Orientador: Maria Julia Marques / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-26T17:20:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moreira_DrielendeOliveira_D.pdf: 1797583 bytes, checksum: 467851661491c4671f42d059f14dbd53 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é uma doença muscular progressiva que causa falência respiratória e cardíaca resultando em morte por volta da terceira década de vida. A ausência da distrofina na DMD e no camundongo mdx, modelo experimental da doença, leva a instabilidade do sarcolema e aumento do influxo de cálcio seguido de mionecrose e fibrose. Receptores purinérgicos estão envolvidos na patogênese das distrofinopatias. A ativação destes receptores por ATP deflagra vias de sinalização secundárias que promovem a entrada de cálcio e ativam a formação de fibrose. No presente estudo, verificamos se a suramina, droga anti-fibrótica e antagonista de receptores purinérgicos, modifica o cálcio e proteínas a ele relacionadas, bem como afeta metaloproteinases e seus inibidores teciduais, no coração e no músculo diafragma de camundongos mdx, na fase mais tardia da doença (11 meses de idade). Análise de Western blotting revelou níveis elevados do receptor purinérgico P2Y2 em ambos os músculos estudados. A terapia com suramina diminui o nível deste receptor significativamente. Concomitantemente, observamos redução dos níveis do canal de cálcio ativado por estiramento (TRPC1) e do cálcio total, o que no músculo cardíaco pode explicar a redução da mionecrose (diminuição da creatina quinase cardíaca no plasma e da troponina I no miocárdio). A atividade e o nível da metaloproteinase-9 (MMP-9), principal envolvida na remodelação da matriz extracelular e formação de fibrose, estavam elevados no coração distrófico em relação ao coração normal. A suramina promoveu aumento adicional da atividade da MMP-9 e dos níveis do seu inibidor tecidual, a TIMP-1. A suramina preveniu a redução da beta-distroglicana, componente do complexo distrofina-proteínas que encontra-se reduzido no coração distrófico. De maneira geral, a suramina promoveu efeitos semelhantes no diafragma distrófico, no que se refere ao cálcio total, TRPC1, MMP-9 e TIMP-1. Estes dados sugerem que, tanto no coração quanto no diafragma distróficos, o receptor purinérgico P2Y2 desempenha papel importante em vias de sinalização relacionadas ao cálcio (através do TRPC1) e da modulação da matriz extracelular (através da MMP-9 e TIMP-1). A suramina, por ser utilizada em outras doenças humanas, com doses e efeitos colaterais já estabelecidos em humanos, tem potencial para a terapia da cardiomiopatia na DMD, merecendo atenção em estudos clínicos desta doença / Abstract: Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a progressive muscle-wasting disease that causes respiratory and cardiac failure and results in death at about 30 years of age. The lack of dystrophin in mdx mice, the experimental model of DMD, causes sarcolemmal breakdown and increased calcium influx followed by myonecrosis and fibrosis. Purinergic receptors are involved in the pathogenesis of dystrophinopathies. Activation of these receptors by ATP triggers secondary signaling pathways that promote calcium entry and activates the formation of fibrosis. In the present study, we investigated if suramin, an anti-fibrotic drug and an antagonist of purinergic receptors, modifies total calcium and calcium related-proteins and affects metalloproteinases and their tissue inhibitors in the heart and diaphragm muscle of dystrophic mice, in the later stage of the disease (11 months of age). Western blotting analysis indicated increased levels of P2Y2 purinergic receptor in the both muscles studied, which were significantly decreased by suramin. Concomitantly, suramin lead to a reduction in total calcium and in the levels of the stretch-activated calcium channel TRPC1, which may explain the reduction of cardiac necrosis (decreases heart creatine kinase in plasma and troponin I in the myocardium). The activity and level of metalloproteinase-9 (MMP-9), the main involved in remodeling of the extracellular matrix and formation of fibrosis, were elevated in the dystrophic heart compared to normal heart. Suramin promoted further increase in MMP-9 activity and in the levels of MMP-9 inhibitor TIMP-1. Suramin prevented the reduction of beta-dystroglycan, one of the main components of the dystrophin-protein complex usually reduced in dystrophic heart. In general, suramin promoted similar effects in the dystrophic diaphragm, with respect to total calcium, TRPC1, MMP-9 and TIMP-1. These data suggest that P2Y2 purinergic receptor plays an important role in signaling pathways involved in calcium regulation (via TRPC1) and modulation of extracellular matrix (via MMP-9 and TIMP-1), in cardiac and respiratory dystrophic muscles. Suramin may be a potential alternative to treat dystrophic cardiomyopathy deserving attention in clinical trials / Doutorado / Anatomia / Doutora em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores: Anamarli Nucci, Marcondes Cavalcante França Junior / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-27T03:57:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mendonca_HelenaRezendeSilva_D.pdf: 2329027 bytes, checksum: 0f0b498b853a5b5821670460c3bfdca0 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Objetivo. O estudo propôs-se a caracterizar as alterações neuropsicológicas, encefálicas e da bioquímica cerebral em pacientes com Distrofia Miotônica tipo 1 (DM1) e correlacionar as anormalidades encontradas aos parâmetros clínicos. Métodos: Estudo descritivo em 13 pacientes com diagnóstico clínico, laboratorial e genético de DM1, comparados a 14 controles saudáveis com correção para gênero, idade e escolaridade. Avaliações realizadas: 1) clínica e neurológica com ênfase na quantificação da força muscular.(MRC) e escala MIRS (motor impairment ranting scale). 2) cognitiva pelo Mini Exame do Estado Mental. 3) do humor pelo questionário de depressão de Beck. 4) psicométrica pela escala de inteligência de Wechsler para adultos (WAIS III). 5) neuropsicológica compreendendo os testes: dominância manual; atenção e memória operacional por dígitos direto e inverso e Stroop incongruente; percepção visuoespacial; fluência verbal semântica; nomeação de Boston; praxia construtiva visuoespacial por cubo de Kohs; aprendizado auditivo-verbal de Rey; memória visuoespacial 10/36. As imagens cerebrais por ressonância magnética foram obtidas em aparelho de 2 Tesla, com aplicação da: a) Morfometria baseada em voxels (VBM) para substância cinzenta e branca. b) Espectroscopia de single voxel nas áreas frontal, temporoparietal e occipital, sendo considerados os valores relativos de N-acetilaspartato (NAA), creatina total (creatina mais fosfocreatina), colina e glutamato mais glutamina. Análise estatística não paramétrica foi aplicada aos dados cognitivos e de espectroscopia e teste-t com duas amostras independentes para dados de VBM. Resultados e Conclusões. Nos pacientes (6 DM1-juvenil e 7 DM1-clássico) com moderada a grave afecção muscular (MIRS 3 a 5), o desempenho psicométrico pelo WAIS III foi pior na escala verbal. Encontrou-se significativo acometimento da praxia com cubos de Kohs e com o teste Stroop incongruente, não correlacionado ao desempenho motor, nos pacientes. Não houve diferença significativa nos demais testes entre DM1 e controles. No VBM houve redução de substância cinzenta nos pacientes em regiões: 1) frontais com predomínio à direita: giro frontal inferior, porções orbicular, triangular e opercular; giro pré-central, giro frontal inferior e medial; 2) lobo límbico: giro para-hipocampal direito e giro cingulado bilateral (anterior e médio à esquerda e posterior à direita); 3) lobo temporal esquerdo (giros médio e superior). Atrofia da substância branca ocorreu no corpo caloso posterior, giro frontal medial e polo temporal medial à direita e uncus bilateral. Na espectroscopia não houve diferença na concentração relativa de metabólitos, mas a concentração de NAA temporoparital se correlacionou com o pior desempenho no teste de Stroop e com a atrofia da substância cinzenta temporal à esquerda. No total, as alterações córtico-subcorticais identificadas no estudo mostraram relação com as redes neurofuncionais referentes às alterações neuropsicológicas construtiva visuoespacial e processo inibitório executivo, sugerindo que redes neuronais de integração fronto-temporo-límbicas, sobretudo a rede fronto-límbica, implicada na integração de componentes visuais e tomada de decisão envolvendo inibição, possam estar envolvidas na gênese das disfunções encefálicas deste grupo de pacientes DM1 / Abstract: Objective. The study aimed to characterize the neuropsychological, encephalic and biochemical disorders in patients with Myotonic Dystrophy Type 1 (DM1) patients and correlate abnormalities findings with clinical parameters. Methods. A descriptive study in 13 patients with clinical, biochemical and genetic diagnosis of DM1, compared to 14 healthy controls with correction for gender, age and education. Evaluations conducted: 1) clinical and neurological evaluation with emphasis on quantification of muscle strength (MRC) and MIRS scale (motor impairment ranting scale). 2) cognitive assessment by the Mini-Mental State Examination ¿ MMSE. 3) Evaluation by Beck depression inventory. 4) the psychometric evaluation by Wechsler Intelligence Scale for Adults, third edition - WAIS III. 5) neuropsychological evaluation comprising the tests: handedness dominance; attention and working memory by span digits forward and reverse and incongruent version Stroop test; visuospatial perception; semantic verbal fluency; Boston naming test; constructive visuospatial praxis by Kohs¿ bloks; Rey auditory-verbal learning test; visuospatial memory 10/36.test. 6) Brain magnetic resonance images (MRI) evaluation by 2 Tesla scanner by. a) Voxel based morphometry (VBM) to gray and white matter. b) single voxel spectroscopy in the frontal, temporoparietal and occipital areas, being considered the relative values of metabolites: N-acetyl aspartate (NAA), total creatine (creatine plus phosphocreatine), choline and glutamate plus glutamine. Non-parametric statistical analysis was applied to cognitive and spectroscopy data and t-test with two independent samples to VBM data. Results and Conclusions. In patients (6 DM1-juvenile and 7 classical-DM1) with moderate to severe muscular disorder (MIRS 3-5), the psychometric performance by WAIS III was worse on the verbal scale. It was found significant impairment of constructive visuospatial praxis with Kohs¿ bloks and the incongruent Stroop test, not correlated to motor performance in patients. There was no significant difference in the other tests between DM1 and controls. VBM results: gray matter atrophy in patients in the regions: 1) frontal predominantly right: inferior frontal gyrus, orbicularis, triangular and opercular areas; pre-central gyrus, inferior and medial frontal gyrus; 2) limbic lobe: right parahippocampal gyrus and bilateral cingulate gyrus (anterior and middle to left and posterior to right); 3) left temporal lobe: middle and superior temporal gyri. Atrophy of the white matter occurred in the posterior corpus callosum, medial frontal gyrus and medial temporal pole to right and bilateral uncus. In spectroscopy there was no difference in the relative concentration of metabolites, but temporoparietal NAA was correlated with poorer performance on the Stroop test and the atrophy of the left temporal gray matter. In total, the cortico-subcortical changes identified in the study showed a relationship with the neurofunctional networks related to neuropsychological visuospatial constructive and executive inhibitory process disorders, suggesting that neuronal networks of fronto-temporo-limbic integration, particularly the frontal-limbic network, involved in integration of visual components and decision making involving inhibition, may be involved in the genesis of brain dysfunction in this group of DM1 patients / Doutorado / Neurologia / Doutora em Ciências Médicas

Orientador: Marcos Nogueira Eberlin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-27T06:43:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MartinsJunior_HelioAlves_D.pdf: 12398214 bytes, checksum: f76ac9572671aeed993f82ac2167745d (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A Espectrometria de Massas (MS) é uma das técnicas mais empregadas em aplicações bioanalíticas para detecção e quantificação inequívoca de compostos de interesse biológico, provendo informações de extrema relevância para o entendimento dos sistemas biológicos em geral. Neste trabalho, foram realizados estudos de quantificação de hormônios esteroidais por espectrometria de massas no campo da produção animal, por se tratar de uma técnica pouco difundida atualmente na área veterinária. A primeira parte do trabalho consistiu no estudo quantitativo do perfil de quatro hormônios esteroidais em soro de cães da raça Golden Retriever, portadores do gene da distrofia muscular de Duchenne (GRMD). Os animais foram acompanhados durante todas as fases do ciclo estral e os hormônios foram dosados para o entendimento da dinâmica destes compostos ao longo do ciclo. Os resultados comparativos dos níveis hormonais entre os grupos de estudo e o grupo controle apresentaram, pela primeira vez analisados por espectrometria de massas, informações relevantes sobre os níveis destes hormônios. Nossas observações impulsionaram uma importante discussão sobre a correlação das concentrações dos hormônios analisados frente aos sinais clínicos e desenvolvimento da patologia destes animais. A segunda parte deste trabalho consistiu no emprego da espectrometria de massas de alta resolução e exatidão para quantificação de dez hormônios esteroidais em plasma bovino. A metodologia desenvolvida foi aplicada ao estudo dos níveis plasmáticos dos hormônios em vacas clonadas por transferência nuclear de células somáticas (TNCS). Realizou-se um estudos comparativo da cinética dos níveis em plasma dos hormônios no ultimo mês de gestação dos animais clonados, em relação a animais inseminados por fertilização in vitro (FIV) e ao grupo controle, composto por animais de gestação natural. Os resultados mostraram haver alterações na esteroidogênese das vacas portadoras de embriões derivados de técnicas artificiais de gestação e biotecnologia. Foram observadas alterações significativas das rotas de biosíntese e concentrações de hormônios sexuais e corticóides no ultimo mês de gestação dos animais. Estas diferenças e desregulação do processo de biosíntese dos hormônios analisados, promovem alterações das concentrações de hormônios associados ao processo de sinalização de parto, ineficiente em animais clonados por TNCS / Abstract: Mass spectrometry (MS) is one of the most used techniques in bioanalytical applications for detection and unambiguous quantitation of biological compounds, providing information of greatest relevance for the understanding of biological systems. In this thesis, the tandem mass spectrometry has been applied for quantitation of steroid hormones in the field of animal production, as this technique still remains unusual in the veterinary science. The first part of this work consisted in the quantitative profiling study of four steroids in serum of X-linked Golden Retriever Muscular Dystrophy (GRMD) dogs. The animals were followed during all estrous cycle phases and the hormones were measured to understand the dynamics of these compounds over the estrous cycle. The results comparison among the studied carrier and affected groups versus the control group presented, for the first time by mass spectrometry, relevant information about the levels of these hormones. Our findings stimulated an important discussion about the correlation of the hormones concentrations against clinical signs and development of the pathology of these animals. In the second part of this thesis, the high resolution mass spectrometry was applied for quantification of ten steroid hormones in bovine plasma. The methodology was applied to investigate the steroid plasma levels in cloned-derived catlle by nuclear transfer of somatic cells (SCNT). A comparative study of the plasma steroid dynamics of naturally and artificially conceived bovine pregnancies approaching parturition was carried out. The results revealed changes in the steroidogenesis of recipient cows carrying artificially-derived (ART) conceptuses from biotechnology techniques. Significant changes in the steroids pathway as well as in the concentrations of corticosteroids and sex steroids over the last month of gestation were observed. The steroids pathway dysregulation considerably altered the steroids plasma steroid concentrations in the prior month of parturition contributing to the lack of partutition signaling observed in SCNT-derived pregnant cattle / Doutorado / Quimica Inorganica / Doutor em Ciências

Orientador: Humberto Santo Neto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T14:32:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_JulianoAlves_D.pdf: 20174519 bytes, checksum: cb29b0264ecac77cff508a6dbc1ec270 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Na distrofia muscular de Duchenne (DMD) e no camundongo mdx, a ausência da distrofina no músculo esquelético e cardíaco, desestabiliza o sarcolema e leva a um aumento do influxo de cálcio e consequente mionecrose. A reação inflamatória induzida para remover a fibra muscular necrótica, ativa a produção de citocinas pró-inflamatórias, que por sua vez aumenta o estresse oxidativo e ultimamente levando a formação de fibrose intersticial. A terapia padrão ouro usada no tratamento da DMD é o corticosteroide, tal como a prednisona e o deflazacorte (DFZ). No entanto, eles apresentam valor terapêutico limitado, e sua combinação com drogas já aprovada para o tratamento de outras doenças humanas, como a doxiciclina (DOX) poderia ser uma alternativa no tratamento clínico em pacientes DMD. No presente estudo, investigamos os benefícios da terapia do DFZ associado a DOX em relação ao tratamento padrão ouro DFZ, na atenuação da evolução da distrofinopatia em músculo esquelético e cardíaco de camundongos mdx. As terapias com cada droga isoladamente (DOX 6 mg/mL), (DFZ 1,2 mg/Kg) e com a combinação DOX (6 mg/mL) / DFZ (1,2 mg/Kg) foram administradas na água de beber para mãe e seus recém nascidos, com início no dia do nascimento no grupo tratado de curta duração por 36 dias. No tratamento de longa duração (9 meses), as mesmas terapias e as mesmas doses foram administradas na água de beber, com início aos 8 meses até os 17 meses de idade. Os parâmetros histopatológicos, funcionais e bioquímicos foram avaliados no músculo esquelético (bíceps braquial e diafragma) e coração. A DOX/DFZ apresentou-se vantajosa em relação a monoterapia com DFZ tanto na proteção inicial contra a mionecrose, quanto em retardar a progressão da distrofinopatia nos músculos esqueléticos. Mostrou-se também vantajosa em relação ao DFZ na proteção cardíaca. A combinação da DOX com o DFZ, já utilizada no tratamento de algumas doenças emerge como um tratamento potencialmente útil para DMD / Abstract: In Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) and in mdx mice, absence of dystrophin in skeletal and cardiac muscle disrupts the sarcolemma and leads to increased calcium influx and consequent myonecrosis. The inflammatory reaction elicited to remove muscle fiber debris results in production of pro-inflammatory cytokines which, in turn, increases oxidative stress, and ultimately causes interstitial fibrosis. The gold standard therapy used in the treatment of DMD consists in the use of corticosteroids such as prednisone and deflazacort (DFZ). However, these drugs have limited therapeutic value and their combination with drugs already approved for the treatment of other human diseases such as doxycycline (DOX) could be beneficial in the clinical management of DMD patients. In this study, we investigated the benefits of the association between DFZ and DOX over therapy with DFZ (gold standard), in mitigating the evolution of dystrophinopathy in skeletal and heart muscle in mdx mice. The treatments with the single drug (DOX 6 mg/mL), (DFZ 1,2 mg/Kg) or DOX (6 mg/mL) / DFZ (1,2 mg/Kg) combination were administered in drinking water to mothers and newborns, starting on the day of birth in the short-term treatment group for a period of 36 days. In the long-term treatment group, which was composed of mice 17 months of age, the same treatments were administered in drinking water to mdx mice for 9 months, starting on their 8 month of birth. Histopathological, functional and biochemical parameters were evaluated in skeletal (biceps brachii and diaphragm) and cardiac muscle. DOX/DFZ combination was found to be advantageous over monotherapy with DFZ either by promoting an initial protection against myonecrosis or by slowing the progression of dystrophinopathy of skeletal muscles. It was also advantageous for cardiac protection. The combination of DOX with DFZ, which has already been used in the treatment of some diseases, has emerged as a potential useful therapy for DMD / Doutorado / Anatomia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

As distrofias musculares progressivas (DMP) são um grupo de doenças genéticas hereditárias caracterizadas pela degeneração progressiva e irreversível da musculatura esquelética. A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é a forma mais comum e mais grave de DMP, com prevalência de 1 a cada 3500 a 5000 meninos. Em geral, a perda da ambulação ocorre entre 9 a 12 anos e complicações respiratórias e cardíacas podem levar ao óbito a partir da segunda década. A pesquisa em terapia celular iniciou-se com o objetivo de reverter ou diminuir a progressão do processo distrófico através do repovoamento do músculo com células normais. Atualmente, acredita-se em um benefício terapêutico com base nas propriedades anti-inflamatórias, anti-fibróticas e imunomodulatórias das células tronco adultas (CTA). As CTAs mesenquimais são bastante heterogêneas quanto à sua composição celular o que ocasiona inconsistência de resultados. Por isso, a caracterização e separação de sub-populações através de marcadores específicos e o enriquecimento de culturas de CTA com um subtipo celular de interesse pode aumentar a robustez e o efeito das terapias. Uma dessas subpopulações é o pericito que, ao contrário das CTAs mesenquimais, foi bem descrito quanto à sua localização e função in vivo. Além disso, pericitos derivados de tecido adiposo humano aumentaram a sobrevida de camundongos duplo mutantes para distrofina e utrofina (dko). Dessa forma, este trabalho pretendeu comparar o potencial terapêutico de CTAs mesenquimais e pericitos de um mesmo tecido adiposo em camundongos dko. Conseguimos confirmar o resultado anterior, mostrando que os pericitos tendem a melhorar a sobrevida de animais tratados, sendo ainda melhores do que células mesenquimais, mas a melhora perdura somente durante o tratamento. A sobrevida é maior no começo do tratamento, sugerindo que o quanto antes o tratamento for iniciado, com animais mais jovens e sintomas mais leves, melhor poderá ser o resultado. Outras perguntas a serem pesquisadas na tentativa de melhorar o efeito terapêutico da terapia celular com pericitos são: número de injeções, quantidade de células a serem injetadas, tempo de tratamento e idade das células \"doadoras\" / Progressive muscular dystrophies (PMD) are inherited genetic diseases characterized by progressive muscle loss and weakness. Duchenne muscular dystrophy (DMD) is the most common and aggressive form of PMD, with incidence of 1 in every 3500-5000 boys. In general, patients with DMD are confined to wheelchairs around 9-12 years of age and death occurs due to respiratory and heart dysfunction after the second decade. Cell therapy research at first aimed to recover or slow down the dystrophic process by repopulating the patient\'s muscle with normal cells. However, nowadays it is believed also that therapeutic benefits occur by the anti-inflammatory, anti-fibrotic and immunomodulation properties of mesenchymal stem cells (MSC). MSC are constituted by an heterogeneous cell population and therefore, cell sorting of the subpopulation cell of interest is being done routinely. By doing this enrichment, the effect can be more robust and powerful. One of the cell populations of interest for research is pericyte, which are cells well defined regarding their in vivo function and location, as opposed to MSC. Besides that, pericytes derived from adipose tissue were successful in increasing survival of double knockout mice for dystrophin and utrophin (dko). The present work aimed to compare the therapeutic potential of MSC and pericytes derived from the same adipose tissue sample in the dko mouse model. We confirmed our previous results, showing that pericytes tend to improve the survival of treated mice, and are even better than MSC from the same source but the trend was statistically significant only during the treatment period. Additionally, we also observed that the survival was better in the beginning of treatment, suggesting that earlier treatment may lead to a better therapeutic effect. In an attempt to increase the therapeutic effect of these procedure other questions to be asked are: the number of injections and number of cells per injection, the duration of the treatment and the \"age\" of the donor cells

Novas abordagens terapêuticas vêm sendo introduzidas para doenças musculares genéticas como distrofias musculares e miopatias congênitas, distúrbios que permanecem sem cura até o momento. Estes recentes avanços motivaram um interesse renovado e crescente por métodos não invasivos para a caracterização e monitoramento do músculo afetado, particularmente durante e após intervenções terapêuticas. Neste contexto, modelos animais são essenciais para uma melhor compreensão dos mecanismos das doenças e para testar novas terapias. Recentemente, avanços significativos na avaliação não invasiva de modelos murinos para doenças musculares genéticas foram alcançados. Entretanto, diversas linhagens de camundongos ainda não foram caracterizadas de maneira não invasiva, e ainda é necessário o desenvolvimento de métodos sensíveis para a identificação precoce de alterações sutis no músculo de camundongos afetados. A proposta desta tese é aplicar técnicas não invasivas inovadoras no estudo do músculo de modelos murinos para doenças musculares genéticas com fenótipos variados. Três modelos murinos para distrofias musculares (mdx, Largemyd, mdx/ Largemyd) e um modelo murino para miopatia congênita (KI-Dnm2R465W) foram estudados com métodos de Ressonância Magnética Nuclear (RMN). Duas linhagens distróficas (Largemyd, mdx/ Largemyd) e camundongos normais após injúria foram estudados através de micro-Tomografia Computadorizada (micro-CT). Em RMN, todas as linhagens de camundongos afetados apresentaram aumento de T2 muscular, o que foi relacionado a diversas anomalias na análise histológica, como necrose e inflamação, mas também a conjuntos de fibras em regeneração ou a fibras com citoarquitetura alterada. A combinação de RMN com análise de textura permitiu a identificação não ambígua de todas as linhagens distróficas, sendo que apenas a comparação dos valores de T2 muscular não permitiu esta diferenciação. Camundongos mdx mostraram alterações funcionais e morfológicas na rede vascular do músculo. Estudo piloto em camundongos KI-Dnm2R465W revelou tendências de comprometimento da função muscular. Por fim, imagens de micro-CT não permitiram a detecção de diferenças na composição muscular em camundongos distróficos. Este conjunto de resultados não apenas enriquece o painel de modelos murinos para doenças musculares genéticas caracterizados de maneira não invasiva, mas também demonstra um certo grau de especificidade nas anomalias observadas nas imagens, como revelado pela análise de textura. Estes resultados também mostraram que métodos não invasivos de RMN podem ser suficientemente sensíveis para identificar alterações sutis no fenótipo muscular murino, mesmo em estágios precoces. Esta tese foi desenvolvida sob acordo de co-tutela internacional entre a França e o Brasil, e compreendeu uma importante transferência de conhecimento, com os primeiros estudos não invasivos de músculo murino realizados no Brasil. / Novel therapeutic approaches are being introduced for genetic muscle diseases such as muscle dystrophies and congenital myopathies, all of them having remained without cure so far. These recent developments have motivated a renewed and augmented interest in non-invasive methods for muscle characterization and monitoring, particularly during and after therapeutic intervention. In this context, animal models are essential to better understand the disease mechanisms and to test new therapies. Recently, significant advances in the non-invasive evaluation of mouse models for genetic muscle diseases have been achieved. Nevertheless, there were still several mouse strains not characterized non-invasively, and it was necessary to develop sensitive methods to identify subtle alterations in the murine affected muscle. The purpose of this thesis was to apply non-invasive techniques in the study of murine models for genetic muscle diseases with variable phenotypes. Three mouse models for muscle dystrophy (mdx, Largemyd, mdx/ Largemyd) and one mouse model for congenital myopathy (KI-Dnm2R465W) were studied with Nuclear Magnetic Resonance (NMR) methods. Two dystrophic strains (Largemyd, mdx/ Largemyd) and normal mice after injury were studied through micro-Computed Tomography (micro-CT). On NMR, all affected mouse strains presented increased muscle T2, which could be related to variable features in the histological evaluation, including necrosis and inflammation, but also to clusters of fibers under regeneration or with altered cytoarchitecture. The combination of NMR and texture analyses allowed the unambiguous differential identification of all the dystrophic strains, although it was not feasible when comparing the muscle T2 measurements only. Mdx mice showed functional and morphological alterations of vascular network. In the KI-Dnm2R465W mice, a pilot study revealed tendencies of functional impairment. Finally, micro-CT images were unable to detect differences in muscle´s content in dystrophic mice. Altogether, these results not only increased the number of murine models for genetic muscle diseases non-invasively characterized, it also demonstrated some degree of specificity of the imaging anomalies, as revealed by texture analysis. It also showed that non-invasive NMR methods can be sensitive enough to identify subtle alterations in murine muscle phenotype, even in early stages. This thesis was developed under an international joint supervision between France and Brazil, and comprised an important transfer of technology, with the first non-invasive studies of murine muscles performed in Brazil.

A miostatina é um agente regulador negativo do crescimento muscular. Na terapia de suplementação com testosterona observou-se diminuição na expressão da miostatina. Este trabalho tem como objetivo determinar a influência do esteróides anabolizantes na expressão do gene da miostatina em camundongos normais, C57BL e no modelo distrófico Largemyd. Utilizamos a técnica de PCR em tempo real, para determinarmos a expressão relativa dos genes. Os animais tratados apenas com esteróide apresentaram aumento significativo em sua massa corpórea, com melhora de desempenho nas avaliações funcionais no Largemyd. Não foram observadas diferenças significativas na expressão do genes da miostatina no músculo normal e distrófico. Concluímos que o uso do esteróide anabolizante foi benéfico para o aumento na força do modelo Largemyd, mas o aumento de massa corpórea nestes animais, como no camundongo normal, não deveu-se a inibição da expressão da miostatina. / Myostatin is a negative regulator agent of muscle growth. In the testosterone supplementation therapy we observed decreased myostatin expression. The aim of this project is to determine the influence of anabolic steroids in the expression of myostatin gene in normal C57BL mice and in the dystrophic model Largemyd. We used the Real Time PCR assay to determine the relative expression of genes. Animals treated only with steroids presented significant increase in body mass and Largemyd showed improvement in the functional evaluations. There werent significant differences in the myostatin gene expression in the normal and dystrophic muscle. We concluded that the use of anabolic steroid was benefic to the increase of the strength in the Largemyd model, but the increase of body mass in these animals, as in the normal mice, is not related to the inhibition of myostatin expression.

The CRISPR-Cas9 gene editing system gives researchers the ability to manipulate and edit DNA with unprecedented ease and precision. It was discovered in bacteria as part of their adaptive immune system, but has been reengineered to target any double stranded DNA. This burgeoning molecular tool has created great excitement as scientists are rapidly adopting it to study fields including human gene therapy, disease modeling, agriculture, gene drive in mosquitos, and many others. This paper will explore the potential impact of CRISPR-Cas9 in human therapeutics. Specifically, the potential of CRISPR-Cas9 to treat Duchenne Muscular Dystrophy will be examined. In several ways, this debilitating degenerative disease is an ideal candidate for gene-editing with CRISPR-Cas9. Recent progress in the lab has demonstrated the gene editing system’s ability to rescue dystrophin protein levels in vivo. Although CRISPR-Cas9 holds great promise for previously incurable diseases, there are still many limitations that must be overcome before the gene editing system can be used in patients. This paper will discuss these barriers as well as recent advancements to overcome them.

As Distrofias Musculares Progressivas constituem um grupo de doenças genéticas caracterizadas por uma degeneração progressiva e irreversível da musculatura esquelética. As diferentes abordagens terapêuticas propostas para esse grupo de doenças têm como enfoque restaurar a proteína muscular deficiente por meio da terapia celular ou terapia gênica, ou o tratamento dos sinais e sintomas patológicos do músculo pela administração de fármacos e/ou fatores de crescimento. A combinação de diferentes estratégias pode aumentar a eficiência do reparo muscular. Deste modo, este trabalho tem como objetivo principal avaliar o potencial terapêutico das célulastronco mesenquimais (MSCs) associadas ao fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-1) para diferentes tipos de distrofias musculares. Inicialmente avaliamos o potencial miogênico de MSCs humanas de cordão umbilical in vitro. Nossos resultados demonstraram que os fatores solúveis liberados pelo músculo distrófico de camundongos mdx foram capazes de induzir a diferenciação miogênica terminal das células-tronco. Além disso, verificamos que o IGF-1, por si só, é capaz de promover a miogênese de MSCs, com mais eficiência que os protocolos de indução padrões. Ainda nos estudos in vitro, demonstramos que MSCs são capazes de interagir com células musculares de pacientes com Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) e restaurar a expressão de distrofina, quando cultivadas em meios suplementados com IGF-1. Frente a estes resultados, prosseguimos com os estudos em modelos animais, in vivo, e demonstramos que as MSCs humanas de cordão umbilical e IGF-1, quando administrados conjuntamente por via sistêmica, são capazes de modular a inflamação, reduzir a fibrose, aumentar o reparo muscular e, consequentemente, promover uma melhora clínica significativa do músculo de camundongos LAMA2dy/2j - modelo murino de Distrofia Muscular Congênita. Cabe ressaltar que as células humanas não foram rejeitadas após administração sistêmica em modelos animais não imunossuprimidos. Esses resultados suportam o potencial uso combinado de MSCs de cordão umbilical humano e IGF-1 no tratamento de distrofias musculares. Contudo, a confirmação destes dados em um modelo animal de grande porte, como os modelos caninos de distrofia muscular, é de extrema importância visando o entendimento dos mecanismos envolvidos no reparo muscular e avaliação de eventuais efeitos adversos, o que pode representar um passo importante para o início dos testes clínicos em pacientes / Progressive muscular dystrophies are a clinically and genetically heterogeneous group of disorders caused by the deficiency or abnormal muscle proteins, resulting in progressive degeneration and loss of skeletal muscle function. Strategies for the development of a muscular dystrophy therapy have focused on the possibility of restoring the defective muscle protein by cell therapy or on delivery of growth factors to treat or ameliorate muscular pathology symptoms. Combining both strategies could be a very useful approach to enhance the efficiency of muscle repair. The aim of this study is to evaluate the therapeutic potential of human mesenchymal stem cells (MSCs) from umbilical cord tissue combined with IGF-1 for muscle regeneration. Firstly, we verified the myogenic potential of these cells in vitro. Our results demonstrated that the soluble factors released from mdx dystrophic muscle were able to promote the myogenic differentiation of MSCs. Moreover, we showed that IGF-1 is capable of enhancing considerably the myogenesis of human MSCs from UC in vitro. More interestingly, we showed that IGF-1 enhances the interaction of MSCs and DMD muscle cells in coculture and the restoration of dystrophin expression. Subsequently, our in vivo studies revealed that the association of IGF-1 and MSCs markedly reduced muscle inflammation and fibrosis, and significantly improved muscle strength in LAMA2dy/2j mice, a murine model for congenital muscular dystrophy. It is important to point out that human cells are not rejected even in xenotransplants without immunosuppression. In summary, our results suggest that a combinatorial strategy of both IGF-1 and MSCs could enhance the efficiency of muscle repair and, therefore, should be further tested as a potential therapeutic approach in muscular dystrophies. However it is important to repeat the experiments on canine dystrophic model (GRMD; Golden Retriever Muscular Dystrophy) - in order to enhance our knowledge about the mechanism involved in muscle repair and monitor any eventual long-term side effects, which could represent an important point to start the clinical trial in patients

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第22369号 / 医博第4610号 / 新制||医||1043(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 大森 孝一, 教授 富樫 かおり, 教授 山下 潤 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM