Com base na interação especifica entre o fator de iniciação eucariótico 4E (eIF4E) e o 5’ CAP monometilguanosina (MMGcap) do mRNA foi desenvolvido um eficiente sistema para purificação de mRNA usando um mutante da proteína humana eIF4E. Apesar de o MMGcap ser o mais comum nos mRNAs eucarióticos, em nematoides e platelmintos devido ao processo de trans-splicing há também a presença do 5’ CAP trimetilguanosina (TMGcap). Tendo em vista a capacidade única da eIF4E de helmintos em interagir com ambos MMGcap e TMGcap, nesse trabalho foram analisadas as sequências peptídicas das eIF4E de platelmintos e a aplicação da proteína recombinante eIF4E de Echinococcus granulosus como uma ferramenta para o enriquecimento de amostras com mRNAs a partir de RNA total do parasito. As sequências preditas das eIF4E de platelmintos foram obtidas para 18 platelmintos parasitos e apenas uma isoforma da proteína foi encontrada em cada organismo. Na análise filogenética, essas proteínas formaram um ramo único e divergente, inclusive dos platelmintos de vida livre. A sequência codificante da proteína eIF4E de E. granulosus foi clonada por recombinação in vivo e a proteína recombinante (EgReIF4E) em fusão com a glutationa S-transferase (GST) foi expressa em Escherichia coli. A proteína em fusão foi recuperada a partir da fração solúvel por cromatografia de afinidade, sendo obtido o rendimento de 12,8 mg de proteína por 1 L de cultura. No ensaio de captura de mRNAs através do 5’ CAP pela GST-EgReIF4E foi usado RNA total de E. granulosus e de E. ortleppi. A capacidade da EgReIF4E em capturar mRNAs foi avaliada por RT-qPCR de forma comparativa ao RNA total e aos resultados obtidos de um kit comercial de Oligo-dT. Foram avaliados tanto os genes relacionados ao processo de trans-splicing como os genes que não passam por este processo. Também foi avaliado a presença dos rRNAs nas amostras. Nossos dados preliminares indicam que a EgReIF4E foi capaz de purificar os mRNAs e reduzir os níveis dos rRNAs. Porém, houve perdas significativas de mRNAs, que precisam ser corrigidas. Apesar de promissora para platelmintos, a aplicação dessa metodologia precisa ser melhor padronizada visando o aumento do rendimento global do sistema. / Based on the specific interaction between the eukaryotic initiation factor 4E (eIF4E) and the mRNA 5 'CAP monometilguanosina (MMGcap), an efficient system for mRNA purification using a mutant of the human protein eIF4E has been developed. Despite of the MMGcap be the most common in eukaryotic mRNAs, in in parasitic nematodes and flatworms due to the trans-splicing process there is also the 5 'CAP trimetilguanosina (TMGcap). Due to this peculiarity and unique ability of the helminthes eIF4E in interacting with both MMGcap and TMGcap, in this work was analyzed the sequences of eIF4E from flatworms and evaluated the using of eIF4E from E. granulosus (Eg-eIF4E) be used as a tool for purification of mRNA derived from total RNA of the parasite. The predicted sequence of the eIF4E flatworms was obtained for 18 parasitic flatworms and only one protein isoform was found for each species. In phylogenetic analysis of these proteins was formed a unique and divergent branch, even when compared with the free-living flatworms. The coding sequence of the E. granulosus eIF4E protein was cloned by in vivo recombination and the recombinant protein (EgReIF4E) fused to glutathione S-transferase (GST) was expressed using Escherichia coli. The fusion protein was recovered from the soluble fraction by affinity chromatography and the yield was 12.8 mg of protein per 1 L of culture. For the mRNAs capture assay using the 5 'CAP by GST-EgReIF4E were used total RNA from E. granulosus and E. ortleppi. The ability of EgReIF4E to capture mRNAs was evaluated by RT-qPCR compared with the total RNA and the results obtained with the commercial Oligo-dT kit. For comparison and analyzed were selected both genes related to trans-splice process as genes that do not undergo this process. The levels of rRNAs in the samples were also assessed. Our preliminary data indicate that EgReIF4E was able to purify the mRNAs and reduce the levels of rRNA. However, there was a significant loss in the level of mRNAs and it need to be adjusted. Despite of being a promising for flatworms, the implementation of this alternative methodology should be further standardized to increase the overall efficiency of the system.

O termo proteoformas refere-se a todas as formas moleculares na qual variantes proteicas codificadas por um único gene podem ser encontradas, incluindo mudanças devido a variação genética, splicing alternativo e modificações cotraducionais e póstraducionais (MCTs e MPTs, respectivamente). Em Echinococcus granulosus, o agente causador da hidatidose cística, a caracterização de proteoformas ainda não foi sistematicamente abordada e pode revelar mecanimos moleculares relevantes para o estabelecimento do parasito nos hospedeiros intermediários. A caracterização tanto de proteoformas da frutose-bifosfato-aldolase (FBA) e enolase, potencialmente moonlighting, como de outras proteoformas expressas em frações subcelulares do estágio larval deste parasito foi realizada. Em relação às enzimas glicolíticas, várias evidências indicam a EgFBA1 e a EgEno1 como sendo proteínas moonlighting: (i) as localizações não usuais destas proteínas no tegumento de protoescólices e em produtos de excreção/secreção (ES) in vivo (líquido hidático) e in vitro; (ii) características estruturais destas proteínas, com destaque para a identificação de um sítio de ligação à F-actina na estrutura da EgFBA1; (iii) a habilidade destas proteínas de interagirem com várias proteínas não relacionadas à glicólise. Em relação ao repertório de proteínas expressas em frações subcelulares, frações nucleares e citosólicas de protoescólices de E. granulosus foram analisadas através de proteômica top down e bottom up. De modo geral, 525 proteínas foram identificadas, sendo 224 e 156 proteínas exclusivamente detectadas em frações nucleares e citosólicas, respectivamente. Além da identificação de proteínas, nossa abordagem de proteômica top down também permitiu a caracterização de MCTs e MPTs, destacando a excisão da metionina N-terminal e a acetilação N-terminal como modificações conservadas nas proteínas de E. granulosus. Nossos resultados representam as primeiras evidências de funções alternativas realizadas por enzimas glicolíticas em E. granulosus e sugerem que proteínas multifuncionais devem desempenhar papéis importantes na interação parasitohospedeiro. Os proteomas nuclear e citosólico de protoescólices também foram descritos, revelando novos aspectos da biologia do parasito, incluindo proteoformas com MCTs e MPTs, as quais devem desempenhar papéis críticos na regulação de processos celulares deste parasito. / The term proteoforms refers to all molecular forms in which the protein product of a single gene can be found, including changes due to genetic variation, alternatively spliced RNA transcripts and co-translational and post-translational modifications (CTMs and PTMs, respectively). In Echinococcus granulosus, the causative agent of hydatid disease, the characterization of proteoforms has never been systematically addressed and it may reveal molecular mechanisms underlying the parasite biology. Here, the characterization of fructose-bisphosphate aldolase (FBA) and enolase proteoforms, potentially moonlighting, and also, the identification and characterization of proteoforms expressed in subcellular fractions of E. granulosus larval stage were performed. In relation to the glycolytic enzymes, several evidences indicate EgFBA1 and EgEno1 as moonlighting proteins: (i) their unusual locations in protoscolex tegument and in in vivo (hydatid fluid) and in vitro excretory/secretory (ES) products; (ii) their structural features, highlighting the F-actin binding site in the EgFBA1 structure; (iii) their ability to interact with several proteins non-related to glycolysis. In relation to the repertoire of proteins expressed in subcellular fractions, nuclear and cytosolic fractions from E. granulosus protoscoleces were analyzed by top down and bottom up proteomics for protein identification and characterization. Altogether, 525 proteins were identified, with 224 and 156 proteins exclusively detected in nuclear and cytoplasmic fractions, respectively. Besides protein identification, our top down approach also provided CTMs and PTMs characterization, highlighting N-terminal methionine excision and N-terminal acetylation as conserved modifications in E. granulosus proteins. Overall, our results provided the first experimental evidences of alternative functions performed by glycolytic enzymes in E. granulosus and suggested that multifunctional proteins might play important roles in hostparasite interplay. We also provided the description of nuclear and cytosolic proteomes which revealed new aspects of parasite biology, highlighting proteoforms with CTMs and PTMS which might be playing critical roles in regulating cellular processes occurring in this parasite species.

O Echinococcus granulosus é um platelminto parasita da classe Cestoda, que tem, como hospedeiros definitivos, os canídeos, e, como hospedeiros intermediários mais comuns, ungulados domésticos e o homem. Este parasito é o agente etiológico da hidatidose cística, zoonose hiperendêmica no Cone Sul da América do Sul, incluindo o sul do Brasil. Para o estabelecimento e manutenção do cisto hidático por longos períodos de tempo (infecção crônica), o parasito secreta e expõe ao seu hospedeiro numerosas proteínas, que podem apresentar tanto atividade imunomoduladora, como estar relacionadas a atividades fisiológicas do parasito. As proteínas 14-3-3 constituem uma família altamente conservada de moléculas reguladoras eucarióticas, que são capazes de interagir com diferentes proteínas ligantes em diversos contextos celulares, regulando funções biológicas complexas. Em E. granulosus, foram identificadas cinco proteínas 14-3-3, sendo três isoformas ζ e duas isoformas ε. Essas proteínas podem estar envolvidas em interações parasito-hospedeiro que propiciam o estabelecimento e o desenvolvimento da forma larval patogênica (metacestódeo). Para a futura caracterização funcional da proteína 14-3-3e1 de E. granulousus (Eg14-3-3ε1), já detectada em componentes do metacestódeo, a sua sequência codificadora foi expressada em Escherichia coli. A clonagem foi realizada em dois vetores plasmidiais distintos (pGEX-TEV e pET-26b), para permitir a expressão em E. coli da proteína Eg14-3-3ε1 recombinante no citoplasma, em fusão com a GST, e no espaço periplásmatico, com cauda de histidina, respectivamente. A solubilização da Eg14-3-3ε1 em fusão com a GST foi obtida com 0,5% de sarcosil, mas no entanto não foi possível a sua purificação. A proteína Eg14-3-3ε1 com cauda de histidina foi obtida por extração da fração periplasmática seguida da purificação por cromatografia de afinidade, tendo sido obtido um rendimento final de 0,5 mg/l de cultura. A proteína Eg14-3-3ε1 recombinante purificada será futuramente utilizada em ensaios funcionais, buscando inicialmente a identificação de seus ligantes proteicos dentre o repertório de proteínas do parasito e do hospedeiro, no contexto da infecção crônica. / Echinococcus granulosus is a parasitc platyhelminth of the Cestoda class, wich has, canids as definitive hosts, domestic ungulates and humans as intermediate hosts. This parasite is the causative agent of cystic hydatid disease, a hyperendemic zoonosis in the Southern Cone of South America, including Southern Brazil. In order to the establishment and maintenance of hydatid cyst for a long period of time, the parasite secrets and exposes to its host numerous proteins, which may have immunomodulatory activity as well to be related to physiological activities of the parasite. The 14-3-3 proteins are a family of highly conserved eukaryotic regulatory molecules that are able to interact with different partner proteins in different cellular contexts, regulating complex biological functions. In E. granulosus five 14-3-3 proteins have been identified, three ζ isoform and two ε isoform. These proteins may be involved in host-parasite interactions that favor the establishment and growth of the pathogenic larval form (metacestode). For future functional characterization of the 14-3-3ε1 protein from E. granulousus (Eg14-3-3ε1) previously detected in metacestode components, its coding sequence was expressed in Escherichia coli. The cloning was done into two different plasmid vectors (pGEX-TEV and pET-26b), to produce recombinant Eg14-3-3ε1 protein in E. coli, in the cytoplasm, in fusion with GST, and periplasmatic with histidine tail, respectively. Solubilization of Eg14-3-3ε1 fused with GST was achieved with 0.5% sarcosil, yet it was not possible to purify it. The Eg14-3-3ε1 protein with histidine tail was obtained by extracting the periplasmic fraction from E. coli cultures, followed of purification by affinity chromatography, yielding 0.5 mg/l. The recombinant Eg14-3-3ε1 protein will be used in functional assays, initially aiming at the identification of protein ligands from the repertoire of proteins from the parasite and from host in the context of chronic infection.

O termo proteoformas refere-se a todas as formas moleculares na qual variantes proteicas codificadas por um único gene podem ser encontradas, incluindo mudanças devido a variação genética, splicing alternativo e modificações cotraducionais e póstraducionais (MCTs e MPTs, respectivamente). Em Echinococcus granulosus, o agente causador da hidatidose cística, a caracterização de proteoformas ainda não foi sistematicamente abordada e pode revelar mecanimos moleculares relevantes para o estabelecimento do parasito nos hospedeiros intermediários. A caracterização tanto de proteoformas da frutose-bifosfato-aldolase (FBA) e enolase, potencialmente moonlighting, como de outras proteoformas expressas em frações subcelulares do estágio larval deste parasito foi realizada. Em relação às enzimas glicolíticas, várias evidências indicam a EgFBA1 e a EgEno1 como sendo proteínas moonlighting: (i) as localizações não usuais destas proteínas no tegumento de protoescólices e em produtos de excreção/secreção (ES) in vivo (líquido hidático) e in vitro; (ii) características estruturais destas proteínas, com destaque para a identificação de um sítio de ligação à F-actina na estrutura da EgFBA1; (iii) a habilidade destas proteínas de interagirem com várias proteínas não relacionadas à glicólise. Em relação ao repertório de proteínas expressas em frações subcelulares, frações nucleares e citosólicas de protoescólices de E. granulosus foram analisadas através de proteômica top down e bottom up. De modo geral, 525 proteínas foram identificadas, sendo 224 e 156 proteínas exclusivamente detectadas em frações nucleares e citosólicas, respectivamente. Além da identificação de proteínas, nossa abordagem de proteômica top down também permitiu a caracterização de MCTs e MPTs, destacando a excisão da metionina N-terminal e a acetilação N-terminal como modificações conservadas nas proteínas de E. granulosus. Nossos resultados representam as primeiras evidências de funções alternativas realizadas por enzimas glicolíticas em E. granulosus e sugerem que proteínas multifuncionais devem desempenhar papéis importantes na interação parasitohospedeiro. Os proteomas nuclear e citosólico de protoescólices também foram descritos, revelando novos aspectos da biologia do parasito, incluindo proteoformas com MCTs e MPTs, as quais devem desempenhar papéis críticos na regulação de processos celulares deste parasito. / The term proteoforms refers to all molecular forms in which the protein product of a single gene can be found, including changes due to genetic variation, alternatively spliced RNA transcripts and co-translational and post-translational modifications (CTMs and PTMs, respectively). In Echinococcus granulosus, the causative agent of hydatid disease, the characterization of proteoforms has never been systematically addressed and it may reveal molecular mechanisms underlying the parasite biology. Here, the characterization of fructose-bisphosphate aldolase (FBA) and enolase proteoforms, potentially moonlighting, and also, the identification and characterization of proteoforms expressed in subcellular fractions of E. granulosus larval stage were performed. In relation to the glycolytic enzymes, several evidences indicate EgFBA1 and EgEno1 as moonlighting proteins: (i) their unusual locations in protoscolex tegument and in in vivo (hydatid fluid) and in vitro excretory/secretory (ES) products; (ii) their structural features, highlighting the F-actin binding site in the EgFBA1 structure; (iii) their ability to interact with several proteins non-related to glycolysis. In relation to the repertoire of proteins expressed in subcellular fractions, nuclear and cytosolic fractions from E. granulosus protoscoleces were analyzed by top down and bottom up proteomics for protein identification and characterization. Altogether, 525 proteins were identified, with 224 and 156 proteins exclusively detected in nuclear and cytoplasmic fractions, respectively. Besides protein identification, our top down approach also provided CTMs and PTMs characterization, highlighting N-terminal methionine excision and N-terminal acetylation as conserved modifications in E. granulosus proteins. Overall, our results provided the first experimental evidences of alternative functions performed by glycolytic enzymes in E. granulosus and suggested that multifunctional proteins might play important roles in hostparasite interplay. We also provided the description of nuclear and cytosolic proteomes which revealed new aspects of parasite biology, highlighting proteoforms with CTMs and PTMS which might be playing critical roles in regulating cellular processes occurring in this parasite species.

Os fatores que afetam a susceptibilidade a infecção com E. granulosus são pouco conhecidos. Neste trabalho, foi avaliada a interação de protoescólices e um antígeno imunodominante secretado (AgB) de E. granulosus com neutrófilos humanos saudáveis. A intensidade de expressão de CD11b e produção de H2O2 foram avaliadas por citometria de fluxo usando sangue total. Os neutrófilos isolados também foram incubados com protoescólices ou AgB, e a interleucina 8 (IL-8) foi determinada por ELISA de captura. Os protoescólices induziram um aumento significativo na expressão de CD11b em neutrófilos (p=0,026) e na produção de H2O2 (p=0,026), entretanto a sua viabilidade não foi afetada. Em contraste, nenhum efeito foi observado com o AgB em ambos ensaios. Uma moderada produção de IL-8 foi detectada somente em sobrenadantes de neutrófilos cultivados com protoescólices comparada com a produção basal (p=0,028). O efeito de uma incubação prévia com o AgB foi avaliada em relação a expressão de CD11 e H2O2 induzida pelo tratamento dos neutrófilos com forbol meristato acetato (PMA). Nenhuma mudança foi observada na expressão de CD11b, entretanto, a intensidade de produção de H2O2 foi significantemente reduzida em comparação ao tratamento apenas com PMA (p=0,038) quando o fator ativador de plaquetas (PAF) foi usado como priming. Como os protoescólices ocasionalmente podem ser liberados dos cistos em compartimentos do hospedeiro causando a hidatidose secundária, estes resultados contribuem para elucidação da defesa do hospedeiro e dos mecanismos imunomoduladores do parasito. A identificação de produtos de secreção e/ou excreção de protoescólices de E. granulosus também foi avaliada neste trabalho. Os produtos de secreção e/ou excreção foram obtidos a partir das primeiras 48 h de cultivo de protoescólices in vitro. A caracterização imunológica foi feita por western blotting com um pool de soros de indivíduos infectados com hidatidose cística. Os produtos de secreção e/ou excreção também foram analisados por espectrometria de massas. As preparações de seis diferentes amostras de protoescólices continham componentes protéicos, os quais foram visualizados por SDS-PAGE com aparentes massas moleculares entre 10 e 200 kDa. Os ensaios de western blotting mostraram a presença de diversos antígenos imunogênicos de massas moleculares maiores (acima de 50 kDa), e do AgB. Os resultados de espectrometria de massas foram obtidos com um pool de seis amostras de sobrenadantes de cultivo contendo produtos de secreção e/ou excreção, e foram identificadas onze proteínas: malato desidrogenase, ciclofilina, miofilina, P-29, 14-3-3, enolase, duas serinoproteases, fosfoenolpiruvato carboxiquinase e tiorredoxina peroxidase. Estes resultados também podem contribuir para elucidação de novos aspectos da complexa interação parasito-hospedeiro, e de mecanismos imunomoduladores, uma vez que as proteínas secretadas podem estar diretamente envolvidas nesses processos. / The factors affecting innate susceptibility to infection with E. granulosus are little known. In this work, the interaction of healthy human neutrophils with protoscoleces and a secreted immunodominant antigen (AgB) of E. granulosus was assessed. The intensity of CD11b expression and H2O2 production were evaluated by flow cytometry using whole blood. Isolated neutrophils were incubated also with PSC or AgB and interleukin 8 (IL-8) was measured by capture ELISA. The protoscoleces induced a significant increment of CD11b expression in neutrophils (p=0.026) and of H2O2 production (p=0.026), however their viability was not affected. In contrast, no effect was observed with AgB in both assays. A moderate IL-8 production was detected only in supernatants from neutrophils cultured with protoscoleces compared with basal production (p=0.028). The effect of previous AgB incubation was evaluated in relation with CD11b and H2O2 expression induced by phorbol meristate acetate (PMA) treatment. No changes were observed with CD11 expression, however the magnitude of H2O2 production was significant decreased in comparison with PMA alone (p=0.038) when platelet–activating factor was used for priming. As protoscoleces occasionally spillaged from cysts into compartments of the host causing secondary cysts, these results contribute to the elucidation of the host defense and parasite immunomodulatory mechanisms involved. The identification of excretory and/or secretory products from E. granulosus protoscoleces also was assessed in this work. Excretory and/or secretory products were obtained from the first 48 h maintenance of protoscoleces in vitro. Immunological characterization was performed by western blotting with a pool of sera from individuals infected by cystic hydatidosis. Excretory and/or secretory products also were assessed by mass spectrometry. The preparations of six differents sample of protoscoleces contained components proteins which could be distinguished by SDS-PAGE with apparent molecular masses between 10 and 200 kDa. The assays of western blotting showed the presence of the several immunogenic antigens of major molecular masses (above 50 kDa), and of the AgB. The results of the mass espectrometry were obtained with a pool of six cultive sobrenadants sample containing excretory and/or secretory products, and were identified eleven proteins: malate dehydrogenase, cyclofilin, myophilin, P-29, 14-3-3, enolase, tegumental protein, two serineproteases, phosphoenolpyruvate carboxykinase and thioredoxin peroxidase. These results can contribute also for elucidate novel aspects of the complex interaction host-parasite and of the immunomodulatory mechanisms, since that secreted proteins can be directly involved in these process.

A presença de microssatélites no genoma de Echinococcus granulosus foi verificada utilizando-se oito oligonucleotídeos com repetições como sondas (GT15, CT15, AT15, CG15, CAT10, CAA10, CGG10 e CATA10). Experimentos de hibridização revelaram que as repetições GT, CAA, CATA e CT são as mais frequentes no genoma de E. granulosus. As sondas AT e GC não apresentaram sinais de hibridização. Seis lócus contendo repetições CA/GT, quatro lócus contendo repetições GA/CT e oito lócus contendo repetições AAC/GGT foram clonados e sequenciados. O lócus Egmsca1 foi analisado em 73 isolados do Brasil e da Argentina cujas linhagens haviam sido previamente caracterizadas e em 27 isolados provenientes da Etiópia cujas linhagens ainda não foram identificadas. Os isolados brasileiros da linhagem bovina e os isolados argentinos da linhagem do camelo apresentaram-se monomórficos e compartilharam o alelo (CA)7. Isolados argentinos das linhagens da ovelha e da ovelha da Tasmânia compartilharam dois alelos [(CA)8 e (CA)10] com os isolados brasileiros da linhagem da ovelha. O alelo (CA)11 foi encontrado somente em isolados brasileiros da linhagem da ovelha em uma baixa frequência. O alelo (CA)9 ocorreu apenas em um isolado da Etiópia. As populações brasileira e argentina da linhagem da ovelha foram testadas em relação ao equilíbrio de Hardy-Weinberg e somente a primeira estava de acordo com as expectativas. Protoescólices isolados de um único cisto hidático não apresentaram polimorfismo, validando a utilização de protoescólices de um mesmo cisto, agrupados como um isolado, em estudos populacionais. Um microssatélite contendo repetições de pentanucleotídeos, contido no complexo gênico do snRNA U1, também foi isolado. Este estudo descreve pela primeira vez o isolamento e caracterização de microssatélites em E. granulosus.

In 2012 the tapeworm Echinococcus multilocularis in naturally infected red fox were investigated in selected regions of Karlovy Vary. From January to December 2013, in areas with the highest prevalence, delivery baits containing the anthelmintic (80 g of fish flesh + 50 mg Praziquantel- Drontal plus flavour) in an amount of 50 baits per km2. In 2014 the inspection was carried out investigations and subsequent comparison prevalence of tapeworm in the monitored areas between 2012 and 2014, ie. before and after the delivery of anthelmintic baits. The observed prevalence of Echinococcus multilocularis in foxes before delivery baits was 80% (12/15), after delivery baits was 10.5% (2/19). Furthermore, an analysis of infected intestinal tissue foxes and foxes uninfected with Echinococcus multilocularis for determining the concentrations of selected elements (Cd, Cr, Cu, Fe, Mn, Ni, Pb, Zn). Foxes with this tapeworm exhibited in the intestinal mucosa higher levels of the following elements: chromium (Cr), copper (Cu), iron (Fe), manganese (Mn), nickel (Ni), zinc (Zn). Conversely concentration primarily toxic elements (Cd and Pb) in the intestine infected foxes with Echinococcus multilocularis was lower than in the intestine foxes without this parasite.

A presença de microssatélites no genoma de Echinococcus granulosus foi verificada utilizando-se oito oligonucleotídeos com repetições como sondas (GT15, CT15, AT15, CG15, CAT10, CAA10, CGG10 e CATA10). Experimentos de hibridização revelaram que as repetições GT, CAA, CATA e CT são as mais frequentes no genoma de E. granulosus. As sondas AT e GC não apresentaram sinais de hibridização. Seis lócus contendo repetições CA/GT, quatro lócus contendo repetições GA/CT e oito lócus contendo repetições AAC/GGT foram clonados e sequenciados. O lócus Egmsca1 foi analisado em 73 isolados do Brasil e da Argentina cujas linhagens haviam sido previamente caracterizadas e em 27 isolados provenientes da Etiópia cujas linhagens ainda não foram identificadas. Os isolados brasileiros da linhagem bovina e os isolados argentinos da linhagem do camelo apresentaram-se monomórficos e compartilharam o alelo (CA)7. Isolados argentinos das linhagens da ovelha e da ovelha da Tasmânia compartilharam dois alelos [(CA)8 e (CA)10] com os isolados brasileiros da linhagem da ovelha. O alelo (CA)11 foi encontrado somente em isolados brasileiros da linhagem da ovelha em uma baixa frequência. O alelo (CA)9 ocorreu apenas em um isolado da Etiópia. As populações brasileira e argentina da linhagem da ovelha foram testadas em relação ao equilíbrio de Hardy-Weinberg e somente a primeira estava de acordo com as expectativas. Protoescólices isolados de um único cisto hidático não apresentaram polimorfismo, validando a utilização de protoescólices de um mesmo cisto, agrupados como um isolado, em estudos populacionais. Um microssatélite contendo repetições de pentanucleotídeos, contido no complexo gênico do snRNA U1, também foi isolado. Este estudo descreve pela primeira vez o isolamento e caracterização de microssatélites em E. granulosus.

O antígeno B (AgB) é uma proteína polimérica de aproximadamente 160 kDa secretada durante a fase larval dos parasitos do gênero Echinococcus. Sua função provavelmente está relacionada com a evasão da resposta imune do hospedeiro, e tem sido relatado que seus genes apresentam alta diversidade de seqüências, mesmo dentro de um único metacestóide de E. granulosus. Em E. multilocularis o AgB é codificado por uma família multigênica composta por pelo menos cinco genes. Neste trabalho nós avaliamos o efeito do sistema imune dependente de célula T sobre a diversificação somática dos genes do antígeno B em metacestóides de E. multilocularis obtidos de camundongos secundariamente infectados com microcistos: uma linhagem proficiente e outra não proficiente quanto à resposta imune celular (BALB/c e nude, respectivamente). Os animais foram sacrificados após um ou dois meses de infecção para coleta da massa parasitária e extração do RNA. Após a síntese do cDNA foram feitas PCRs específicas para quatro genes (EmAgB1, EmAgB2, EmAgB3 e EmAgB4) e o produto desta reação foi clonado. Os clones resultantes foram analisados quanto à presença de polimorfismo através de PCR-SSCP e os alelos descobertos foram seqüenciados. A diversidade alélica foi calculada através do Índice de Diversidade de Shannon e desvios da neutralidade foram testados através do Teste D de Tajima e através do Teste Exato de Fisher, que detecta excesso de mutações não-sinônimas em relação às mutações sinônimas. Um teste adicional, que calcula a probabilidade (através da distribuição binomial) de ocorrência das mutações não-sinônimas, foi realizado. Comparando a diversidade encontrada nos genes do AgB não encontramos evidências de que a pressão imposta pelo sistema imune esteja relacionada com a diversidade de seqüências encontrada em nosso estudo. O gene EmAgB2 apresentou Índices de diversidade mais elevados (principalmente quando coletado do camundongo BALB/c após um mês de infecção) e também apresentou maior quantidade de indels. Apenas um dos alelos encontrados em nossa amostragem foi compartilhado por parasitos coletados de diferentes camundongos, sugerindo que os alelos possam ter surgido após a infecção dos camundongos. O Teste D de Tajima resultou em valores negativos em todas as análises. Entretanto, nem o Teste Exato de Fisher nem a análise da probabilidade binomial encontraram excesso de mutações não sinônimas para qualquer dos genes analisados. Portanto, nossos dados indicam que os genes do AgB durante a fase de metacestóide evoluem segundo o modelo neutro e o valor D de Tajima negativo pode ser explicado devido a rápida proliferação celular do metacestóide após a infecção secundária. / The Antigen B (AgB) is a polymeric protein secreted during the larval stage of the Echinococcus flatworms. The AgB is involved with the evasion of host immune response and its genes show high variability, even inside a single E. granulosus metacestode. To date, five AgB genes have been reported in the E. multilocularis genome. In this work we analyzed the AgB diversification in E. multilocularis recovered from secondarily infected mice. Two different mouse strains were infected with microcysts of E. multilocularis: BALB/c and nude, which are T-Cell immune response proficient and non-proficient, respectively. The mice were necropsed one or two months post infection and the parasite mass was collected for RNA extraction. Following the cDNA synthesis, each AgB gene (EmAgB1, EmAgB2, EmAgB3 and EmAgB4) was amplified in a specific PCR and the products of these reactions were cloned. The polymorphism present in each AgB gene was assessed by PCR-SSCP and the variant alleles were sequenced. The allele diversity for each gene was calculated by the Shannon Diversity Index and neutrality departures were tested by Tajima’s D Test, and Fisher’s Exact Test, which evaluates the excess of non-synonymous over synonymous substitutions. An additional test, which estimates the binomial probability of occurrence of nonsynonymous mutations, was also performed. We did not find association between the AgB diversity and the immune response of the host. The EmAgB2 gene showed the largest diversity index among the four genes (especially when collected from BALB/c at first month post infection) and it also presented a large quantity of alleles containing indels. The parasites collected from different mice do not share AgB alleles (with a single exception), and suggest that the new alleles could have arisen after the mice infection. The Tajima’s D Test resulted in negative values in all analyses. However, both Fisher’s Exact Test and the binomial probability analysis did not detect excess of non-synonymous mutation in our samples. Therefore, our data suggest that AgB genes evolve by the neutral model during the metacestode stage, and the negative Tajima’s D value could be explained by the fast cellular proliferation of the metacestode after secondary infection.

A presença de microssatélites no genoma de Echinococcus granulosus foi verificada utilizando-se oito oligonucleotídeos com repetições como sondas (GT15, CT15, AT15, CG15, CAT10, CAA10, CGG10 e CATA10). Experimentos de hibridização revelaram que as repetições GT, CAA, CATA e CT são as mais frequentes no genoma de E. granulosus. As sondas AT e GC não apresentaram sinais de hibridização. Seis lócus contendo repetições CA/GT, quatro lócus contendo repetições GA/CT e oito lócus contendo repetições AAC/GGT foram clonados e sequenciados. O lócus Egmsca1 foi analisado em 73 isolados do Brasil e da Argentina cujas linhagens haviam sido previamente caracterizadas e em 27 isolados provenientes da Etiópia cujas linhagens ainda não foram identificadas. Os isolados brasileiros da linhagem bovina e os isolados argentinos da linhagem do camelo apresentaram-se monomórficos e compartilharam o alelo (CA)7. Isolados argentinos das linhagens da ovelha e da ovelha da Tasmânia compartilharam dois alelos [(CA)8 e (CA)10] com os isolados brasileiros da linhagem da ovelha. O alelo (CA)11 foi encontrado somente em isolados brasileiros da linhagem da ovelha em uma baixa frequência. O alelo (CA)9 ocorreu apenas em um isolado da Etiópia. As populações brasileira e argentina da linhagem da ovelha foram testadas em relação ao equilíbrio de Hardy-Weinberg e somente a primeira estava de acordo com as expectativas. Protoescólices isolados de um único cisto hidático não apresentaram polimorfismo, validando a utilização de protoescólices de um mesmo cisto, agrupados como um isolado, em estudos populacionais. Um microssatélite contendo repetições de pentanucleotídeos, contido no complexo gênico do snRNA U1, também foi isolado. Este estudo descreve pela primeira vez o isolamento e caracterização de microssatélites em E. granulosus.