Frankfurt (Main), University, Diss., 2008.

University, Diss., 2004--Potsdam.

Univ., Diss., 2008--Frankfurt (Main).

München, Techn. Univ., Diss., 2000.

Because of its complexity and intricacy, studying the nervous system is often challenging. Fortunately, the small nematode roundworm Caenorhabditis elegans is well established as a model system for basic neurobiological research. The C. elegans model is also the only organism with a supposedly complete connectome, an organism-wide map of synaptic connectivity resolved by electron microscopy, which provides some understanding of how the nervous system works as a whole. However, the number of available data-sets is small and the connectome contains errors and gaps. One example of this concerns electrical synapses. Electrical synapses are formed by gap junctions and difficult to map due to their often ambiguous morphology in electron micrographs, leading to misclassification or omission. On the other hand, chemical synapses are more easily mapped, but many aspects of their mode of operation remain elusive and their role in the C. elegans connectome is oversimplified. A comprehensive understanding of signal transduction of neurons between each other and other cells will be indispensable for a comprehensive understanding of the nervous system. In this thesis, I approach these challenges with a combination of advanced light and electron microscopy techniques. First, this thesis describes a strategy to increase synaptic specificity in connectomics. Specifically, I classify gap junctions with a high degree of confidence. To achieve this, I utilized array tomography (AT). In this thesis, AT is adapted for high-pressure freezing to optimize for structure preservation and for super-resolution light microscopy; in this manner, I aim to bridge the gap between light and electron microscopy resolutions. I call this adaptation super-resolution array tomography (srAT). The srAT approach made it possible to clearly identify and map gap junctions with high precision and accuracy. The results from this study showcased the feasibility of incorporating electrical synapses into connectomes in a systematic manner, and subsequent studies have used srAT for other models and questions. As mentioned above, the C. elegans connectomic model suffers from a shortage of datasets. For most larval stages, including the special dauer larval stage, connectome data is completely missing up to now. To obtain the first partial connectome data-set of the C. elegans dauer larva, we used focused ion-beam scanning electron microscopy (FIB-SEM). This technique offers an excellent axial resolution and is useful for acquiring large volumes for connectomics. Together with our collaborators, I acquired several data-sets which enable the analysis of dauer stage-specific “re-wiring” of the nervous system and thus offer valuable insights into connectome plasticity/variability. While chemical synapses are easy to map relative to electrical synapses, signal transduction via chemical transmitters requires a large number of different proteins and molecular processes acting in conjunction in a highly constricted space. Because of the small spatial scale of the synapse, investigating protein function requires very high resolution, which electron tomography provides. I analyzed electron tomograms of a worm-line with a mutant synaptic protein, the serine/threonine kinase SAD-1, and found remarkable alterations in several architectural features. My results confirm and re-contextualize previous findings and provide new insight into the functions of this protein at the chemical synapse. Finally, I investigated the effectiveness of our methods on “malfunctioning,” synapses, using an amyotrophic lateral sclerosis (ALS) model. In the putative synaptopathy ALS, the mechanisms of motor neuron death are mostly unknown. However, mutations in the gene FUS (Fused in Sarcoma) are one known cause of the disease. The expression of the mutated human FUS in C. elegans was recently shown to produce an ALS-like phenotype in the worms, rendering C. elegans an attractive disease model for ALS. Together with our collaboration partners, I applied both srAT and electron tomography methods to “ALS worms” and found effects on vesicle docking. These findings help to explain electrophysiological recordings that revealed a decrease in frequency of mini excitatory synaptic currents, but not amplitudes, in ALS worms compared to controls. In addition, synaptic endosomes appeared larger and contained electron-dense filaments in our tomograms. These results substantiate the idea that mutated FUS impairs vesicle docking and also offer new insights into further molecular mechanisms of disease development in FUS-dependent ALS. Furthermore, we demonstrated the broader applicability of our methods by successfully using them on cultured mouse motor neurons. Overall, using the C. elegans model and a combination of light and electron microscopy methods, this thesis helps to elucidate the structure and function of neuronal synapses, towards the aim of obtaining a comprehensive model of the nervous system. / Das Nervensystem ist ein definierendes Merkmal aller Tiere, unter anderem verantwortlich für Sinneswahrnehmung, Bewegung und „höhere“ Hirnfunktionen. Wegen dessen Komplexität und Feingliedrigkeit stellt das Erforschen des Nervensystems oft eine Herausforderung dar. Jedoch ist der kleine Fadenwurm Caenorhabditis elegans als Modellsystem für neurobiologische Grundlagenforschung gut etabliert. Erbesitzt eines der kleinsten und unveränderlichsten bekannten Nervensysteme. C.elegans ist auch das einzige Modell, für das ein annähernd vollständiges Konnektom vorliegt, eine durch Elektronenmikroskopie erstellte Karte der synaptischen Verbindungen eines gesamten Organismus, die Einblicke in die Funktionsweise des Nervensystems als Ganzes erlaubt. Allerdings ist die Anzahl der verfügbaren Datensätze gering und das Konnektom enthält Fehler und Lücken. Davon sind beispielsweise elektrische Synapsen betroffen. Elektrische Synapsen werden von Gap Junctions gebildet und sind auf Grund ihrer oft uneindeutigen Morphologie in elektronenmikroskopischen Aufnahmen schwierig zu kartieren, was dazu führt, dass einige falsch klassifiziert oder übersehen werden. Chemische Synapsen sind dagegen einfacher zu kartieren, aber viele Aspekte ihrer Funktionsweise sind schwer zu erfassen und ihre Rolle im Konnektom von C.elegans ist daher zu vereinfacht dargestellt. Ein umfassendes Verständnis der Signaltransduktion von Neuronen untereinander und zu anderen Zellen wird Voraussetzung für ein vollständiges Erfassen des Nervensystems sein. In der vorliegenden Arbeit gehe ich diese Herausforderungen mithilfe einer Kombination aus modernsten licht- und elektronenmikroskopischen Verfahren an. Zunächst beschreibt diese Arbeit eine Strategie, um die synaptische Spezifität in der Konnektomik zu erhöhen, indem ich Gap Junctions mit einem hohen Maß an Genauigkeit klassifiziere. Um dies zu erreichen, nutzte ich array tomography (AT), eine Technik, die Licht- und Elektronenmikrokopie miteinander korreliert. In dieser Arbeit wird AT adaptiert für Hochdruckgefrierung, um die Strukturerhaltung zu optimieren, sowie für ultrahochauflösende Lichtmikroskopie; so wird die Kluft zwischen den Auflösungsbereichen von Licht- und Elektronenmikroskopie überbrückt. Diese Adaption nenne ich super-resolution array tomography (srAT). Der srATAnsatz machte es möglich, Gap Junctions mit hoher Präzision und Genauigkeit klar zu identifizieren. Für diese Arbeit konzentrierte ich mich dabei auf Gap Junctions des retrovesikulären Ganglions von C.elegans. Die Ergebnisse dieser Studie veranschaulichen, wie es möglich wäre, elektrische Synapsen systematisch in Konnektome aufzunehmen. Nachfolgende Studien haben srAT auch auf andere Modelle und Fragestellungen angewandt ...

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Die Entwicklung und Herstellung neuer Materialsysteme gehört seit jeher zu den Triebkräften des technischen Fortschritts. Eine neue Klasse im Bereich der Legierungen, welche als Hochentropielegierungen (HEA) bezeichnet wird, gewinnt dabei seit etwa zehn Jahren zunehmend an Interesse. Konventionelle Legierungen besitzen einen Hauptbestandteil, welcher üblicherweise den Großteil der molaren Zusammensetzung ausmacht, wie z.B. Eisen im Stahl. Eine HEA hingegen zeichnet sich dadurch aus, dass mindestens vier verschiedene Elemente in ungefähr gleichen Volumenanteilen vorliegen. In diesem Fall kommt es zu einer deutlichen Zunahme der namensgebenden Mischungsentropie gegenüber der Enthalpie, was wiederum zur präferierten Bildung einphasiger, fester Lösungen anstelle von geordneten Metallphasen führt. Durch die nahezu unbegrenzte Anzahl möglicher Element- und Anteilskombinationen zur Bildung von HEAs ergibt sich ein mindestens ebenso großer Raum an potentiellen Anwendungen. Auf dem Gebiet der Materialwissenschaften wurden beispielsweise bereits HEAs mit herausragenden Verschleiß- und Korrosionseigenschaften demonstriert. Auch hinsichtlich Härte, Zug- und Umformfestigkeit oder Strahlungsbeständigkeit existieren vielversprechende Arbeiten, welche die hohe Anwendungsrelevanz von HEAs untermauern. Zahlreiche Herstellungsmethoden konnten dabei bereits erfolgreich auf HEAs angewandt werden, wobei alle Dimensionen, von wenige nm dünnen Schichten bis zu gegossenen oder gesinterten Volumenkörpern im cm-Bereich, abgedeckt werden. Der Einsatz moderner 3D-Drucktechnik erlaubt zudem die Kombination der herausragenden Materialeigenschaften von HEAs in komplex geformten Bauteilen. Trotz des hohen und noch immer rapide zunehmenden Forschungsinteresses an HEAs gibt es nur eine sehr überschaubare Anzahl an Arbeiten, die sich mit der gezielten Untersuchung struktureller, chemischer oder elektronischer Aspekte kristalliner HEA-Oberflächen auseinandersetzen. Ein Grund dafür ist die unzureichende Verfügbarkeit solcher Systeme, denn die Herstellung von großen Kristallen mit hoher Ordnung bedarf in der Regel sehr langsamer und wohl kontrollierter Züchtungsverfahren. Eine Möglichkeit, diesen Engpass zu überwinden, besteht im Wachstum epitaktischer Kristallfilme auf geeigneten Substraten. Deren Herstellung und Charakterisierung mittels Magnetronsputtern stellt einen der Schwerpunkte in dieser Arbeit dar, wobei die Legierung CoCrFeNi als Demonstrationsmaterial gewählt wurde. Zunächst werden zwei aus unterschiedlichen Ausgangsmaterialien gesinterte Arten der benötigten Sputtertargets analysiert und die davon abgeschiedenen Schichten untersucht. Die sich einstellenden Kristallphasen können mittels Röntgenbeugung, die chemische Zusammensetzung und Elementverteilung des Volumenmaterials durch energiedispersive Röntgenspektroskopie bestimmt werden. Eine zwei-Schritt-Präparation der Probenoberfläche, bestehend aus Ar+-Ionenbeschuss und anschließendem Heizen erlaubt die Analyse sauberer Oberflächen. An diesen kann mittels Photoelektronenspektroskopie die Oberflächenzusammensetzung und durch niederenergetische Elektronenbeugung eine etwaige Kristallstruktur untersucht werden. Durch die Zugabe weiterer Elemente soll exemplarisch die gezielte Modifikation einzelner Eigenschaften der gesputterten Dünnschichten untersucht werden. Hierzu wird durch co- Sputtern von CoCrFeNi und WC eine Serie gemischter Schichten hergestellt und der Einfluss auf die Schichthärte mittels Nanoindentation untersucht. Letztendlich wird das epitaktische Wachstum von CoCrFeNi auf den einkristallinen Substraten MgO(100) sowie Al2O3(0001) demonstriert. Hierbei konnte nicht nur erstmalig die Ausbildung einer elektronischen Bandstruktur in HEAs experimentell nachgewiesen, sondern auch erste direkte Zusammenhänge mit der Struktur der CoCrFeNi(100)-Oberfläche aufgezeigt werden. Durch die Verwendung von Substraten verschiedener Struktur und Orientierung ist ein Kristallwachstum der HEA-Schicht entlang unterschiedlicher Richtungen mit hoher Reproduzierbarkeit stimulierbar. Dies stellt eine potentielle Grundlage für weiterführende oberflächenphysikalische und -chemische Experimente, sowie für die Übertragung der in dieser Arbeit beschriebene Herstellungsroute auf weitere HEAs und Substrate dar. / The development and fabrication of new material systems has always been one of the driving forces of technical progress. A new class in the field of alloys, known as high entropy alloys (HEA), has been gaining a rising interest since about ten years. Conventional alloys have one main component, which usually makes up the majority of the molar composition, such as iron in steel. A HEA, on the other hand, is characterized by the fact that at least four different elements are present in approximately equal volume proportions. In this case, there is a significant increase in the eponymous mixing entropy compared to the enthalpy, which in turn leads to the preferential formation of single-phase solid solutions instead of well ordered metallic phases. The almost unlimited number of possible element and proportion combinations to form HEAs results in at least an equally large range of potential applications. In the field of materials science, for example, HEAs with outstanding wear and corrosion properties have already been demonstrated. There is also promising work with regard to hardness, tensile and yield strength or irradiation resistance, which underlines the high applicational relevance of HEAs. Numerous manufacturing methods have already been successfully applied to HEAs, covering all dimensions, from layers as thin as a few nm to cast or sintered solids in the cm range. The use of modern 3D printing technology also allows the combination of the outstanding material properties of HEAs with complex shaped components. Despite the high and still increasing research interest in HEAs, there is only a very limited number of works that deal with the investigation of structural, chemical or electronic aspects of crystalline HEA surfaces. One reason for this is the insufficient availability of such systems, as the production of large crystals with high order usually requires very slow and well-controlled growth processes. One way to overcome this bottleneck is the deposition of epitaxial crystal films on suitable substrates. Their production and characterization using magnetron sputtering is one of the main focuses of this work, with the CoCrFeNi alloy being chosen as the demonstration material. First, two types of sputtering targets sintered from different starting materials are analyzed and the layers deposited from them are examined. The resulting crystal phases can be determined using X-ray diffraction, and the chemical composition and element distribution of the bulk material can be investigated using energy-dispersive X-ray spectroscopy. A twostep preparation of the sample surface, consisting of Ar+ ion bombardment and subsequent heating, allows the analysis of clean surfaces. The surface composition can be examined using X-ray photoelectron spectroscopy and the crystal structure is available by means of low-energy electron diffraction. By adding further elements to the alloy, the systematic modification of individual properties of the sputtered thin films will be addresses. For this purpose, a series of mixed layers is produced by cosputtering CoCrFeNi and WC and the influence on the layer hardness is examined using nanoindentation. Ultimately, the epitaxial growth of CoCrFeNi on the substrates MgO(100) and Al2O3(0001) is demonstrated. Not only was the formation of an electronic band structure in HEAs experimentally proven for the first time, but also direct connections with the structure of the CoCrFeNi(100) surface could be made. By using substrates of different structures and orientations, crystal growth of the HEA layer can be stimulated along different directions with high reproducibility. This represents a potential basis for further surface physics and chemistry experiments, as well as for the transfer of the manufacturing route described in this work to other HEAs and substrates.

Introduction: Though xenogeneic acellular scaffolds are frequently used for surgical reconstruction, knowledge of their mechanical properties is lacking. This study compared the mechanical, histological and ultrastructural properties of various native and acellular specimens. Materials and methods: Porcine esophagi, ureters and skin were tested mechanically in a native or acellular condition, focusing on the elastic modulus, ultimate tensile stress and maximum strain. The testing protocol for soft tissues was standardized, including the adaption of the tissue’s water content and partial plastination to minimize material slippage as well as templates for normed sample dimensions and precise cross-section measurements. The native and acellular tissues were compared at the microscopic and ultrastructural level with a focus on type I collagens. Results: Increased elastic modulus and ultimate tensile stress values were quantified in acellular esophagi and ureters compared to the native condition. In contrast, these values were strongly decreased in the skin after acellularization. Acellularization-related decreases in maximum strain were found in all tissues. Type I collagens were well-preserved in these samples; however, clotting and a loss of cross-linking type I collagens was observed ultrastructurally. Elastins and fibronectins were preserved in the esophagi and ureters. A loss of the epidermal layer and decreased fibronectin content was present in the skin. Discussion: Acellularization induces changes in the tensile properties of soft tissues. Some of these changes appear to be organ specific. Loss of cross-linking type I collagen may indicate increased mechanical strength due to decreasing transverse forces acting upon the scaffolds, whereas fibronectin loss may be related to decreased load-bearing capacity. Potentially, the alterations in tissue mechanics are linked to organ function and to the interplay of cells and the extracellular matrix, which is different in hollow organs when compared to skin.

Tomographic electron holography combines tomography, the reconstruction of three-dimensionally resolved data from multiple measurements with different specimen orientations, with electron holography, an interferometrical method for measuring the complex wave function inside a transmission electron microscope (TEM). Due to multiple scattering and free wave propagation conventional, ray projection based, tomography does perform badly when approaching atomic resolution. This is remedied by incorporating propagation effects into the projection while maintaining linearity in the object potential. Using the Rytov approach an approximation is derived, where the logarithm of the complex wave is linear in the potential. The ray projection becomes a convolution with a Fresnel propagation kernel, which is considerably more computationally expensive. A framework for such calculations has been implemented in Python. So has a multislice electron scattering algorithm, optimised for large fields of view and high numbers of atoms for simulations of scattering at nanoparticles. The Rytov approximation gives a remarkable increase in resolution and signal quality over the conventional approach in the tested system of a tungsten disulfide nanotube. The response to noise seems to be similar as in conventional tomography, so rather benign. This comes at the downside of much longer calculation time per iteration. / Tomographische Elektronenholographie kombiniert Tomographie, die Rekonstruktion dreidimensional aufgelößter Daten aus einem Satz von mehreren Messungen bei verschiedenen Objektorientierungen, mit Elektronenholographie, eine interferrometrische Messung der komplexen Elektronenwelle im Transmissionselektronenmikroskop (TEM). Wegen Mehrfachstreuung und Propagationseffekten erzeugt konventionelle, auf einer Strahlprojektion basierende, Tomography ernste Probleme bei Hochauflösung hin zu atomarer Auflösung. Diese sollen durch ein Modell, welches Fresnel-Propagation beinhaltet, aber weiterhin linear im Potential des Objektes ist, vermindert werden. Mit dem Rytov-Ansatz wird eine Näherung abgeleitet, wobei der Logarithmus der komplexen Welle linear im Potential ist. Die Strahlen-Projektion ist dann eine Faltung mit dem Fresnel-Propagations-Faltungskernel welche rechentechnisch wesentlich aufwendiger ist. Ein Programm-Paket für solche Rechnungen wurde in Python implementiert. Weiterhin wurde ein Multislice Algorithmus für große Gesichtsfelder und Objekte mit vielen Atomen wie Nanopartikel optimiert. Die Rytov-Näherung verbessert sowohl die Auflösung als auch die Signalqualität immens gegenüber konventioneller Tomographie, zumindest in dem getesteten System eines Wolframdisulfid-Nanoröhrchens. Das Rauschverhalten scheint ähnlich der konventionallen Tomographie zu sein, also eher gutmütig. Im Gegenzug braucht die Tomographie basierend auf der Rytov-Näherung wesentlich mehr Rechenzeit pro Iteration.

Mit der vorliegenden Arbeit sollten mit Hilfe elektronenmikroskopischer Methoden verschiedene Liposomen-DNA-Komplexe zum Gentransfer charakterisiert sowie die Aufnahme und Verteilung in der Zellkultur untersucht werden. Dabei waren vor allem solche Präparationen von besonderem Interesse, die in unserer Arbeitsgruppe 'Drug Targeting' getestet oder entwickelt und verwendet wurden, wie Sendai-Virus Liposomen (HVJ-Liposomen), Virosomen sowie DAC-Chol und DOCSPER-Liposomen als Vertreter der kationischen Lipide.<br /> <br /> Im ersten Teil der Arbeit wurden fusogene Liposomen und Virosomen charakterisiert. Bei diesen Untersuchungen wurden folgende Ergebnisse erzielt:<br /> ·Sendai-Viren fusionieren mit Liposomen unterschiedlicher Lipidzusammensetzung. <br /> ·Die daraus resultierenden HVJ-Liposomen sind mit elektronenmikroskopischen Methoden identifizierbar.<br /> ·Die Spikes auf den HVJ-Liposomen besitzen fusogene Eigenschaften. <br /> ·HVJ-Liposomen eignen sich auf Grund der geringen Ausbeute sowie der geringen Transfektionseffizienz nicht zum in vitro Gentransfer.<br /> ·Virosomen stellen einen weiteren Typ fusogener Gentransfervesikel dar.<br /> ·Ihre Größe und fusogenen Eigenschaften sind abhängig von der externen Zugabe einer optimierten Lipidmischung.<br /> ·Im Innenraum der Virosomen kann mit Poly-L-Lysin vorkomplexierte DNA verkapselt werden.<br /> ·Die fusogenen Eigenschaften der Virosomen wurden mit Hilfe immunelektronenmikroskopischer Techniken und monoklonaler Antikörper gegen Hämagglutinin/Neuraminidase und das Fusionsprotein sowie mit polyklonalen Antiseren gezeigt.<br /> ·An Hand goldmarkierter DNA sind Virosomen nach der Transfektion in der Zelle nachweisbar.<br /> <br /> Da in unserer Arbeitsgruppe bevorzugt kationische Liposomen zum Gentransfer verwendet werden, wurde auch die Struktur der Liposomen untersucht und folgende Ergebnisse dokumentiert:<br /> ·Die Struktur und die Größe kationischer Liposomen werden hauptsächlich durch die Lipidzusammensetzung bestimmt. <br /> ·Die Bildung von Liposomen-DNA-Komplexen ist mit einer Größenzunahme der Komplexe gekoppelt.<br /> ·Die Anzahl gebundener Plasmide steigt mit der Größe der Lipoplexe. <br /> ·Gentransferaktive Lipopolyplexe (mit Protaminsulfat komplexierte DNA und DAC-Chol- Liposomen) sind kleiner als Lipoplexe. Ihre Struktur wird von der Zusammensetzung bestimmt. <br /> <br /> Eine weitere wichtige Frage betrifft den Weg der Gencarrier in der Zelle. Kenntnisse über diese Vorgänge sind vorteilhaft, um die einzelnen Schritte zu verstehen und möglichst gezielt zu verbessern.<br /> Bei der Untersuchung der Partikel im Hinblick auf zelluläre Barrieren beim Gentransfer konnten folgende Ergebnisse erzielt werden: <br /> ·Die Bindung der Partikel an die Zellmembran und Aufnahme sind abhängig von den eingesetzten Zellen und Komplexen sowie derInkubationszeit.<br /> ·Die Aufnahme erfolgt über endozytotische Mechanismen, wobei Lipopolyplexe schneller als Lipoplexe in die Zellen gelangen. Nicht alle gebundenen Komplexe werden aufgenommen.<br /> ·Die aufgenommenen Partikel befinden sich in Endosomen und werden ins Innere der Zelle transportiert. <br /> ·Freisetzung der DNA und Eintritt in den Zellkern über Kernporen konnte nicht beobachtet werden.<br /> ·DNA-haltige Vesikel in Kernnähe deuten auf einen weiteren Mechanismus hin (Vesikeltransfer zum Zellkern). / The aim of this work is the characterisation of several liposome DNA complexes for in vitro gene transfer and uptake as well as their distribution in cultured cell lines using electron microscopy. The particles used were fusogenic liposomes made from Sendai virus, virosomes and cationic liposomes. <br /> At first fusogenic liposomes and virosomes were characterised. The results obtained are summarised below:<br /> ·Sendai virus can fuse with liposomes made from different lipid composition.<br /> ·HVJ-liposomes are detectable using electron microscopy techniques. <br /> ·The spikes from HVJ-liposomes have fusogenic properties.<br /> ·HVJ-liposomes are not suitable for in vitro gene transfer due to the low amount of fusogenic liposomes leading to low transfection efficiency.<br /> ·Virosomes, reconstituted virus envelopes, are another type of fusogenic vesicles.<br /> ·Size and morphology of virosomes depends on the addition of an optimised lipid mixture. <br /> ·PLL treated DNA is entrapped into virosomes.<br /> ·Monoclonal and polyclonal antibodies and protein A gold technique can be used for the detection of viral glycoproteins on virosomes. ·Gold labelled DNA was used to show the distribution in cultured cells.<br /> <br /> In order to characterise the structure of cationic liposomes following results were obtained:<br /> ·Size and structure depends on the lipid composition.<br /> ·The formation of liposomes leads to an increase of the size.<br /> ·Larger lipoplexes contain more DNA.<br /> ·Lipopolyplexes composed of DNA complexed with protamine sulphate and DAC- Chol liposomes are smaller than lipoplexes. Their structure depends on the composition.<br /> <br /> To improve transfection ability examination of the cellular barriers is useful.<br /> With regard to the fate of lipoplexes following results were obtained.<br /> ·Binding depends on the cell line, kind of particles and incubation time.<br /> ·Uptake occurs through endocytosis. Lipopolyplexes enter the cells faster than larger lipoplexes.<br /> ·Lipoplexes are enclosed in endosomes and were carried into the centre of the cell.<br /> ·Escape of DNA from endosomes and entry into nucleus were not visible.<br /> ·Vesicles with DNA were observed near the nucleus. There is an opportunity for another pathway to the nucleus.