A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é a forma mais comum e grave de Distrofia Muscular Progressiva. Esta doença possui herança recessiva ligada ao X e é caracterizada pela ausência de distrofina na membrana das fibras musculares. A DMD afeta 1/3.000 meninos nascidos vivos, e até os 12 anos de idade os pacientes são confinados à cadeira de rodas. Os afetados raramente sobrevivem após a terceira década de vida. Atualmente nenhum tratamento efetivo ainda foi desenvolvido para esta doença. Deste modo, nosso trabalho tem como objetivo principal contribuir para o entendimento do potencial terapêutico das células-tronco adultas do cordão umbilical visando a regeneração muscular. Para tanto, utilizamos como modelo cães da raça Golden Retriever portadores de distrofia muscular (GRMD Golden Retriever Muscular Dystrophy), uma vez que estes cães apresentam um quadro clínico muito semelhante com a patologia clínica humana. Demonstramos em nosso estudo que células hematopoiéticas provenientes do cordão umbilical canino não são capazes de restaurar a expressão de distrofina em níveis clinicamente relevantes em cães GRMDs. Frente a estes resultados, decidimos dar continuidade em nossos estudos com as células-tronco mesenquimais (CTMs) do cordão umbilical humano e canino as quais foram imunofenotipadas e caracterizadas, in vitro, quanto ao potencial de diferenciação. In vivo, demonstramos que as CTMs do cordão umbilical canino são capazes de chegar à musculatura de cães GRMDs, quando injetadas por via arterial, mas não de restaurar a expressão de distrofina em níveis clinicamente relevantes. Por fim, descrevemos um cão GRMD excepcional, Ringo, que apesar da completa ausência de distrofina nas fibras musculares, apresenta um fenótipo leve de distrofia muscular. Concluímos com nosso estudo que células-tronco do cordão umbilical parece não ser a fonte mais adequada para a regeneração muscular In vivo. Contudo é de extrema importância investigar novas estratégias visando melhorar o direcionamento destas células para o músculo esquelético. / Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is the most frequent and severe form of muscular dystrophy. It is an X-linked recessive disorder caused by complete absence of dystrophin in muscle fibers. DMD affects 1/3.000 living boys, with loss of independent ambulation occurring at approximately 12 years old. Without any special care, affected boys rarely survive beyond the third decade of life. Currently there is no treatment available for these patients, thus, the main purpose of these study is to understand the therapeutic contribution of umbilical cord stem cells aiming muscular regeneration. To perform our investigation we chose Golden Retriever Muscular Dystrophy (GRMD) dogs, since it is a large animal model of DMD with clinical signs closely mimicking those observed in humans. Here we showed that hematopoietic cells from umbilical cord blood failed to restore dystrophin expression at clinically relevant levels in GRMD dogs. Due to these results, we continued our studies with human and canine mesenchymal stem cells (MSCs) from umbilical cord, which were immunophenotyped and had their multipotent plasticity demonstrated in vitro. Using GRMD dogs we also showed that human and canine MSCs from umbilical cord were able to engraft in muscle fibers but were not sufficient to restore dystrophin expression at clinically relevant levels In vivo. Finally, we described an exceptional GRMD dog, Ringo, that besides the complete absence of dystrophin in his muscle fibers is showing a very mild phenotype. In conclusion, umbilical cord stem cells transplantation may not be a promising source for skeletal muscle regeneration In vivo, but further studies must take place in order to improve stem cell delivery to skeletal muscle.

Orientador: Humberto Santo Neto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T05:09:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferretti_Renato_M.pdf: 2564906 bytes, checksum: ad6eec170e1a021892d4ba5f418fe910 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) e o camundongo mdx, modelo experimental da doença, caracterizam-se pela ausência de distrofina e pela necrose das fibras musculares. Alguns músculos são protegidos da mionecrose e admite-se que nestes a expressão das proteínas reguladoras de cálcio está aumentada. Os músculos intrínsecos da laringe (ILMs) apresentam características anatômicas e fisiológicas semelhantes aos músculos extra-oculares (EOMs), que são protegidos da mionecrose em pacientes portadores de DMD e camundongos mdx. Assim levantamos a hipótese de que os ILMs são protegidos da necrose de suas fibras e apresentam expressão diferenciada de proteínas reguladoras do cálcio. Foram avaliados os ILMs e músculos apendiculares de camundongos C57Bl/10 (controles) e mdx, adultos e idosos. Foi analisado a porcentagem de núcleos centrais, como um sinal de fibras lesionadas e em reparação e foi utilizado o azul de Evans, como marcador de lesão miofibrilar. Após a caracterização desses músculos, foi estudado por imunohistoquímica e imunobloting, o nível da expressão de proteínas reguladoras do cálcio, calsequestrina e Ca2+-ATPase do retículo sarcoplasmático (SERCA1). Observou-se que, exceto o músculo cricotireóideo (CT), nenhum ILMs dos camundongos mdx adultos ou idosos apresentaram sinais de miopatia, entretanto núcleos centrais foram visíveis no músculo tibial anterior do mesmo animal. Houve aumento significativo da porcentagem de núcleos centrais no músculo CT comparado com outros ILMs, o qual piorou com envelhecimento. A expressão de SERCA1 e calsequestrina está aumentada nos ILMs distróficos em relação aos controles, distintamente do que ocorre nos músculos apendiculares. Assim, conclui-se que os ILMs dos camundongos mdx são protegidos da mionecrose e mostram níveis elevados de SERCA1 e calsequestrina, sugerindo que a manutenção da homeostase do cálcio pode estar envolvida na proteção desses músculos / Abstract: Duchenne muscular dystrophy (DMD) and mdx mice, a model for DMD, is characterized by the lack of dystrophin expression and muscle fiber necrosis. Some muscle are enigmatically protected and admitted that an elevated expression of calcium-binding proteins. The intrinsic laryngeal muscles (ILMs) share many anatomical and physiological properties with extra-ocular muscles, which are unaffected in both Duchenne muscular dystrophy and mdx mice. We hypothesized that ILMs are spared from myonecrosis in the mdx and investigated whether this possible protection is related to an increased expression of calcium-binding proteins, SERCA1 and calsequestrin, which may be protective against the elevated calcium levels seen in dystrophic fibers. ILMs and limb muscles of adult and aged control C57Bl/10 and mdx mice were used. The percentage of central nucleated fibers, as a sign of muscle fibers that had experienced injury and regeneration, and myofibers labeling with Evans blue dye, as a marker of myofiber damage, were studied. After this characterization, the expression of Sarco-endoplasmic-reticulum Ca2+-ATPase (SERCA1) and calsequestrin was examined using immunofluorescence and immunoblotting. Except for the cricothyroid muscle (CT), none of the ILMs from adult and old mdx mice showed signs of myofiber damage. Central nucleation was readily visible in tibialis anterior of the same mdx mice. A significant increase in the percentage of central nucleated fibers was observed in adult CT compared to the other ILMs, which was worsened by age. Dystrophic ILMs presented a significant increase in the proteins studied, in comparison to controls. These proteins were reduced in the non-spared mdx muscles. Thus we show that the ILMs are spared from the lack of dystrophin and the increase of SERCA1 and calsequestrin may permit a better maintenance of calcium homeostasis with the consequent absence of myonecrosis / Mestrado / Anatomia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é um tipo de miopatia grave, degenerativa e progressiva, geneticamente determinada e ligada ao cromossomo X. Além dos graves distúrbios cardiorrespiratórios e da motricidade, o paciente apresenta disfunções do sistema digestório, caracterizadas pelas desordens da motilidade. Entretanto, sabe-se que tais disfunções não ocorrem no camundongo MDX. O objetivo deste estudo foi estimar a densidade numérica por área da população total de neurônios (QA[T]) e dos neurônios nitrérgicos (QA[N]); assim como a área de secção transversal média do corpo celular destes neurônios (A[T] e A[N]) do plexo mioentérico esofágico e a largura média das fibras estriadas (L) das camadas musculares. Foram utilizados 40 camundongos machos da linhagem C57BL/10 nas idades de 4 e 10 semanas, distribuídos entre grupos experimentais (MDX4 e MDX10), e controles (C4 e C10). As estimativas foram analisadas em preparados de membrana dos esôfagos, e técnicas histoquímicas de NADH-diaforase (NADH-d) e NADPH-diaforase (NADPH-d) foram utilizadas para evidenciar toda a população de neurônios e os neurônios nitrérgicos, respectivamente. Os resultados mostraram que a QA[T] foi significativamente maior no grupo MDX10 em relação ao C10 (p<0.05); enquanto a QA[N] foi menor no grupo MDX4 em relação ao C4 (p<0.05). A A[T] foi menor no grupo MDX10 em relação ao MDX4 e ao C10 (p<0.05); enquanto que para a A[N] não houve diferença significativa entre os grupos controle e experimental, e tampouco entre os grupos de 4 e de 10 semanas. A variável L foi maior nos grupos MDX4 e MDX10 em relação aos seus respectivos controles de mesma idade (p<0.05). Concluímos que no plexo mioentérico esofágico de camundongos MDX existe uma redução dos neurônios mediadores do relaxamento, especialmente em animais jovens (MDX4), provavelmente porque o organismo tenta manter íntegra a função peristáltica do órgão. Esse fato pode explicar a adaptação e ausência de disfunções esofágicas durante quase toda a vida desses animais. / Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is the most common and the most severe muscular dystrophy of childhood. DMD is degenerative, progressive and a genetic X-linked disease. Besides the cardiomyopathy and the movement disorders, the patients have serious disfunctions in the alimentary system, characterized by motility disorders. However, it is known that such changes do not exist in MDX mice. The aim of this study was to estimate the neuronal numerical density/area of total (QA[T]) and nitregic neurons (QA[N]), the average cross-sectional area of total (A[T]) and nitregic (A[N]) neurons in myenteric plexus of the oesophagus and the average width of striped muscle of muscular layer (L). Forty C57BL/10 male mice were studied from four to ten weeks of age, divided into four groups: MDX mice formed the experimental groups (MDX4 and MDX10) and C57BL/10 male mice without the mutation formed the control groups (C4 and MDX10). Whole mounts preparations were obtained from the samples and histochemistry for NADH-diaphorase (NADH-d) and NADPH-diaphorase (NADPH-d) were used for morphometric evaluation. The results showed a significant increase of the QA[T] in the MDX10 than C10 (p<0.05), and a decrease of the QA[N] in MDX4 comparing to C4 (p<0.05). The A[T] decreased significantly in MDX10 comparing to both MDX4 and C10 (p<0.05), while no significant differences were observed among all the groups regarding the A[N]. The groups MDX4 and MDX10 showed a significant increase in L when compared to its controls at the same age (p<0.05). We conclude that in the myenteric plexus of the oesophagus in MDX mice there is a reduction of the inhibitory neurons, manly in the young animals (MDX4), probably to keep normal the peristaltic functions. Thus, it may explain the adaptation and the absence of oesophageal disfunction during almost the whole life in this animal model.

O modelo experimental canino Golden Retriever portador da Distrofia Muscular (GRMD) é o melhor substituto entre os modelos animais para estudar a Distrofia Muscular de Duchenne. Os principais sinais clínicos observados no cão afetado são disfagia, hipertrofia da língua, emagrecimento progressivo, fraqueza muscular, desvio de eixo dos membros e contraturas. A doença é determinada pela ausência da distrofina, uma proteína da membrana muscular, que tem papel vital na manutenção da estrutura e função da célula muscular. A GRMD não afeta apenas a musculatura estriada esquelética, podendo afetar inclusive o funcionamento do trato digestório, já que o músculo liso é o elemento primário dos órgãos tubulares. Objetivou-se neste trabalho, através do estudo morfológico, verificar se a distrofia muscular afeta a arquitetura geral do trato digestório e como está disposta sua estrutura muscular. Foram realizadas avaliações descritivas macroscópicas e microscópicas ópticas com colorações de Hematoxilina-Eosina, Tricrômio de Masson e Picrosirius. Em conjunto, nove cães GRMD afetados foram submetidos à avaliação da implantação de um novo manejo alimentar, num período de um ano, direcionado à correção dos problemas envolvidos na disfagia do cão distrófico. O esôfago e o estômago apresentaram-se como as porções mais afetadas do tubo digestório. Suas fibras musculares apresentavam-se com diâmetros variados e estavam entremeadas com abundante deposição de tecido conjuntivo, fibroblastos e infiltrado mononuclear com distribuição intersticial. O esôfago apresentou alterações muito severas, refletindo na sua funcionalidade, e levando ao megaesôfago secundário, devido à constituição por músculo estriado em toda a totalidade. O intestino não apresentou alterações histopatológicas significativas. Observou-se diferença de severidade entre lesões que ocorrem na musculatura estriada e na musculatura lisa, que pode ser devido à distribuição distinta do complexo distrofina-glicoproteína existentes nesses dois tipos de musculaturas. Desta forma, a ausência da proteína distrofina tende a ser menos crítica para a função muscular lisa no intestino, tal como é para o músculo esquelético. A musculatura lisa do estômago apresentava-se mais afetada que a do intestino, podendo ser explicado pelo fato do primeiro sofrer maiores ciclos de contrações e distenções, o que pode resultar em aumento de área de colágeno no tecido muscular e conseqüente perda de sua arquitetura. No cão afetado GRMD, a apreensão é uma fase crítica. Houve significativas respostas na implantação do novo manejo alimentar, quando aquela etapa foi substituída por auxílio humano. Assim a regurgitação mecânica tendeu a zero e pareceu diminuir o gasto energético excessivo. O modo como foram oferecidos o alimento e água preveniu o aparecimento de pneumonias por aspiração. A quantidade de água adicionada ao alimento seco foi suficiente para manter os animais hidratados. O manejo atual determinou manutenção dos pesos, ausência de desidratação clínica e ausência de óbitos, sendo assim indicado como manejo base a ser aplicado para a disfagia e megaesôfago adquirido secundário a distrofia muscular. Conclui-se que o manejo adequadamente direcionado torna-se especialmente importante para prevenir complicações e reflete em manutenção de equilíbrio e fortalecimento do sistema imune, e conseqüentemente, suporte perante a doença, proporcionando uma sobrevida com qualidade / The experimental dog model Golden Retriever affected by muscular dystrophy (GRMD) is the most appropriate substitute among animal models to study Duchenne Muscular Dystrophy. The main clinical signs observed in affected dogs are dysfagy, tongue hypertrophy, progressive weight loss, weakness, splaying of the limbs and contractures. The disease is due to the absence of dystrophin, a transmembrane muscle protein, which has a vital role on the maintence of structure and function of the muscle cell. GRMD doesn?t affect only skeletal muscle, also acted including in the digestory tract function, since the smooth muscle corresponds to0 the primary component of the digestive tube. The aim of this study was to evaluate, through of morphologic studies, if the muscular dystrophy affects the general architecture of digestory tract and how is arranged its muscular structure. There were evaluated the tubular viscera of GRMD affected dogs, through gross and light microscopic description, stained with Hematoxilin and Eosin, Masson trichrome and Picrossirus technique. Jointly, nine GRMD affected dogs were submitted on evaluation of the establishment of a new alimentary management, during a year, directed to the correction of problems involved on the dysphagy of dystrophic dog. The esophagus and the stomach presented the most affected portions. Muscle fibers presents varied diameter and were intermixed with abundant connective tissue, fibroblast and mononuclear infiltrate. The esophagus presents severe alterations, reflecting on its functionability, and leading to secondary megaesophagus, due to total constitution of striated muscle. The gut doesn?t presented significative histopathologic alterations. There was observed difference of severity between lesions that occurs on the striated muscle and the smooth muscle, and this fact could be due to the distinct distribution of the dystrophin-glycoprotein complex that occurs in these types of muscles. In this way, the absence of dystrophin was inclined to be less critical to the function of the intestine smooth muscle than of the skeletal striated muscle. The stomach smooth muscle presented more affected than the intestine smooth muscle, being explained to the fact of the first to suffer more contraction and distention cycles, which results in increase of collagen area on the muscle tissue and consequently, loss of its architecture. On the GRMD affected dog, the apprehension is a critical phase. There were significative answers on new management, since those phases was substituted by human relief. The mechanic regurgitation was inclined to zero and seems to decrease the excessive energetic caloric burned. The way which was offered the food and water warned the occurrences of aspiration pneumonia. The amount of water added to dry food was enough to hidric maintenance. The present management determined weight maintenance, absence of clinic dehydration and absence of death, being indicated as basal management to be applied on the dysphagy and secondary megaesophagus acquired in the muscular dystrophy. Concluding, the management adequately directed became especially important to warn complications and reflects on maintenance of the balance and strength of immune system, consequently, support in front of the disease, given then life with quality

Os cães Golden Retriever com Distrofia Muscular (GRMD) são considerados modelos experimentais para estudo da Distrofia Muscular de Duchenne que acomete humanos, devido serem geneticamente homologas. Utilizamos o ultra-som muscular para avaliar a evolução terapêutica de injeção de células tronco (CT). Para este experimento utilizamos 8, sendo 6 afetados pela doença e 2 não afetados (portadora e macho normal). Avaliamos de forma qualitativa (visual) e quantitativa (digital) os músculos cervicais splenius e semispinalis capitis e o músculo pélvico semitendinosus e realizamos mensurações musculares. Em relação aos músculos cervicais verificamos que não há alteração visual na arquitetura das fibras, porém o cão tratado via arterial apresentou menores escores na análise digital em relação ao cão controle afetado, deixando suspeitas sobre a migração de CT nesse grupo muscular. O splenius apresentou maior ecogenicidade que o músculo semispinalis capitis em 7 animais. Para o músculo semitendinosus, a portadora apresentou ecogenicidade elevada; os afetados apresentaram variáveis graus de alteração da arquitetura muscular e aumento de ecogenicidade; o macho normal apresentou fibras regulares, porém em alguns exames apresentou ecogenicidade elevada podendo ser conseqüência da angulação do transdutor. Quanto às mensurações, há diferença entre os afetados e não afetados para o músculo splenius e devido à hipertrofia que afeta os músculos pélvicos, não foi possível estabelecer diferenças entre os dois grupos. Concluímos que a ultra-sonografia com transdutores de até 7,5 MHz não é viável para acompanhar evolução terapêutica de injeção de CT em músculos com a pseudohipertrofia de GRMD, devido a modificação severa da arquitetura, não sendo possível a detecção de prováveis reparos da musculatura. / The dogs Golden Retriever with Muscular Dystrophy (GRMD) are considered experimental models for study of the Muscular Dystrophy of Duchenne that acomete human, and they are genetically homologue. We use the muscular ultrasound to evaluate the therapeutical evolution of injection of stem cells (SC). For this experiment we use 8, being 6 affected for disease and 2 not affected (carrying and male normal). We evaluate of qualitative form (visual) and quantitative (digital) the cervical muscles splenius and capitis semispinalis and the pelvic muscle semitendinosus and carry through muscular mensure. In relation to the cervical muscles we verify that it does not have visual alteration in the architecture of fibres, however the treat dog saw arterial presented minors props up in the digital analysis in relation the dog has controlled affected, leaving suspicion on the migration of SC in this muscular group. Splenius presented greater echogenicity that the muscle semispinalis capitis in 7 animals. For the muscle semitendinosus, the carrier presented high echogenicity; the affected ones had presented variable degrees of alteration of the muscular architecture and increase of echogenicity; the normal male presented regular fibres, however in some examinations he presented high echogenicity being able to be consequence of the transducer angle. How much to the mensure, it has difference between the affected ones and not affected for the muscle splenius and due to hypertrophy that affects the pelvic muscles, it was not possible to establish differences between the two groups. We conclude that the ultrasonography with transducers of up to 7,5 MHz is not viable to follow therapeutical evolution of injection of SC in muscles with the pseudohypertrophy of GRMD, had the severe modification of the architecture, not being possible the detention of probable repairs of the muscle.

A Distrofia Muscular dos cães Golden Retriever (GRMD), é uma miopatia degenerativa causada pela ausência de uma proteína, a distrofina, geneticamente homóloga à distrofia muscular de Duchenne que acomete humanos, portanto, estes cães são considerados modelos experimentais para estudos que buscam tratamentos para esta doença progressiva e sem cura. Neste trabalho, foram selecionadas sete diferentes medicamentos, entre eles: Sildenafil; Ácido ursodesoxicólico; Acetilcisteína; Losartana Potássica; Micofenolato de Mofetila; Talidomida e Diltiazen, formando um coquetel de medicamentos com a finalidade de tratar os efeitos deletérios causados pela distrofia muscular, proporcionando dessa forma, uma melhor qualidade e sobrevida para os pacientes distróficos. Cada medicamento foi escolhido pela sua ação: sildenafil, aumento do óxido nítrico; ácido ursodesoxicólico, antiinflamatório; Acetilcisteína, antioxidante; Losartana Potássica, antifibrótico e cardioprotetor; Micofenolato de Mofetila, imunossupressor; Talidomida, antiTNF; diltiazen, bloqueador dos canais de cálcio. Para o experimento, foram utilizados 6 cães machos GRMD, sendo 2 controle e 4 experimentais, com o tratamento iniciado aos 80 dias até 10 meses de idade. Os animais foram avaliados em diferentes momentos, com exames séricos, histologia básica, imuno-histoquímica e PCR.Após avaliações, podemos concluir que o coquetel de medicamentos, não causou melhora clínica nos cães do grupo experimental. A dosagem de leucócitos, TGP, CK e a expressão de NFk&beta; e TGF&beta;1 foi menor no grupo experimental comparado com o grupo controle, sugerindo uma melhora do processo inflamatório e tardia progressão da distrofia muscular no grupo experimental. / The Golden Retriever Muscular Dystrophy (GRMD), is a degenerative myopathy caused by the absence of a protein, dystrophin, genetically homologous to the Duchenne Muscular Dystrophy that affects humans, so these dogs are considered experimental models for studies that seek treatments for this progressive disease with no cure. In this work, we selected seven different medications, including: Sildenafil, Ursodeoxycholic Acid, Acetylcysteine, Losartan Potassium, Mycophenolate mofetil, Thalidomide and Diltiazem concomitantly forming a cocktail of drugs in order to treat the deleterious effects of muscular dystrophy, thereby providing a better quality and survival for patients dystrophic. Each drug was chosen for its action: sildenafil, increasing nitric oxide; ursodeoxycholic acid, anti-inflammatory; acetylcysteine, an antioxidant; losartan, antifibrotic and cardioprotective; mycophenolate mofetil, an immunosuppressant; thalidomide, antiTNF; Diltiazem, calcium channel blocker. For the experiment, 6 male dogs were utilized GRMD, and two control and four experimental. Treatment started with 80 days to 10 months of age. The animals were evaluated at different times with serum levels, basic histology, immunohistochemistry and PCR. After the evaluations, we conclude that the cocktail of drugs, no clinical improvement in the experimental group. The dosage of leukocytes, ALT, CK and NFk&beta; and TGF&beta;1 expression was lower in the experimental group compared with the control group, suggesting an improvement in the inflammatory process and delayed progression of muscular dystrophy in the experimental group.

A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma doença neuromuscular fatal, a mais comum das distrofias musculares, causada pela ausência da proteína distrofina, componente importante do complexo glicoproteínadistrofina, que envolve as células musculares lisas, cardíacas e esqueléticas, estabilizando a membrana dessas células durante contrações e relaxamentos. Por ser uma doença genética ligada ao cromossomo X, acomete indivíduos do sexo masculino, sendo que casos raros de meninas afetadas também são relatados. Indivíduos afetados pela DMD apresentam alterações significantes na composição corpórea, comparados com a população normal. Cães da raça golden retriever que possuem distrofia muscular (GRMD) representam o melhor modelo animal para ensaios terapêuticos na busca do tratamento da DMD, sendo esses animais fundamentais para o estudo do desenvolvimento dessa anomalia, devido ao fato de apresentarem genes e sintomas clínicos homólogos aos dos pacientes humanos. A similaridade entre as duas doenças é surpreendente, ambas são caracterizadas por precoce miopatia degenerativa, com progressiva necrose, fagocitose, deposição de cálcio e fibrose endomisial e perimisial. O foco principal deste trabalho foi esclarecer dúvidas quanto ao comportamento da musculatura lisa dos animais distróficos e portadores da GRMD, para se conhecer os efeitos da doença nesse tipo de tecido. Para avaliação da musculatura lisa uterina foram utilizados quatro úteros de cadelas golden retriever saudáveis, cinco úteros de portadoras do gene e quatro úteros de animais afetados pela GRMD. Analisando as fotomicrografias uterinas dos grupos, podemos notar que não há diferenças morfológicas através dos estudos histológicos convencionais. Porém, quando analisamos as fotomicrografias polarizadas , nota-se nas cadelas saudáveis exclusivamente colágeno do tipo III, de coloração esverdeada. Quanto às portadoras do gene da GRMD, observa-se colágeno predominantemente vermelho, do tipo I, e pouco em verde, tipo III. Fotomicrografias das fêmeas afetadas pela GRMD encontraram colágeno tipo III na parte interna do endométrio, miométrio e perimétrio, e colágeno tipo I em epitélio vascular, porém ambos em menor quantidade. É possível visualizar colágeno entre as fibras musculares através da luz polarizada. Para a avaliação da digestibilidade dos nutrientes em cães GRMD e sua capacidade absortiva, foram utilizados nove cães GRMD, sete fêmeas portadoras e dez animais saudáveis; todos receberam a mesma dieta adicionada de oxido crômico. O período experimental constou de um intervalo de 10 dias, sendo os cinco primeiros dias de adaptação e os cinco restantes de coleta de amostras. Os coeficientes de digestibilidade aparente (CDAs) obtidos pelos grupos estudados foram comparados e analisados: os resultados indicaram que os cães com GRMD avaliados não apresentaram redução do aproveitamento nutricional. Novas pesquisas que avaliem o gasto energético e composição corpórea destes animais são necessárias para melhor compreensão dos mecanismos envolvidos no emagrecimento e perda de peso que apresentam. Para a avaliação do tempo de trânsito gastrintestinal (TTGI) em cães golden retriever saudáveis, portadores e afetados pela distrofia muscular, foram utilizados 18 cães divididos em três grupos animais saudáveis, portadores e afetados pela GRMD, com seis cães cada. Os animais foram acondicionados em canis individuais e receberam a mesma dieta; esferas de polietileno (BIPS) impregnadas com bário foram fornecidas durante a alimentação. Cada animal recebeu 10 marcadores de tamanho grande (5 mm de diâmetro) e 30 marcadores de tamanho pequeno (1.5mm de diâmetro). Os animais foram radiografados nos momentos antes (basal) da 1ª refeição, para confirmação da ausência de conteúdo alimentar e fecal no trato gastrintestinal, e após a alimentação, em intervalos de duas horas, até que os marcadores atingissem o cólon. Resultados apontaram que os cães GRMD avaliados apresentam TTGI mais rápido quando comparados aos demais grupos. Este trabalho comprovou que a mm. lisa de cães distróficos é, de diversas maneiras, afetada pela doença, apresentando tanto alterações morfológicas como morfofuncionais. Muitos estudos nessa área são necessários para melhor compreensão dos mecanismos da enfermidade, bem como maneiras de intervenção para melhoria da qualidade de vida dos indivíduos afetados. Cães GRMD(s) são o melhor modelo animal para estudos pré-clínicos da DMD, assim esses resultados são muito relevantes para aprimoramento e melhora de manejo em biotérios que abrigam esses animais e para extrapolação de dados na própria medicina / Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a fatal neuromuscular disease, it is the most common muscular dystrophy caused by absence of dystrophin protein, an important component of the dystrophin-glycoprotein complex, involving cell membranes of smooth, cardiac and skeletal cells, stabilizing these cells during contractions and relaxations. Because it is a genetic disorder linked to the X chromosome, it affects males, with rare cases of girls affected also reported. Individuals affected by DMD show significant changes in body composition, compared with the normal population. Golden retriever dogs who have muscular dystrophy (GRMD) represent the best animal model for therapeutic trials in the treatment of DMD,; these animals are fundamental to the study of the development of this anomaly, due to the fact that they show clinical symptoms and genes homologous to the human patients. The similarity between the two diseases is staggering; both are characterized by early degenerative myopathy with progressive necrosis, phagocytosis, calcium deposition and endomysial and perimysial fibrosis. The main focus of this thesis was to answer questions about the behavior of smooth muscles of dystrophic animals and carriers of GRMD, to know the effects of the disease in this tissue type. For evaluation of uterine smooth muscle we utilized four uteri of golden retriever healthy bitches, five uteri of gene carriers and four uteri of animals affected by GRMD. Analyzing the uterine photomicrographs of the groups we note that there are no morphological differences in conventional histological studies. However, when we analyze the polarized photomicrographs, we note that in healthy bitches we can see only collagen type III of greenish color. As regards the carriers of the GRMD gene, there is predominantly red collagen , type I, and very little green, type III. Photomicrographs of females affected by GRMD found type III collagen inside the endometrium, myometrium and perimetrium and collagen type I in vascular epithelium, but both in a very little quantity. It is possible to visualize collagen between muscle fibers by polarized light. For the assessment of nutrient digestibility in dogs GRMD and its absorptive capacity, we used nine GRMD, seven carriers females and ten healthy animals and all of them received the same diet with added chromic oxide. The experimental period consisted of an interval of 10 days, with the first five days to adaptation and the last ones to sample collection. The apparent digestibility coefficients obtained by the groups were compared and analyzed; the results showed that dogs with GRMD evaluated showed no reduction in energy utilization. The experimental period consisted of an interval of 10 days, with the first five days to adaptation and the last of them to sample collection. The apparent digestibility coefficients obtained by the groups were compared and analyzed; the results showed that dogs with GRMD evaluated showed no reduction in nutritional absorption. New research to assess energy expenditure and body composition in these animals are needed to a better understanding of the mechanisms involving reduction and weight loss they present. For the assessment of gastrointestinal transit time (TTGI) in golden retriever dogs healthy carriers and affected by GRMD 18 dogs divided into three groups were used - healthy animals, carriers and affected by GRMD, with six dogs each. The animals were placed in individual cages and were fed the same diet; polyethylene spheres (BIPS) impregnated with barium were supplied during feeding. Each animal received 10 markers large size (5mm diameter) and 30 markers small size (1.5mm diameter). Radiographs were taken in the moments before (baseline) the 1 st meal, to confirm the absence of food and fecal content in the gastrointestinal tract and after feeding at two-hour intervals until markers reach the colon. Results indicated that GRMD dogs evaluated showed TTGI faster when compared to the other groups. This thesis has shown that the smooth muscles of dystrophic dogs are, in many ways, affected by the disease, with both morphological and morphofunctional alterations; many studies in this area are needed so we can better understand the mechanisms of disease, as well as ways of intervention to improve the quality of life of affected individuals. GRMD dogs are the best animal model for preclinical studies of DMD, so these results are very relevant to enhancement and improvement of management in bioteries these animals have

A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) tem como característica marcante a substituição do músculo pelo tecido fibroso, sendo este um dos maiores obstáculos para a eficácia de terapias para a distrofia muscular. Intervenções para preveni-la provavelmente poderão ser necessárias como parte de um tratamento eficaz. Correlações significativas entre fibrose e a expressão do TGF-beta, uma citocina fibrogênica multifuncional nas distrofias musculares têm sido relatadas, enfatizando o papel dessa citocina no desenvolvimento da fibrose muscular e sugerindo-a como alvo para terapias antifibróticas. Nesse estudo avaliamos o efeito do Losartan sobre o desenvolvimento da fibrose na musculatura esquelética do modelo canino Golden Retriever Muscular Dystrophy (GRMD). Foi realizado previamente um estudo piloto com um cão distrófico para estipular dosagem e eventuais efeitos colaterais ao medicamento. Foram utilizados cinco cães adultos, sendo dois machos e duas fêmeas e um animal controle. Utilizou-se a dose de 50mg de Losartan, administrada via oral, uma vez ao dia. Os exames clínicos e laboratoriais não evidenciaram reação adversa durante o período do experimento, portanto, o Losartan mostrou-se como uma terapia segura. Os fragmentos da biopsia muscular retirados antes de iniciar com o Losartan (T0) e após (Tf) foram utilizados para histologia e imuno-histoquimica do TGF-beta1 para comparação destes dois tempos. As avaliações de goniometria e perimetria juntamente com os resultados de imuno-histoquimica e quantificação do colágeno ajudaram a inferir sobre o efeito do Losartan na fibrose do músculo distrófico. Não foi encontrada diferença significativa para os valores de goniometria e perimetria. Já a porcentagem da área de deposição de colágeno dos animais nos Tf foi estatisticamente menor do que o T0. A diminuição da presença do TGF-beta1 evidenciada nas imagens de imuno-histoquimica, com a diminuição do depósito de colágeno, após o período de uso do Losartan, sugerem um efeito inibitório do medicamento sobre esta citocina nos músculos dos cães GRMD estudados. / Duchenne Muscular Dystophy (DMD) has the substitution of the muscle by connective tissue as its most relevant characteristic. Once fibrotic proliferation is a major obstacle to the efficacy of therapies for muscular dystrophies, early interventions to prevent it will probably be necessary as part of an effective treatment. A significant correlation between fibrosis and the expression of TGF-beta 1, a multifunctional cytokine, in Duchenne muscular dystrophies has been reported, emphasizing the role of this cytokine in the development of muscle fibrosis, and suggesting it as target for fibrotic therapies. In this study we evaluated the effect of Losartan over the development of the connective tissue on the skeletal musculature of the canine model GRMD. One dystrophic dog was previously used in the pilot study to estipulate the dosage and any side effects caused by Losartan. Five adults dystrophics dogs, two male and two female and one control animal were used in the experiment. A dose of 50mg of Losartan was orally given once a day. The clinical and laboratorial exams did not show any adverse effect through the experimental period, therefore Losartan utilization showed to be a safe therapy. Muscle biopsy fragments have been removed before starting Losartan (T0) and after (Tf) were used for histology and TGF-beta1 imunohistochemistry to compare this two times. The evaluations range of motion and limb circumference measures within imunohistochemistry and colagen quantification results helped to infer about Losartan effect in the dystrophic muscle fibrose. Range of motion and limb circumference values did not show statistical difference. Although the percentage of connective tissue deposition area in the animals in Tf was statistically lower than T0. The decrease of TGF-beta1 signalization showed in imunohistochemistry pictures within the decrease of connective tissue deposition, after Losartan, suggest an inhibitory effect of this medication through this cytokine in the studied GRMD muscle.

As distrofias musculares em crianças e adolescentes acometem 1 em cada 3000 nascimentos. A distrofia de Duchenne é de origem genética e herança recessiva ligada ao cromossomo X, sendo determinada pela ausência da proteína distrofina, apresenta caráter invariavelmente progressivo, natureza mórbida e fim letal. Até o momento não se conhece tratamento efetivo, mesmo com todo o conhecimento que se tem da etiopatogenia. O objetivo deste estudo foi avaliar, no modelo animal, utilizando cães golden retrievers normais portadores e afetados pela distrofia muscular progressiva, a existência de alterações na função glomerular, através da comparação entre os clearances de creatinina, clearance do radionuclídeo EDTA-cromo e da concentração sérica de uréia e creatinina. Os animais foram divididos em 3 grupos de 9 animais sendo grupo 1 controle, grupo 2 portador e grupo 3 afetados. Todos os animais foram submetidos ao mesmos protocolos de exames. Não foram identificadas alterações significativas entre os grupos ou individualmente, sendo que todos os resultados encontraram-se dentro dos limites de normalidade. Sendo assim lesões renais primárias, obscuras aos testes convencionais, descartando-se uma correlação entre a distrofia muscular e lesão na musculatura dos vasos renais que pudessem levar a alterações da função do órgão. / The muscular dystrophys in children and teenagers is taken in 1 each 3000 births. The Duchenne`s dystrophy is from genetics origin and recessive heritage linked to X cromossome, and also determined by the lacre of dystrophyne protein; it shows progressive characteristics, morbid nature and a letal end. So far there is no known effective treatment, even with all the ethiopatogein knowledge. The goal of use of normal golden retrievers dogs, bling then carriers and affected by the progressive muscular dystrophy, the changing existence in the glomerular function through the comparison between the creatinine clearance, EDTA-crome clearance and seric urea and creatinine. Aiming the early diagnostic of the renal pathology. The animals were divided in 3 groups of 9 animals, bling group 1 control animals, group 2 carriers animals and group 3 affected animals. All of then were submitted to the some examinations protocols Their was no relevant identification between the groups or either individually, as all the results were within the expected and natural limits. Likewise, renal primary wounds are not clear in traditional tests made in dystrophyc animals, mainly caused by the muscular wounds in reanal vases harming this way the organ function.

Esta pesquisa teve como objetivo estudar a aplicação de células-tronco do epitélio olfatório de coelhos com o uso da videolaparoscopia na face costal do músculo diafragma do modelo mdx. A cirurgia laparoscópica foi utilizada como recurso visualizador da cavidade abdominal, com finalidade de guiar precisamente a aplicação de células-tronco no tecido lesionado. Foram utilizados 10 animais controles, BALB/C57 (grupo A) para padronizar a intervenção cirúrgica; 03 mdx controles (grupo B) que não receberam terapia celular e 03 mdx que receberam terapia celular (grupo C). Padronizou-se a videolaparoscopia em decúbito dorsal com elevação de vinte graus dos membros torácicos e realizou-se 1 aplicação de células-tronco do epitélio olfatório de coelhos, 3x105. Após 8 dias estes animais foram eutanasiados com overdose anestésica e o músculo diafragma e intercostal foram coletados. Na análise estrutural do músculo diafragma no grupo A, observou as fibras musculares com mesmo diâmetro e núcleos das células periféricos. Os fascículos musculares encontravam-se organizados com presença de fibras reticulares em pequena quantidade. As mesmas características estruturais foram observadas no músculo intercostal. No grupo B, as fibras musculares apresentavamse com diferentes diâmetros, núcleos celulares centralizados, com presença de fibrose perimisial. O músculo intercostal apresentou os mesmos achados, entretanto de forma mais branda. Os fascículos musculares tanto do m. diafragma e intercostal estavam desorganizados e observou-se uma grande quantidade de fibras colágenas e reticulares. No grupo C, observou-se uma leve diminuição do infiltrado inflamatório, porém os núcleos das células ainda se apresentavam centrais. Diferentemente dos dois grupos descritos acima, no grupo C observou-se a presença de células de degranulação e de cordões de mioblastos, demonstrando uma moderada reorganização muscular. Em relação aos fascículos musculares e a quantidade de fibras colágenas e reticulares, estes se mantiveram com as mesmas características do grupo B. Na análise de migração das células-tronco, observamos a marcação positiva da Proteína verde fluorescente (GFP) no músculo diafragma a fresco e na análise imunoistoquímica confirmando os achados estruturais obtidos. Contudo não houve marcação positiva para os cordões de mioblastos. Sugerimos que a aplicação local de células-tronco do epitélio olfatório de coelhos utilizando a videolaparoscopia foi capaz de implantar células-tronco no músculo diafragma. Entretanto, não podemos atribuir os resultados estruturais obtidos nos animais que receberam terapia celular às células-tronco. Acredita-se que alguma sinalização até o momento desconhecida, possa ter estimulado tais alterações histológicas. Portanto, este experimento pode acrescentar novas perspectivas na utilização futura das célulastronco no modelo distrófico canino, por exemplo, o GRMD (Golden Retriever Muscular Dystrophy), além de estimular a pesquisa para maior esclarecimento sobre as células do epitélio olfatório de coelho. / This research aimed to investigate the application of stem cells from the rabbit olfactory epithelium with the use of laparoscopy in the diaphragm costal face of the of the mdx model. Laparoscopic surgery was used as a visualizer resource of the abdominal cavity; with the purpose to precisely direct stem cells application in the injury tissue. Were used 10 control animals, BALB/C57 (group A) to standardize the surgical intervention, 03 mdx controls (group B) that did not receive cell therapy and 03 mdx that received cell therapy (group C). The laparoscopic technique was standardized in the supine position with twenty degrees elevation of the thoracic members, subsequently was held an application of stem cells from the olfactory epithelium of rabbits, 3x105. After 8 days the animals were euthanized by using anesthetic overdose and the diaphragm and intercostal muscles were collected. The structural analysis of the group A diaphragm presented muscles fibers with same diameter and the cells nuclei presented peripheral. The muscle fascicles were organized with the presence of reticular fibers in small quantities. The same structural characteristics were observed in the intercostal muscle. The group B, presented muscle fibers with different diameters, centralized nuclei cell, with perimisial fibrosis. The intercostal muscle showed similar findings, less severely though. The muscle fascicles of both diaphragm and intercostal muscles were disorganized and presented a large amount of collagen and reticular fibers. In group C, were found a slight decrease of the inflammatory infiltrates, but, at this point, the cells nuclei were central. Differently from the two groups described above, the group C presented cell degranulation and myoblasts cords, demonstrating moderate muscle reorganization. The muscle fascicles and the amount of collagen and reticular fibers remained with the same characteristics of the group B. When examining the stem cells migration, it could be observed, in the fresh diaphragm, a positive marking of green fluorescent protein (GFP). The immunoistochemical analysis confirmed the findings obtained. However, the myoblasts cords were not positive stained. It could be suggested that the rabbit olfactory epithelium stem cells application using the laparoscopic technique was able to conduct stem cells to the diaphragm. Meanwhile, this cannot attribute the structural results obtained from animals which received cell therapy. It is believed that some signaling until the moment unknown may have stimulated these histological changes. Therefore, this experiment can add new perspectives for cell therapy in dystrophic canine model, for example, GRMD (Golden Retriever Muscular Dystrophy).