At the cellular level, the stress response involves the synthesis of a highly conserved family of heat shock proteins (Hsps). These proteins are essential for maintenance of cellular homeostasis, both in times of stress and in normal cell functioning. Some of the most abundant forms of Hsps in the cell are members of the 70 kDa family. Intracellular heat shock protein 70 (Hsp70) expression in response to proteotoxicity is a highly conserved cellular stress response, but little is known about the role of extracellular Hsp70 (eHsp70) in fish. In order to begin characterizing eHsp70 in fish, the hypothesis that an acute stressor will elevate plasma Hsp70 levels in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) was tested. Subsequent in vitro studies examined whether eHsp70 level was modulated by cortisol and if this involved the action of the glucocorticoid receptor (GR), a ligand-activated transcription factor. The effect of cortisol on the eHsp70 response is important to consider because this steroid is elevated as a result of stressor exposure to allow for short-term allocation of energy stores to cope with stress. Cortisol is the primary corticosteroid in fish and exerts its main effects by binding to either GR or mineralocorticoid receptors (MR). Furthermore, eHsp70 has been previously implicated as having important immunoregulatory roles in mammalian models, but nothing has yet been reported in fish. To this end, a hypothesis tested here was that eHsp70 levels will increase after exposure to the bacterial endotoxin lipopolysaccharide (LPS), and that this response is modulated by cortisol. Finally, research on the effects of exogenous Hsp70 has not been reported in lower vertebrates; however, the relevance of this protein in intercellular signaling, especially in regards to immune regulation, is gaining increasing importance in mammalian models. Therefore, an experiment to determine whether Hsp70 would elicit upregulation of key immunoregulatory cytokines was also conducted. To accurately measure the low levels of Hsp70 in the plasma, a competitive antibody-capture enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was developed. In the in vivo study, fish exposed to an acute heat shock (1h at 10°C above ambient temperature) exhibited a significant elevation in red blood cell Hsp70 levels over a 24 h period. There was also a significant increase in plasma Hsp70 levels at 4 h, but not at 24 h post-heat shock. To more specifically determine how cortisol affected the release of Hsp70, in vitro studies using primary cultures of hepatocytes demonstrated that cortisol significantly decreased eHsp70 levels in the medium at 24 h when compared with untreated controls, and this response was abolished in the presence of a GR antagonist, mifepristone (RU486). This result for the first time established a link between cortisol signaling and eHsp70 release in any animal model. When hepatocytes were exposed to LPS in vitro, eHsp70 levels were significantly lower in the LPS (30 µg/ml) group; however, heat shock abolished this effect at 24 h. Though eHsp70 levels in the heat shocked hepatocytes treated with low-dose LPS (10 µg/ml) was similar to untreated control levels, high-dose LPS treated hepatocytes showed significant elevation of eHsp70 levels above the low dose group. The ability of LPS to modulate eHsp70 release was not observed to be further regulated by cortisol. While this work suggests the modulation of eHsp70 by LPS, the physiological role remains to be elucidated. Finally when hepatocytes were exposed to exogenous Hsp70, there was no effect on key immunoregulatory genes (IL-1β and IL-8) transcript levels; however, the effect of this protein remains to be tested using other cell systems, including immune cells in fish. Overall, eHsp70 concentration was measured in trout plasma using a competitive ELISA and demonstrates for the first time that stressor exposure affects plasma eHsp70 levels in fish. Furthermore, cortisol, the primary corticosteroid in teleosts, modulates eHsp70 release in trout hepatocytes and this is action is mediated by GR signaling. Also, while trout hepatocytes secrete eHsp70 in response to endotoxin shock, a role for eHsp70 in eliciting an immune response is not clear in lower vertebrates. Taken together the results from this study suggest a role for eHsp70 in acute stress adaptation in fish, but the target tissues involved and the physiological responses remain to be elucidated. Further work on the effects of eHsp70 on target tissues effects, and the mechanisms involved, may have important implications in our understanding of the role of this stress protein in cell signaling and stress adaptation in fish.

Lyme-Borreliose, die mittlerweile in der nördlichen Hemisphäre wichtigste durch Vektoren übertragene Erkrankung, wird durch Spirochäten aus der Borrelia burgdorferi sensu lato Gruppe hervorgerufen. Viele der in letzter Zeit veröffentlichten Studien haben darauf hingewiesen, dass durch Antibiotikagaben eine vollständige Erregerelimination nach Infektion nicht erreicht werden kann. Eine prophylaktische Versorgung rückt somit immer weiter in den Vordergrund des Interesses. Eine Impfung ist jedoch auch nicht unproblematisch: Untersuchungen beim Menschen haben gezeigt, dass nach zweimaliger Immunisierung im ersten Jahr lediglich 68% der Probanden geschützt waren und mit einer weiteren, sich anschließenden Immunisierung der Schutz gesteigert werden konnte. Deshalb sollte die hier an Hunden durchgeführte Studie aufzeigen, ob durch eine dreimalige Impfstoffapplikation im Verlauf der Grundimmunisierung mit kommerziell erhältlichen Impfstoffen die im Hund gebildeten Antikörperspiegel zu steigern. Ein höheres Antikörperniveau führt zu einem verzögerten Antikörperabfall und somit zu einem verlängerten Schutz. Weiterhin sollte zusätzlich das induzierte Antikörperprofil näher charakterisiert und somit auch eine Aussage über die Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Borrelienspezies ermöglicht werden. Die im Verlauf dieser Studie durchgeführten Untersuchungen zeigen, dass zunächst eine höher als erwartete Infektionsrate für die Lyme-Borreliose in Sachsen innerhalb der Hundepopulation auftritt. Der prozentuale Anteil seropositiver Tiere beträgt 20,3%. Eine serologisch nachgewiesene Infektion steht allerdings nicht in direktem Zusammenhang mit einem Ausbruch der Erkrankung und darf demnach nicht mit der Erkrankungsrate innerhalb der Hundepopulation gleichgesetzt werden. Die bisher auf dem Markt erhältlichen und hier untersuchten Impfstoffe Merilym (B. burgdorferi s. s. Lysatimpfstoff, Merial, Deutschland), LymeVax (B. burgdorferi s. s. Lysatimpfstoff, Fort Doge, USA), Biocan (B. garinii, B. afzelii Lysatimpfstoff, Bioveta, Tschechien), ProLyme (rekombinanter Outer surface protein A (OspA) Impfstoff, Intervet, USA) und RecombitekLyme (rekombinanter OspA Impfstoff, Merial, USA) wurden in seronegativen Tieren bezüglich der induzierten Gesamtantikörper, der spezifisch gegen OspA gerichteten Antikörper und ihrer Kreuzreaktivität gegenüber heterologen Spezies untersucht, wobei der Einfluss von zwei verschiedenen Impfstrategien von besonderem Interesse war. Durch eine dreifache Antigengabe im Rahmen der Grundimmunisierung konnte nur bei zwei der untersuchten Impfstoffe (Merilym und Biocan) eine deutliche Erhöhung der Antikörperspiegel erreicht werden, die sich aber statistisch nicht signifikant von den anderen unterscheidet. Somit ist eine Umsetzung dieses Impfregimes in die Praxis nicht zu empfehlen. Es zeigt im Verlauf des Jahres bei allen Impfstoffen ein Titerabfall, sowohl bei den Gesamtantikörpern, als auch bei den OspA-Antikörpern. Mit Ausnahme von Biocan, hier sind kaum OspA-Antikörper nachweisbar, induzieren alle Impfstoffe nach der Impfung vor allem OspA-Antikörper, die jedoch sehr schnell wieder abfallen und nach einem halben Jahr nur mehr in geringem Maße nachweisbar sind. Diese OspA-Antikörper sind speziesspezifisch und nur in sehr geringem Umfang kreuzreaktiv. Diese Ergebnisse weisen auf eine Suszeptibilität der geimpften Tiere bezüglich einer Borrelieninfektion innerhalb mehrerer Monate nach Impfung hin. Es empfiehlt sich eine dritte Immunisierung nach sechs Monaten, um auch in der zweiten Jahreshälfte schützende Antikörperspiegel zu ermöglichen. Untersuchungen der Kreuzreaktivität in-vitro sprechen für eine mangelhafte Bindungsfähigkeit induzierter Impfantikörper gegenüber anderen Borrelienspezies, die in Zusammenhang mit einem geringen Schutz in-vivo gesehen werden könnten. Somit ist ein rein speziesspezifischer Impfschutz wahrscheinlich. Da vor allem in Europa eine große Borrelien-Artenvielfalt vorherrscht, deuten die hier vorgestellten Ergebnisse eine nur gegen eine Spezies gerichtete Immunität bei geimpften Hunden an. Die Notwendigkeit der Entwicklung eines neuen Impfstoffes, basierend auf einer Mischung speziesspezifischer OspA-Antigene gewonnen aus B. burgdorferi s. s., B. garinii und B. afzelii in Kombination mit weiteren Antigenen, da der Schutzmechanismus beruhend auf OspA bereits durch eine OspA-Variation seitens der Borrelien durchbrochen werden kann, wird durch die hier vorgelegten Resultate gestützt. Da ein solcher Impfstoff bisher nicht erhältlich ist und die Schutzwirkung der erhältlichen Impfung als partiell angesehen werden kann, rücken einfache, aber in der Regel zuverlässigere Methoden in den Vordergrund. Die tägliche Entfernung von Zecken ist eine wirksame Vorgehensweise, um das Infektionsrisiko zu minimieren. Auch der Einsatz akarizider Substanzen und Repellentien bietet sich an, um die Übertragung der Borreliose und weiterer, von Zecken übertragene Erreger zu unterbinden. / Lyme-Borreliose, currently the most important vector-borne disease in the northern hemisphere, is caused by spirochetes from the Borrelia burgdorferi sensu lato complex. Recently published studies have indicated that a complete eradication of the bacterium from the host’s tissue by antibiotic treatment is not possible. Therefore prophylactic measures become more important. However, vaccines are not unproblematic: studies in humans have shown that only 68% of the participants were protected after two immunizations applied during the first year, while the level of protection rose when an additional immunization was given. Therefore, the study presented here was designed to reveal whether three initial immunizations with commercial vaccines are able to raise the antibody levels in dogs. Higher antibody levels are the basis for a delayed disappearance of antibodies due to natural decay and therefore provide an extended protection from infection. Furthermore, the induced antibody profile was subject of a more precise characterization in order to draw possible conclusions about their efficacy against other Borrelia species. The results presented in this study show a higher than expected prevalence of Borrelia burgdorferi sensu lato seropositivity in dogs from Saxony. The percentage of seropositive dogs was 20.3%. Since seropositivity is not necessarily linked with the onset of the disease, this result does not describe the disease incident in the dog population. In the course of the study, commercially available vaccines, Merilym (B. burgdorferi s. s. lysate, Merial, Germany), LymeVax (B. burgdorferi s. s. lysate, Fort Dodge, USA), Biocan (B. afzelii, B. garinii lysate, Bioveta, Czech Republic), ProLyme (recombinant Outer surface protein A (OspA) with adjuvant, Intervet, USA) and RecombitekLyme (recombinant OspA without adjuvant, Merial, USA) were evaluated for induced antibody levels and the amount of OspA antibodies in seronegative dogs, in which two different vaccination schedules were of special interest. In addition the cross reaction of antibodies on heterologous antigens was analyzed. Three immunizations during the first year with two (Merilym and Biocan) of the five vaccines tested increase the vaccinal antibody levels, but this increase of antibody levels is not statistically significant. Therefore a recommendation for a third antigen application within the first six weeks after basic immunisation can not be given. All vaccine-induced antibody levels show a decrease within the first year concerning total antibody titers as well as OspA antibody titers. Except for Biocan the specificity of the initially induced antibodies by vaccination are directed mainly against OspA. These antibody titers decrease quickly resulting in minimum amounts of detectable antibodies within the period of six months. These OspA antibodies are species-specific and show only a minor cross reactivity. The results presented here suggest that vaccinated animals are susceptible for a borrelia infection within months after immunization. Therefore a third vaccination six months after the basic immunization is advisable in order to induce a long lasting protective antibody level during the period of one year. These data generated with in-vitro systems suggest that only a species-specific protection can be expected in-vivo. The species heterogeneity within Europe suggests that the vaccine available in Europe only protects from infection with the species used for vaccine preparation. These results underline the necessity to develop a new vaccine consistent of a mixture of OspA derived from at least B. burgdorferi s. s., B. garinii and B. afzelii in combination with other antigens, since protection from infection via OspA can be circumvented by minor OspA variations on the part of the borrelia. Since such a vaccine is not yet available, and therefore other methods that provide protection are necessary. Daily control of the dog and the removal of adherent ticks can help to prevent a possible infection since borrelia take at least 24 hours to migrate from the midgut of the tick to the salivary gland where they can infect the host. In addition, the use of repellent or acarizides might be helpful to avoid attachment or achieve the death of adherent ticks and therefore minimize the risk of infection with borrelia as well as other tick-borne diseases.

Ziel dieser Arbeit war es, die porzine Salmonelleninfektion unter Berücksichtigung der drei beim Schwein am häufigsten vorkommenden Salmonella-Serovaren anhand des klinischen Bildes, der quantitativen und qualitativen Erregerausscheidung, des Kolonisationsverhaltens, der Serokonversion bezüglich der unterschiedlichen Immunglobulin-Isotypen IgA, IgG und IgM sowie durch die Labordiagnostik näher zu charakterisieren. Bisherige Studien an Schweinen wurden überwiegend mit S. Typhimurium durchgeführt, weitere Serovare sind bisher nur unzureichend erforscht worden, obwohl sie ebenfalls zoonotisches Potential besitzen, aber vergleichsweise nur als gering virulent und kaum invasiv gelten. Die Durchführung dieser Studie erfolgte mit 6 Wochen alten Absatzferkeln, welche nach einem bereits etablierten Modell mit den jeweiligen Salmonella-Serovaren infiziert wurden. Nach dem Challenge wurden die Tiere täglich klinisch untersucht und es wurden Kotproben zur qualitativen und quantitativen Erregerausscheidung entnommen. Parallel dazu wurden im Abstand von zwei bzw. drei Tagen Blutproben für ein Differentialblutbild, Blutchemie sowie für die serologische Untersuchung gewonnen. Nach einer Woche wurden die Tiere getötet und es wurden insgesamt 13 sterile Organproben gewonnen, um eine Aussage über das Kolonisationsverhalten treffen zu können. Die Infektionsversuche zeigten, dass nach oraler Verabreichung von 1x1010 KbE die Tiere der mit S. Infantis infizierten Gruppe, entgegen den Erwartungen, die stärksten klinischen Symptome einer Salmonellose mit Diarrhoe, Fieber, Anorexie sowie reduziertem Allgemeinbefinden zeigten. Nach dem Challenge schieden alle Tiere der drei Infektionsgruppen den jeweiligen Challengestamm zu allen Zeitpunkten des Experimentes aus. Dabei war die quantitative Erregerausscheidung bei der S. Infantis-Infektionsgruppe stets am höchsten, bei der S. Derby-Gruppe stets am geringsten. Die Kolonisationsrate in den untersuchten Organproben war bei der S. Derby-Gruppe mit insgesamt 80,7 % am höchsten, gefolgt von der S. Typhimurium DT104-Gruppe mit 80,3 %. S. Infantis wurde mit einer Kolonisationsrate von 73,6 % am seltensten isoliert. Bei der quantitativen bakteriologischen Untersuchung der Organproben wurden bei der S. Typhimurium DT104-Gruppe die meisten Salmonellen vorwiegend aus den lymphatischen Organen isoliert, während bei der S. Infantis-Gruppe die Salmonellenbelastung in den essbaren Organen am höchsten war. Die serologische Untersuchung mittels isotypspezifischen ELISA offenbarte für IgG einzig bei der S. Typhimurium DT104-Gruppe einen deutlichen Anstieg der spezifischen Antikörperaktivität, während für IgM die höchste Aktivität bei der S. Derby-Gruppe gemessen wurde. Für IgA fand bei allen Tieren der drei Infektionsgruppen keine Serokonversion statt. Im Differentialblutbild stellten sich bei allen Tieren der drei Infektionsgruppen nach dem Challenge mit einer Leukozytose, einer Linksverschiebung und einer Monozytose typische Anzeichen einer bakteriellen Infektion ein. Die blutchemische Untersuchung offenbarte besonders bei der S. Typhimurium DT104-Gruppe und der S. Infantis-Gruppe größere Verluste von Natrium und Chlorid nach dem Challenge, während es bei der S. Derby-Gruppe zu keinen Elektrolytverschiebungen im Plasma kam. Im Rahmen dieser Arbeit wurde deutlich, dass S. Infantis auch beim Schwein schwere klinische Verläufe verursachen kann und auch in essbaren Organen kolonisiert. Diese invasiven Isolate stellen neben den wirtschaftlichen Verlusten ein großes Verbraucher- schutzproblem dar. Obwohl die Prävalenz von S. Infantis beim Schwein nicht so hoch wie die von S. Typhimurium ist, so sollte diese Serovar in Zukunft besonders beobachtet werden. Für S. Derby wurde trotz schwacher Virulenz die höchste Kolonisationsrate nachgewiesen, was deren Potential, klinisch inapparente Salmonelleninfektionen auszulösen, deutlich macht. Somit belegt diese Arbeit, dass S. Infantis und S. Derby für den Menschen sehr bedeutsam sein können und daher ein entsprechendes Monitoring erfordern.

Weltweit zählt die Salmonellose zu den am häufigsten vorkommenden Zoonosen und auch in Deutschland kommt ihr zunehmend eine sozialökonomische Bedeutung zu. Dabei stellen die maßgeblichen Übertragungs- und Infektionsquellen kontaminiertes Wasser und kontaminierte Lebensmittel dar, bei denen schätzungsweise 20 % auf kontaminiertes Schweinefleisch zurückzuführen sind. Dies verdeutlicht die Notwendigkeit einer Salmonellenbekämpfung. In den dafür geschaffenen gesetzlichen Grundlagen spielt vor allen Dingen der serologische Nachweis einer Salmonelleninfektion eine entscheidende Rolle. Dafür existieren derzeit in Deutschland vier nach § 17c des TSeuchG zugelassene ELISA-Testsysteme. Ziel der vorliegenden Arbeit war eine vergleichende Evaluierung dieser ELISA-Testsysteme zur serologischen Diagnostik von S. Infantis beim Schwein. Um die Tests zu evaluieren, wurden 19 Läuferschweine intragastral mit S. Infantis infiziert und über einen Untersuchungszeitraum von 123 Tagen serologisch mit allen vier ELISAs untersucht. Dabei erfolgte zeitgleich eine bakteriologische Untersuchung. Obwohl S. Infantis zu den schwach virulenten Erregern zählt, zeigten alle Probanden eine deutliche Klinik, die sich überwiegend in mittelgradiger Diarrhoe äußerte. Durch die bakteriologische Untersuchung wurde offenbar, dass alle Schweine bis zum Ende des Versuchszeitraumes eine intermittierende Ausscheidung von S. Infanits zeigten. Ebenso war bei allen Tiere eine Serokonversion nachweisbar, welche sich bei den angewandten Tests jedoch in deutlicher Diskrepanz der Testsensitivitäten äußerte. Zum Beispiel ergab die ermittelte Testsensitivität des Enterisol® Salmonellen-Diagnostikum™ am 53. Tag mittels vorgeschriebenen Cutoff-Wertes nach Schweine-Salmonellen-Verordnung eine Sensitivität von 20%, während diese bei dem isotypspezifischen Salmotype® Pig STM-WCE™ ELISA bei 93,3% lag. Während der Salmotype® PigScreen™ immerhin eine Sensitivität von 6,7% zeigte, erwies sich der HerdChek® Swine Salmonella™ an diesem Tag als nicht sensitiv. In der gesamten Untersuchung konnte nachgewiesen werden, dass sich der isotypspezifische Salmotype® Pig STM-WCE™ ELISA zur serologischen Diagnostik von S. Infantis am besten eignete, während die drei LPS-ELISA erst sehr spät positiv reagierten. Die Sensitivitätsverluste erwiesen sich als besonders stark, wenn die Auswertung der optischen Dichte durch den nach Schweine-Salmonellen-Verordnung angewandten Cutoff-Wert von 40 OD% erfolgte. Des Weiteren wurde deutlich, dass die Ergebnisse der Fleischsaftuntersuchung nicht immer mit denen des Endserums korrelierten. Insgesamt ist der Einsatz des Cutoff-Wertes von 40 OD% als kritisch zu betrachten und es stellt sich die Frage, ob es im Sinne des Verbraucherschutzes, nicht günstiger wäre, den Cutoff-Wert auf 20 oder 10 OD % herabzusetzen, wie dies inzwischen auch in Dänemark mit Erfolg durchgeführt wurde. Abschließend ist feststellbar, dass sich die Diagnostik von S. Infantis beim Schwein mit den vorgeschriebenen Testsystemen als schwierig erweist, da teilweise geringe Sensitivitäten vorlagen.

Die sichere Diagnose der Lyme-Borreliose und der Nachweis des verursachenden Spirochäten Borrelia burgdorferi bei Mensch und Tier sind problematisch. In Nordamerika ist B. burgdorferi sensu stricto (B. burgdorferi s.s.) die einzige pathogene Spezies, während in Europa und Asien mit B. garinii und B. afzelii mindestens zwei weitere pathogene Arten vorkommen. B. valaisiana, B. spielmanii und B. lusitaniae werden ebenfalls als Verursacher der Lyme-Borreliose diskutiert. Der indirekte Erregernachweis durch Detektion von Antikörpern mittels Antigen aus Borrelienlysat im Zweistufentest (ELISA und Western-Blot) gilt seit langem trotz der anspruchsvollen Interpretationskriterien als Methode der Wahl. Ein hochspezifischer ELISA mit dem synthetischen C6 Peptid als Antigenkomponente ergänzt erst seit wenigen Jahren die Diagnostik. Das C6-Peptid basiert auf der invariablen Region 6, welche eine konstante Region des ansonsten hochvariablen Borrelien-Oberflächenproteins VlsE darstellt. Nur metabolisch aktive Borrelien exprimieren VlsE/C6 Epitope im Säugetierwirt. Studien zeigten, dass C6-Antikörper mehrere Monate nach einer potenziell erfolgreichen antibiotischen Therapie deutlich messbar und langfristig absinken. In Deutschland sind ein C6-Schnelltest (4Dx®SNAP®, IDEXX Inc., USA) und ELISA (Quant C6®, IDEXX Inc., USA) für die Serodiagnostik bei Hunden erhältlich. Über die Anwendbarkeit des C6-Peptids für die kanine Borreliosediagnostik in Deutschland liegen wenige Daten vor, aber zunehmend wird der Ersatz des Zweistufentests durch das C6-Peptid diskutiert. In dieser Arbeit sollte zunächst festgestellt werden, ob potenzielle kanine Infektionen in der Routinediagnostik mit dem C6-Peptid ebenso sensitiv detektiert werden können wie mit dem Zweistufentest und ob C6-positive Hunde nach einer Antibiose mit dem deutlichen Sinken der C6 Antikörperspiegel als Zeichen eines potenziellen Therapieerfolges reagieren. Dafür wurden 510 Sera von Hunden aus verschiedenen deutschen Tierarztpraxen untersucht, wobei neben der serologischen Untersuchung eine Analyse der Vorberichte erfolgte. Eine dort angegebene, bestehende Infektion konnte in 93,3 % der Fälle serologisch nicht bestätigt werden und nur bei 3,3 % der Hunde wurden infektionsspezifische Antikörper ermittelt. Der Zweistufentest und der C6 Schnelltest wiesen hier eine vollständige Übereinstimmung auf. Unabhängig vom Vorliegen klinischer Anzeichen wurden für diese Studie C6-positive Hunde mit Antibiotika behandelt. Vier bis 18 Monaten nach der Therapie wurde von insgesamt 27 Hunden eine zweite Blutprobe untersucht. Die C6 Antikörperspiegel waren bei acht Hunden im ELISA um mindestens 50 % gesunken. Für deutliche Effekte musste aber ein ausreichend hoher initialer C6-Antikörperspiegel vorliegen. Da in Europa mindestens drei pathogene Borrelienarten vorkommen, wurde in einem murinen Infektionsmodell analysiert, ob speziesspezifische C6-Peptide von B. burgdorferi s.s., B. garinii und zwei Varianten von B. afzelii sicher Antikörper detektieren, die durch definierte experimentelle Monoinfektionen mit B. burgdorferi s.s. N40, B. garinii PBi, B. afzelii Slovakia, B. afzelii PKo, B. valaisiana, B. spielmanii oder B. lusitaniae induziert wurden. Um die erfolgreiche Infektion zu belegen, wurden murine Gewebe zur Borrelienisolation in Kulturmedien inkubiert und zusätzlich eine qPCR zum Nachweis von ospA durchgeführt. Eine PCR zur Detektion von essenziellen Plasmiden ergab, dass die B.-lusitaniae- und B.-valaisiana-Isolate nicht infektiös waren. Eine Infektion konnte durch Gewebekultur und qPCR dagegen bei mit B.-burgdorferi-s.s.-, B- garinii-, B.-afzelii- und B. spielmanii-inokulierten Mäusen belegt werden. Die Ergebnisse des C6-Peptid-ELISAs wurden mit dem des Zweistufentests als Goldstandard verglichen und die Sensitivitäten der C6-Peptide ermittelt. Diese betrug bei C6-Peptiden von B. burgdorferi s.s. und B. garinii je 100 % für B.¬burgdorferi¬s.s.¬N40, B. garinii-PBi- oder B.-afzelii-PKo-spezifische C6-Antikörper. Dagegen konnten C6-Peptide basierend auf B. afzelii nur B.-afzelii-PKo-spezifische Antikörper zu 100 % erfassen. Antikörper gegen B. afzelii Slovakia wurden von jedem C6-Peptid schlechter erfasst als Antikörper gegen B. afzelii PKo, was das Vorkommen stamm- oder isolatspezifischer C6-Antikörperfraktionen nahelegt. Die Untersuchung der 27 C6-positiven Hundesera aus der serologischen Studie ergab zudem, dass der Großteil der Sera ausschließlich gegenüber B.-burgdorferi-C6 und B.-garinii-C6 deutlich messbar reagierte. Die Eignung des C6-Peptids in praxi als ein schneller, hochspezifischer Infektionsmarker für den serologischen Nachweis bei Hunden aus Deutschland kann bestätigt werden. Allerdings kann der alleinige Nachweis von C6-Antikörpern weder einen detaillierten Vorbericht, noch den Zweistufentest auf Lysatantigen-Basis ersetzen. Seine Eignung als Marker für einen potenziellen Therapieerfolg ist nur unter definierten Bedingungen gegeben. Die divergenten Sensitivitäten verschiedener C6 Peptidsequenzen gegenüber Antikörpern von in Europa vorkommenden Borrelien-Arten und Isolaten machen deutlich, dass zukünftig weiterer, intensiver Forschungsbedarf bezüglich der Etablierung von ausreichend sensitiven C6-Testsystemen für europäische Bedürfnisse notwendig ist.

Tularemia is a zoonosis caused by the small, fastidious, gram-negative rod Francisella tularensis that appears over almost the entire Northern Hemisphere. In Sweden, tularemia has appeared mainly in restricted areas in northern parts of central Sweden. The disease can be transmitted through several routes: direct contact with infected animals, by vectors, through contaminated food or water or through inhalation of aerosolized bacteria. Distinct clinical forms of the disease are seen, depending on the route of transmission. During the last years, tularemia has emerged in new areas in central Sweden, south of the endemic area. The emergence of tularemia in the County of Örebro prompted the investigations presented in this thesis. We performed a case-control study, using a mailed questionnaire, to identify risk factors for acquiring tularemia in Sweden (Paper I). After multivariate analysis, mosquito bites and cat ownership could be associated with tularemia in all studied areas while farming appeared as a risk factor only in endemic areas. In Paper II, we evaluated a PCR analysis, targeting the tul4 gene, used on samples from primary lesions in patients with ulceroglandular tularemia. The method performed well, with a sensitivity of 78% and a specifi city of 96%. The clinical characteristics of tularemia in an emergent area in Sweden were studied Paper III), using case fi les and a questionnaire. Of 278 cases of tularemia reported during the years 2000 to 2004, 234 had been in contact with a doctor from the Department of Infectious Diseases at Örebro University Hospital, and were thus included. The ulceroglandular form of the disease was seen in 89% of the cases, with the primary lesion, in most cases, on the lower leg. An overwhelming majority of cases occurred during late summer and early autumn, further supporting transmission by mosquitoes. Erythemas overlying the affected lymph node areas were seen in 19% of patients with forms of tularemia affecting peripheral lymph nodes. Late skin manifestations, of various appearances, were seen in 30% of the cases, predominantly in women. A raised awareness of tularemia among physicians in the county during the course of the outbreak was found, as documented by the development of shorter doctor’s delay and less prescription of antibiotics inappropriate in tularemia. Finally, we developed a simplifi ed whole-blood lymphocyte stimulation test, as a diagnostic tool in tularemia (Paper IV). The level of IFN-γ, as a proxy for lymphocyte proliferation, was measured after 24-h stimulation. Additionally, a tularemia ELISA with ultra-purifi ed LPS as the antigen was evaluated, showing a high sensitivity. The lymphocyte stimulation test, when performed on consecutive samples from subjects with ongoing tularemia was able to detect the disease earlier in the course of the disease than both the new ELISA and the tube agglutination test. Furthermore, all tularemia cases became positive in the lymphocyte stimulation test within 12 days of disease. In conclusion, this thesis describes risk factors for acquiring tularemia as well as the clinical characteristics of the disease in Sweden. Additionally, a Francisella PCR analysis and a tularemia ELISA based on highly purifi ed LPS is evaluated, and a simplified lymphocyte stimulation test, for early confirmation of the disease, is developed.

The Australian paralysis tick, Ixodes holocyclus causes a potentially fatal paralysis in domestic animals, livestock and humans with companion animals (mainly dogs) most commonly affected. Current treatment regimes include administration of a commercial tick anti-serum (TAS), prepared as hyperimmune serum in dogs, to neutralise the effects of the toxin. However, each new batch must be standardised using an expensive and highly subjective bioassay performed in neonatal mice. There is currently an urgent need for a more cost effective and rapid in vitro assay that can be more objectively and accurately quantified. Further understanding of the composition of the toxin molecule is also required to develop toxin-specific reagents necessary for these assays. One of the main objectives of this study was to develop a suitable immunoassay to replace the existing mouse bioassay for assessing batches of tick anti-sera for use in tick paralysis therapy in dogs. Initially an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was established to detect and quantify antibody specific for I. holocyclus toxin in dog sera. Using a partially purified antigen extracted from I. holocyclus salivary glands, good discrimination was achieved between reactive (hyperimmune) and non-reactive (naïve) sera. The hyperimmune dog sera reacted very strongly with the antigen compared to negligible reactions of serum from dogs not exposed to I. holocyclus. The reactions of hyperimmune sera were also significantly weaker to a non-toxin antigen control extracted from the salivary glands of the non-toxic tick Rhipicephalus microplus, indicating the assay was detecting toxin-specific responses. Furthermore, each of the hyperimmune sera that reacted strongly and specifically with the I. holocyclus antigen in the ELISA also strongly neutralised toxin in the mouse bioassay. Together these findings support the suitability of this ELISA for assessing the potency of batches of commercial dog hyperimmune sera for use as therapy for tick paralysis in dogs. Sera from dogs that were experimentally infested with ticks and sera from patient dogs, presenting at veterinary clinics with signs of tick paralysis, were also screened for antibodies to I. holocyclus antigen using the ELISA. Twenty-eight out of 29 sera from animals with single or multiple exposures to ticks failed to recognise the I. holocyclus antigen indicating the ELISA is not suitable as a diagnostic test to detect toxin-specific antibodies in animals with limited exposure to I. holocyclus infestation. A panel of toxin-specific monoclonal antibodies (mAbs) was produced as research tools to analyse and purify tick toxin components. Rats were successfully immunised against tick toxin using a combination of inoculation of partially purified salivary gland antigen and exposure to tick infestation. The latter approach preserved the native confirmation of the toxin using a natural route of immunisation and rats were chosen due to their high tolerance of multiple tick infestations over several days. While fusion of rat spleen cells with mouse myeloma cells has been reported several times in the literature, the resulting hybridomas are unstable with fastidious culture requirements. Optimisation of the culture conditions revealed that most rat-mouse hybridoma lines grew best in serum-free medium supplemented with 5% foetal bovine serum. Of 600 hybridomas produced, only 12 were shown to be specific for the Ixodes antigen, as determined by ELISA. A selection of these hybridomas representing various patterns of affinity and/or antigen specificity were further analysed for toxin-neutralising ability in a mouse bioassay. Notably, the most potent toxin-neutralising mAb in mice, showed a specific but relatively moderate reaction to Ixodes antigen in the ELISA. The most potent toxin-neutralising mAbs inactivated toxin as strongly as the commercial TAS used for immunotherapy in dogs with tick paralysis. This suggests that mAbs may present an alternative source of immunotherapy, providing a potentially endless supply of a highly consistent reagent and negating the need to use live animals for both the production of tick antiserum and the continual testing of reagent batches. The toxin-neutralising mAbs were also used to analyse I. holocyclus toxin in polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and Western blot to identify specific toxin proteins. The most potent neutralising mAbs consistently recognised high MW proteins (100-200 kDa) in a smeared pattern. Although this was contrary to previous reports of low molecular weight components (3-5 kDa) in holocyclotoxin, this study was the first to use mAbs prepared to native toxin. The large molecular weight structures likely represent presucursors to, or complexes of the smaller peptides, previously identified. When the Toxin-neutralising mAbs were assessed as ligands to affinity purify toxin components from crude Ixodes SG extracts, toxin components of 110 and 32 kDa were consistently identified. These purified proteins represent good candidates for N-terminal sequencing to further identify the toxin components in I.holocyclus salivary glands.

The aim of this study was to evaluate new methods to improve detection and investigation of the effects of chronic or subclinical infection with Trypanosoma evansi in various mammalian species. Some of the more resistant host species, including pigs and buffaloes, are present in large feral populations in the northern parts of Australia, the area where T. evansi is most likely to gain entry to the country. Existing tests are not sufficiently reliable to detect all cases of disease and they cannot distinguish acute from chronic infections. Furthermore, the tests have different sensitivities in different host species. Surveillance for trypanosomiasis in Australia is problematic because of the need to work in remote parts of northern Australia where provision of a cold-chain for traditional blood and serum storage is difficult. An existing dried blood storage system was modified by treating cotton lint filter paper (Whatman #903) with a commercial post coating buffer (TropBio, Queensland). This treatment increased the longevity of antibodies to T. evansi in serum and blood stored on the paper (detected using an antibody-detection ELISA) compared to samples stored on plain paper, especially when the papers were stored under humid conditions and at high ambient temperatures. Attempts were made to improve the diagnostic utility and repeatability of antibody-ELISAs through the use of 2 recombinant T. brucei antigens (PFRA and GM6) and to optimize a competitive ELISA using RoTat 1.2 variable surface antigen and its monoclonal antibody. Antibody-detection using the two recombinant proteins was not sufficiently specific to enable their use for the detection of T. evansi. The RoTat 1.2 cELISA had good sensitivity and specificity (75% and 98% respectively) when used to test serum from cattle and buffaloes experimentally infected with T. evansi and uninfected animals. However, the test was not able to detect anti-T. evansi antibodies in serum from wallabies, pigs, a dog or a horse that were experimentally infected with T. evansi. The inability of the cELISA to detect anti-T. evansi antibodies may be due to the small number of samples tested or the lack of RoTat 1.2 specific antibodies in the animals tested. The feasibility of using an enzymatic test to detect trypanosome aminotransferase or antibodies to this enzyme was evaluated. Prior publications suggested that the detection of TAT was an appropriate diagnostic tool for the detection of T. evansi infection in camels. However, the results from this study did not support the use of this test for the detection of T. evansi infection in cattle or buffaloes with low to moderate parasitaemia. Trypanosomiasis is an immunological disease that affects most of the body’s organs, with more severe disease developing over time. Attempts were made to determine key cytokine and biochemical patterns that would distinguish infected from uninfected animals and acute from chronic infections. The results from this study showed that there was no specific pattern in serum cytokines or serum biochemistry that could be used to distinguish infected from uninfected animals, or different stages of disease. Immunohistochemistry was used on tissues from buffaloes and mice experimentally infected with T. evansi and T. brucei gambiense respectively to characterise the cellular immune response that was present. The immune response was predominantly cell mediated, with CD3+ T lymphocyte and macrophage infiltration occurring in most tissues. In end stage disease there was often suppression of the immune system with disruption of the architecture of the spleen and a decrease in B lymphocytes in the circulation. Trypanosomes were rarely visible in the tissues and were only seen in those animals with high parasitaemia. Lesions generally became more severe over time, but there was a large variation between animals, which suggests that immunohistochemistry is unsuitable as a diagnostic tool.

Diss. (sammanfattning) Uppsala : Sveriges lantbruksuniv., 2002. / Härtill 4 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Uppsala : Sveriges lantbruksuniv., 2002. / Härtill 4 uppsatser.