Klebsiella pneumoniae (ATCC 70060), Enterococcus faecalis (ATCC 29212), Enterobacter cloacae (ATCC 23355) e Serratia marcescens (ATCC 14756). Observou-se que os compostos sintetizados apresentaram atividade bastante promissora frente às bactérias Gram positivas (S. aureus ATCC 29213, S. aureus VISA 3 e E. faecalis ATCC 29212) e para o fungo (C. albicans ATCC 573Y), enquanto que para bactérias Gram negativas não foi observado atividade antibacteriana significativa. Estudos de Relação Estrutura Atividade (REA) foram realizados, com objetivo de determinar quais propriedades físico-químicas auxiliam na atividade biológica. Pode-se observar que o equilíbrio lipo-hidrofílico, juntamente com as propriedades eletrônicas, estereoquímicas e topológicas foram as propriedades que contribuíram para a atividade antimicrobiana dos compostos estudados. Revelando esta classe de compostos como promissora opção no delineamento de novos fármacos no combate às infecções hospitalares com caráter de multirresistência. / Incidence of nosocomial infections has increased substantially, resulting in increased morbidity and mortality in recent decades. Although nosocomial infections are closely connected to asepsis and hygiene of the nosocomial environment, one cannot fail to consider the already established susceptibility of patients affected by these infections. Technological progress related to invasive procedures, diagnostic or therapeutic, helped in spreading microbial infections. However, as a consequence of this advancement, microorganisms that are multidrug resistant to the current arsenal of pharmacologic agents used in antibiotic therapy emerged and these infections became a serious public health problem. The need for new alternatives to fight these microorganisms is evident and nitro-heterocyclic derivatives are considered as viable for studies of new compounds with potential antimicrobial activity. Based on those events the present study proposes the design, synthesis and antimicrobial activity of thiophylidene derivatives with azomethine and oxadiazole structures against microorganisms responsible for some of the main nosocomial infections observed in hospitals worldwide. The choice of the substituent groups of compounds was based on the Craig diagram, having been designed and synthesized twenty thiophylidene derivatives, structurally identified and evaluated for antimicrobial activity against the strains standard Staphylococcus aureus (ATCC 29213) and mutiresistant (VISA 3), Escherichia coli (ATCC 25922), Candida albicans (ATCC 573Y), Klebsiella pneumoniae (ATCC 70060), Enterococcus faecalis (ATCC 29212), Enterobacter cloacae (ATCC 23355) and Serratia marcescens (ATCC 14756). It was observed that the synthesized compounds show very promising activity on the Gram positive bacteria (S. aureus ATCC 29213, S. aureus VISA 3 and E. faecalis ATCC 29212) and against the fungus (C. albicans ATCC 573Y), while for Gram negative bacteria significant antibacterial activity was not observed. Structure Activity Relationship (SAR) Studies were performed with the objective of determining which physicochemical properties help in the biological activity. It can be observed that the lipophilic-hydrophilic balance, together with the stereochemistry, electronic and topological properties were contributed to the antimicrobial activity of the studied substances. Revealing this class of compounds as a promising option in designing of new drugs to fight nosocomial infections with multidrug resistance character.

A doença de Chagas é uma doença negligenciada, endêmica, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, parasita intracelular obrigatório, que necessita de seres vivos de duas classes totalmente diferentes (insetos, o mais comum, Triatoma infestans, e mamíferos, como, por exemplo, o homem) para completar seu ciclo. Em 2009, a doença completou 100 anos de conhecimento pela humanidade, no entanto não há motivos para comemoração, uma vez que, apesar de quase totalmente descrita desde sua descoberta por Carlos Chagas, não há um fármaco que seja ativo na fase crônica. Sabendo que a fase aguda é de difícil diagnóstico e devido à ausência de sintomas indicativos, pode-se dizer que a doença de Chagas é praticamente incurável. Os fármacos utilizados na terapêutica, benznidazol e nifurtimox, são os mesmos há várias décadas. É, portanto, imperioso se buscar candidatos a fármacos antichagásicos que possam suprir o arsenal terapêutico altamente escasso da parasitose. O hidroximetilnitrofural (NFOH), derivado sintetizado em nosso laboratório, se mostrou antichagásico promissor, com maior atividade in vitro em relação ao benznidazol, além de ser quatro vezes menos tóxico que o nitrofural, seu precursor. Por outro lado, o bioisosterismo consiste na substituição de elementos ou grupos a fim de se obter melhores propriedades biológicas do fármaco protótipo, caracterizando-se, assim, como forma de modificação molecular. Assim sendo, o objetivo do presente trabalho foi a aplicação de bioisosterismo no anel furânico do NFOH, sintetizando derivados imidazólicos e triazólicos, além do mesmo tipo de modificação molecular na cadeia lateral, através da formação de semicarbazonas e tiossemicarbazonas. Dessa forma, pretendeu-se sintetizar compostos que atuariam sobre o parasita por três diferentes vias: a geração de peróxido de hidrogênio, tóxico por ser dificilmente reduzido pelo parasita, através de reações de oxidorredução mediadas pelo grupo nitro; a inibição da enzima cruzaína (presente somente no Trypanosoma cruzi) e inibição da14-α esterol desmetilase, enzima fundamental na cascata de reações de formação de ergosterol, componente da parede celular do parasita. A síntese dos imidazóis, prevista para ser realizada em cinco ou seis etapas (há possibilidade de realizar em dez etapas através de outra rota), teve duas etapas completadas, com a proteção, utilizando tritila, do nitrogênio 1 do 4-carboxialdeído imidazol e a produção do agente nitrante. Houve problemas na proteção do hidrogênio ligado à carbonila do mesmo composto, necessária para o êxito da nitração ao carbono 2, seguida de reação de acoplamento com a semicarbazona (e tiossemicarbazona) e hidroximetilação. No caso da síntese dos triazóis, também prevista para ser realizada em cinco etapas, concluíram-se duas delas - oxidação do grupo amina a nitro do 3-aminotriazol e hidroximetilação no nitrogênio 1, utilizando formaldeído. A etapa seguinte, de oxidação e formação da carbonila, a fim de permitir reação com semicarbazona, não foi bem-sucedida, uma vez que o composto não se mostrou estável nas condições da reação. Tentativas com diferentes métodos foram realizadas, mas não houve sucesso na formação da carbonila ligada ao nitrogênio 1. Análogos do nitrofural contendo anéis nitrobenzênicos e imidazólicos (sem nitro) foram sintetizados e poderão ser ensaiados no prosseguimento deste trabalho. Através de Modelagem Molecular, realizou-se avaliação comparativa entre a capacidade de redução do grupo nitro dos quatro compostos propostos no projeto em relação aos análogos já sintetizados e conhecidos (contendo anel furânico e tiofênico), além de outros catorze compostos propostos contendo mudanças no anel aromático e na semicarbazona/tiossemicarbazona. Foi possível prever a atividade por um dos mecanismos propostos, que podem estar envolvidos também com toxicidade. Dentre os 22 derivados, o composto imidazólico contendo semicarbazona, que está sendo sintetizado, mostrou-se com maior capacidade de sofrer redução no grupo nitro. Dinâmica molecular associada ao docking foi utilizada como ferramenta a fim de se avaliar o mecanismo de inibição sobre a cruzaína. Assim, selecionaram-se o NFOH, além de outros sete bioisósteros, dentre eles os quatro que foram propostos neste projeto. Após dinâmica molecular de 3 ns, observou-se que a CYS25 da proteína se distanciou da carbonila do NFOH, sugerindo dificuldade ao ataque proposto na literatura para outros compostos contendo esta região da molécula. Estudos adicionais sobre a forma de inibição do NFOH à cruzaína se fazem necessários. / Chagas\' disease is an endemic, neglected disease caused by Trypanosoma cruzi protozoan, which is an intracellular parasite that requires another type of completely different species (insects, the most common, Triatoma infestans and mammals as human being, for example) to complete its cycle. In 2009, this sickness completed 100 years of discovery, however there is no reason for a happy celebration. In spite of being completely described by Carlos Chagas since that time, there is not even one drug that is active in the chronic phase. As the acute phase is very hard to diagnose, and due to the absence of symptoms, nowadays Chagas\' disease is practically incurable. The drugs used in the therapeutics are the same since decades ago, benznidazole and nifurtimox. So, it is peremptory to find new candidates of antichagasic drugs that may supply the scarce of therapeutic options to this parasitosis. Hydroxymethylnitrofurazone (NFOH), which is already synthesized in our laboratory, has shown to be promising antichagasic with higher activity and four times less toxic in vitro when compared to benznidazole, its precursor. On the other hand, bioisosterism is a useful kind of molecular modification that consists of substitution of elements and groups in order to obtain better biological properties of a prototype. Therefore, the aim of this work was the application of bioisosterism in the furan ring of NFOH by synthesizing imidazole and triazole aromatic ring compounds. Bioisosterism is also applied in the side chain, while semicarbazone and thiosemicarbazone compounds were designed for these possessing nitrogen aromatic rings. So, it was attempted to synthesize compounds that are able to kill the parasite by three different ways: generation of hydrogen peroxide by nitro group, which is highly toxic to the parasite that have problems to neutralize it; inhibition of cruzain, a major cysteine-protease that is present in some catalytic ways of the parasite, and inhibition of 14-α sterol demethylase, a fundamental enzyme in the pathway of ergosterol production, which is a cell wall component. In the imidazole synthesis route, two of the five or six steps (there is possibility to achieve in ten steps, by another route), planned were completed, with the trityl protection of the nitrogen 1 of 4-carboxaldehyde imidazole and the nitrating agent was also produced successfully. Some problems were observed in the protection of the hydrogen bound to the same compound carbonyl by ketal production, which is necessary to provide the nitration in the carbon 2, followed by coupling reaction to the semicarbazide or thiosemicarbazide and the hydroxymethylation, which is the last step of synthesis. In the triazole synthesis, which was predicted to be achieved in five steps, only two were also concluded oxidation of the amino group to produce 3-nitrotriazole and hydroxymethilation of the nitrogen 1, using formaldehyde. The next step, oxidation to produce carbonyl, in order to allow reaction with the thio or semicarbazone moiety, was not well succeeded, because this compound was not stable in the reaction conditions. Different methods were tempted, but no success was observed for the carbonyl formation on the nitrogen 1. Nitrofurazone (NF) analogs containing nitrobenzenic and imidazolic nucleus (without nitro presence) were synthesized and now are able to be tested in a possible continuation of this work. By using molecular modeling, a comparative evaluation of the nitro reduction capacity by the nitrocompounds designed in this project related with other bioisosters that were already synthesized by our group have been made, in addition to other selected bioisosters. It was possible to predict the activity of these compounds by one of the proposed mechanisms, which can also be evolved with toxicity. Among the 22 calculated compounds, the imidazole compound with sulfur in the side chain presented higher ability to nitro reduction. Molecular dynamics, associated with docking, was used as a tool in order to evaluate the inhibition mechanism over the cruzain. So, NFOH and seven other bioisosters were chosen. After 3 ns of simulation, it was observed that the CYS 25 residue of the protein was distant to the NFOH carbonyl, suggesting difficulty in the proposed in the literature interaction for other compounds containing the moiety. Additional studies to clarify the inhibition form of NFOH to cruzain are necessary.

A doença de Chagas, uma infecção parasitária amplamente distribuída na América Latina, é um problema grave de saúde pública com consequências devastadoras em termos de morbidade e mortalidade humana. As alternativas terapêuticas existentes são limitadas e insuficientes devido principalmente à baixa eficácia e elevada toxicidade. Visando o planejamento de novos candidatos a agentes antichagásicos, diversas vias bioquímicas e proteínas do parasita são alvos de estudos. A enzima cruzaína, uma cisteíno-protease envolvida em todos os estágios de desenvolvimento e diferenciação do Trypanosoma cruzi, foi selecionada como alvo molecular em nosso grupo para o presente trabalho de dissertação de mestrado. Duas séries de compostos foram avaliadas através de ensaios bioquímicos com a enzima alvo. A primeira série consiste de 14 derivados de chalconas e hidrazonas, sendo que 8 compostos apresentaram atividade inibitória frente a cruzaína, com valores superiores a 70%. Destes, destaca-se a hidrazona 19, que apresentou significativa potência in vitro, com valor de IC50 de 220 nM. A segunda série investigada, formada por 11 compostos selecionados previamente através de triagens virtuais, apresentou interessante perfil inibitório. Nove compostos apresentaram elevada potência, sendo que 7 exibiram valores de IC50 na faixa nanomolar, entre 646 nM (composto 32) e 11,3 nM (composto 24). Os resultados extremamente positivos alcançados neste trabalho demonstram a importância da avaliação experimental através de ensaios bioquímicos padronizados, que foi fundamental para a caracterização e a validação destas séries de inibidores. A diversidade química estudada é significativa e os melhores compostos serão muito úteis em etapas futuras de pesquisa de nosso grupo envolvendo os processos de descoberta e otimização de compostos líderes. Neste contexto, atenção especial será dada aos compostos 19, 28 e 34 que representam modelos extremamente atrativos em química medicinal e planejamento de fármacos. / Chagas\' disease, a parasitic infection widely distributed in Latin America, is a serious public health problem with devastating consequences in terms of human morbidity and mortality. The existing therapeutic alternatives are limited and insufficient, mainly due to low efficacy and high toxicity. Aiming at the design of new antichagasic agents, a variety of biochemical pathways and parasite proteins are currently being investigated as drug targets. The enzyme cruzain, a cysteine protease involved in all stages of development and differentiation of Trypanosoma cruzi, has been selected as molecular target in this dissertation work. Two series of compounds have been evaluated through biochemical assays with the target enzyme. The first series consists of 14 hydrazone and chalcone derivatives, where 8 compounds showed inhibitory activity against cruzain, with values greater than 70%. Of these, the hydrazone 19 showed significant in vitro potency with a value of 220 nM. The second series investigated, comprising 11 compounds previously selected by a virtual screening approach, showed interesting inhibitory profile. Nine compounds showed high potency, and 7 exhibited IC50 values in the nanomolar range from 646 nM (compound 32) to 11.3 nM (compound 24). The promising results achieved in this study demonstrate the importance of the experimental evaluation using standard biochemical assays, which was essential for the characterization and validation of these series of inhibitors. The chemical diversity explored is significant and the most potent compounds will be useful in future steps of our research group involving the processes of lead discovery and optimization. In this context, special attention will be given to compounds 19, 28 and 34 which represent extremely attractive models in medicinal chemistry and drug design.