Submitted by MARIA LUANA ALVES null (marialuana.alves@yahoo.com) on 2016-05-03T01:22:40Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao prontissima.pdf: 2895955 bytes, checksum: be473eaface6279971e2b88213feefe9 (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-05-04T20:03:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 alves_ml_me_ilha.pdf: 2895955 bytes, checksum: be473eaface6279971e2b88213feefe9 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-04T20:03:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 alves_ml_me_ilha.pdf: 2895955 bytes, checksum: be473eaface6279971e2b88213feefe9 (MD5) Previous issue date: 2016-03-03 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A leishmaniose visceral (LV), doença causada pelo protozoário Leishmania infantum e transmitida pelo flebotomíneo Lutzomyia longipalpis, é considerada um problema de saúde pública no Brasil. O objetivo deste trabalho foi realizar um estudo epidemiológico sobre a ocorrência da LV em cães e gatos e de flebotomíneos em dois abrigos de animais, durante o período de um ano, no município de Ilha Solteira, SP. Amostras de material biológico foram coletadas de 192 cães e de 197 gatos, para realização de exames sorológicos por meio do ensaio imunoenzimático indireto (ELISA), da reação de imunofluorescência indireta (RIFI) para ambas espécies animais e da reação intradérmica de Montenegro para cães. Dos cães examinados, 17,2% (33/192) estavam sorologicamente positivos para LV pelo método ELISA, 19,8% (38/192) pela RIFI e 45,4% (15/33) pela reação intradérmica. Para cães, a concordância entre as técnicas sorológicas foi classificada de razoável a boa, mas quando comparadas à reação de Montenegro foi considerada ruim. No inquérito felino das 197 amostras, a soroprevalência foi de 32,4% (64/197) e 31,9% (63/197) no ELISA e RIFI, respectivamente. Embora a maioria dos cães e dos gatos entregue nos abrigos já estivesse infectada, seis cães e cinco gatos infectaram-se no interior desses abrigos, após algum tempo de permanência nesses recintos. Um total de 131 flebotomíneos foram capturados por meio das armadilhas luminosas, colocadas no interior dos dois abrigos durante o período de dois anos. Os fatores de riscos associados à LV foram determinados estatisticamente pela análise univariada, com valor significativo (p ≤ 0,05), onde o porte pequeno dos cães, o uso de coleira de deltametrina e o diagnóstico precoce foram variáveis determinantes que influenciaram a positividade dos animais, ou seja, as duas últimas variáveis determinaram significativamente na diminuição de casos positivos da doença nos abrigos. Concluiu-se que os animais desses abrigos estavam vulneráveis a essa parasitose por se tratarem de locais com a presença de flebotomíneos vetores e de animais positivos para LV, oferecendo risco para a disseminação da doença no município. / Visceral leishmaniasis (VL), a disease caused by Leishmania infantum and transmitted by the sand fly Lutzomyia longipalpis, is considered a public health problem in Brazil. The study aimed to carry out an epidemiological study on the occurrence of VL in dogs and cats, and sand flies during the period of one year in two animal shelters from Ilha Solteira, SP. A total of 197 and 192 biological material samples were collected, respectively from cats and dogs for serological survey by an indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and an indirect fluorescent antibody test (IFAT) for both species of animals, and the intradermal reaction of Montenegro (only for dogs). During the study with dogs, 17,2% (33/192) were serologically positive for LV by ELISA, 19,8% (38/192) by IFAT and 45,4% (15/33) by the intradermal method. The correlation analysis between the serological techniques was ranged from reasonable to good for dogs, but was bad when compared to the Montenegro reaction. The feline seroprevalence was 32,4% (64/197) and 31,9% (63/197) for ELISA and IFAT, respectively. Although the most of dogs and cats in shelters were infected, six dogs and five cats infected inside the shelters. A total of 131 sand flies were captured by the light traps in both shelters, during two years. The risk factors, statistically determined by univariate analysis (p ≤ 0.05), demonstrated that the small size of the dogs, the use of deltamethrin collar and the precocious diagnosis, significantly influenced the animals positivity for VL. It was concluded that these animal shelters were vulnerable to this parasitic infection because of the presence of sand flies and positive animals for LV. / FAPESP: 2014/12609-2

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-11-30Bitstream added on 2014-06-13T21:02:22Z : No. of bitstreams: 1 souza_ai_dr_jabo.pdf: 1146677 bytes, checksum: ac9276512764cc5723060e8848ecdce5 (MD5) / Fundação Manoel de Barros / O trabalho teve como objetivo descrever as características clínicas da infecção natural pelo T. cruzi em cães residentes em uma área rural do estado de Mato Grosso do Sul, Brasil. Foram utilizados métodos sorológicos convencionais e não convencionais em 75 cães residentes na área e avaliação cardiovascular e da bioquímica sérica em quatro animais confirmadamente chagásicos. Foram usados os testes de reação de imunofluorescência indireta (RIFI), ELISA com antígenos da forma epimastigota do T. cruzi (EAE ELISA) e ELISA com antígeno excretado e secretado da forma tripomastigota do T. cruzi (TESA-ELISA), que detectaram anticorpos em 45,33% (n=34), 24,0% (n=18) e 12,0% (n=09) dos cães, respectivamente. A real prevalência da infecção foi confirmada como 10,7% (n=08) pela técnica de immunoblotting com antígeno secretado e excretado da forma tripomastigota do T. cruzi (TESA-blot). O teste com melhor índice de concordância (Kappa; 0,93), sensibilidade (100%) e especificidade (98,5%) foi o TESA-ELISA, que quando associado à RIFI igualou-se aos dados obtidos com o TESA-blot (10,7%). Três dos quatro animais chagásicos apresentaram aumento da silhueta cardíaca direta, aumento da duração de onda P e do complexo QRS. Um cão apresentou bloqueio de ramo direto e outro, bloqueio atrioventricular de primeiro grau e parada sinusal. Notou-se, também, espessamento de parede livre de ventrículo esquerdo em diástole, redução da fração de encurtamento e inversão dos picos de velocidade das onda E e A, indicando disfunção sistólica e diastólica... / This study was conduted to describe the clinical characteristics of the natural infection caused by the T. cruzi in dogs residing in a rural area of Mato Grosso do Sul, Brazil. Conventional and nonconventional diagnosis methods were used in 75 dogs living in this area for screening T. cruzi infection. Cardiovascular and biochemical serum were also performed in four confirmed positive dogs. The following tests were used: indirect immunofluorescence test (IFAT), enzyme-linked immunosorbent assay with T .cruzi. epimastigote antigens (EAE ELISA) and enzymelinked immunosorbent assay with T.cruzi excreted-secreted trypomastigote antigens (TESA-ELISA) with detected antibodies in 45,33% (n=34), 24,0% (n=18) and 12,0% (n=09) of the dogs, respectively. The real prevalence of the infection was confirmed as 10,7% (n=08) by immunoblotting test with T. cruzi excreted-secreted antigens (TESAblot). The test with the best concordance index (Kappa; 0,93), sensibility (100%) and specifity (98,5%) was the TESA-ELISA, which, when associated with IFAT had the same as results those obtained with the TESA-blot (10,7%). Three out of the four chagasic animals showed enlarged cardiac silhouette on x-ray and an increase of the P-wave duration and QRS complex in electrocardiogram. Two dogs presented conduction disturbances, right bundle block in one dog and the first-degree atrioventricular block and sinus arrest in another...(Complete abstract, click electronic access below)

A Leishmaniose é uma doença parasitária emergente em algumas regiões do Brasil causada por protozoário do gênero Leishmania. No ano de 2002 foi notificado o primeiro caso humano autóctone de Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) no município de Porto Alegre/RS, Bairro Lomba do Pinheiro. No meio urbano, o cão tem papel importante, servindo como fonte de infecção e reservatório do protozoário. Este estudo teve como objetivo avaliar o emprego de ELISA e PCR no diagnóstico da LTA em cães domiciliados na Estrada do Rincão, Bairro Lomba do Pinheiro, Porto Alegre. JESUS (2006) coletou e submeteu 200 amostras de soro de cães oriundos desta área de risco à Imunofluorescência Indireta (IFI) encontrando uma soroprevalência de 3,5% (7/200). Em nosso estudo, empregaram-se o ensaio imunoenzimático para diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina, kit Biomanguinhos/FIOCRUZ, com 61 (30,5%) dos 200 soros caninos sororeagentes e nestes foi realizada a reação em cadeia da polimerase (PCR) na qual apenas a amostra 12C de uma fêmea, sem raça definida, com quatro anos de idade, replicou o DNA de Leishmania spp. Utilizando o Teste Exato de Fisher para a análise estatística quanto à idade, sexo e raça, observou-se que houve associação significativa com a positividade em ELISA e a idade dos cães (p=0,0037), enquanto que quanto ao sexo (p=0,0687) e raça (p=0,1261) não encontramos associação significativa na positividade em ELISA. O Teste de McNemar`s foi aplicado aos resultados obtidos pelas técnicas de ELISA e IFI evidenciando uma diferença muito significativa entre as duas técnicas (p<0,0001). A identificação de cães soropositivos, sem sintomatologia, em área de baixa endemicidade no município de Porto Alegre, com casos humanos autóctones, serve como alerta e ponto de partida para mais investigações sobre a epidemiologia da LTA no RS e também sobre o emprego de outras técnicas de diagnóstico mais sensíveis. / Leishmaniasis is an emerging parasitic disease in some areas of Brazil caused by a protozoa of the genus Leishmania. In the year of 2002 it was notify the first autochthon human case of American Tegumentary Leishmaniasis (ATL) in the city of Porto Alegre /RS, Bairro Lomba do Pinheiro. In the urban way, the dog has important paper, serving as source of infection and reservoir of the protozoa. This study it had as objective to evaluate the job of ELISA and PCR in the diagnosis of the ATL in dogs domiciliated in the Road of the Rincão, Bairro Lomba do Pinheiro, Porto Alegre. JESUS (2006) collected and submitted 200 samples of serum of deriving dogs of this area of risk to Indirect immunofluorescent reaction (IFI) finding a soroprevalence of 3,5% (7/200). In our study, they had used for diagnosis Canine Visceral Leishmaniasis, kit Biomanguinhos/FIOCRUZ, with 61 (30.5%) positives samples of the 200 canine serum and in these the reaction in chain of polimerase in which only the sample 12C of a female, without defined race, with four years of age, presented the response of the DNA of the Leishmania genus in the PCR. Using the Accurate Test of Fisher for the analysis statistics how much to the age, sex and race, it was observed that it had significant association it enters the positividade in ELISA and the age of the dogs (p=0,0037), whereas how much to the sex (p=0,0687) and race (p=0,1261) we do not find significant association with the positividade in ELISA. The Test of McNemar `s was applied to the results gotten for the techniques of ELISA and IFI having evidenced a significant difference very between the two techniques (p< 0,0001). The identification of soropositives dogs, without symptons, in area of low endemicity in the city of Porto Alegre, with autochthon human case, also serves as alert and starting point for more inquiries on the epidemiology of the ATL in the RS and on the job of others techniques of more sensible diagnosis.

Esta tese compreende estudos sobre diagnóstico, caracterização antigênica e molecular de amostras do vírus da raiva e sobre o desenvolvimento de testes sorológicos para detecção de anticorpos contra o vírus rábico. O primeiro capítulo descreve dois casos de raiva no Estado do Rio Grande do Sul (RS). O primeiro trabalho do primeiro capítulo descreve a ocorrência de raiva em um canino no município de Tapes, leste do RS. Após a confirmação do diagnóstico, a amostra de vírus isolada foi submetida à caracterização antigênica e molecular. Tal amostra apresentava características compatíveis com amostras de vírus rábico isoladas de morcegos insetívoros Tadarida brasiliensis. Portanto, o primeiro caso de raiva canina no RS após 19 anos, ocorreu devido a um contato incidental entre um morcego não hematófago e o canino infectado. Assim, o status de região livre de raiva urbana pode ser mantido no Estado. O segundo trabalho do primeiro capítulo descreve a primeira ocorrência no RS de raiva em morcegos frugívoros da espécie Artibeus lituratus. Neste caso, a amostra isolada apresentou características de amostras isoladas de morcegos hematófagos Desmodus rotundus. A identificação de vírus rábico em um morcego frugívoro, com tal perfil, não representa fato novo na história recente da raiva, mas a descrição deste caso ilustra que a raiva em morcegos frugívoros no RS apresenta características semelhantes à raiva em morcegos frugívoros de outras regiões do Brasil e sugere que o mesmo foi contaminado devido ao contato com morcegos hematófagos. Com o objetivo de permitir o monitoramento sorológico da raiva em morcegos e a identificar novos potenciais reservatórios do vírus, no segundo capítulo desta tese é reportado o desenvolvimento de dois testes sorológicos para a detecção de anticorpos contra raiva. O primeiro teste desenvolvido é a inibição da imunoperoxidase (“immunoperoxidase inhibition assay”; IIA), que foi testada frente a 422 amostras de soros humanos. A IIA foi muito eficiente, tendo demonstrado uma acurácia de 97.63%. Esta técnica provavelmente poderá ser utilizada para detecção de anticorpos contra raiva em outras espécies, embora no presente estudo tenha sido avaliada apenas com soros humanos. Com o objetivo de pesquisar anticorpos contra raiva em diferentes espécies animais utilizando pequenos volumes de soro foi desenvolvido um ensaio imunoenzimático do tipo “sandwich” (“sandwich enzyme linked immunosorbent assay”; S-ELISA). O S-ELISA foi inicialmente comparado com um teste padrão FAVN (Fluorescent Antibody Vírus Neutralization test) e a seguir empregado na pesquisa de anticorpos em soros de diferentes espécies, incluindo morcegos, sagüis, raposas, felinos silvestres, guaxinis, quatis, bovinos, camundongos e humanos. Os resultados mostraram que o S-ELISA foi eficiente na detecção de anticorpos contra o vírus da raiva em diferentes espécies, com uma acurácia de 87,5%. A caracterização de amostras de vírus rábico em situações epidemiológicas específicas, assim como o desenvolvimento de testes sorológicos a fim de identificar anticorpos em distintas espécies e identificar novos possíveis reservatórios para raiva, contribuirão para o maior conhecimento da biologia da raiva na natureza, particularmente em nosso Estado, possibilitando assim a tomada de medidas de controle mais adequadas. / This thesis describes studies about diagnosis, antigenic and molecular characterization of rabies vírus strains and about serological assays development for antibodies against rabies virus detection. The first chapter describes two cases of rabies in State of Rio Grande do Sul (RS). This first work of the first chapter on this thesis, describes the canine rabies in Municipality of Tapes, east of RS. After the diagnosis confirmation, the rabies virus strain was submitted to antigenic and molecular characterization. The sample shown similar characteritics with rabies vírus isolates from insectivorous bats Tadarida brasiliensis. Thus, the first canine rabies in RS after 19 years occurred by an incidental contact between the contamined canine and a non-haematophagous bat. In view of that, the status of urban rabies free of the area should not be compromised. The second work of first chapter describes the first occurrence in RS of rabies in frugivorous bats Artibeus lituratus. In this case, the isolated sample shown characteristics similar to characteristics from haematophagous bats Desmodus rotundus. The rabies virus identification in a frugivorous bat with this profile, does not represent a new fact in the recent history of rabies, but the description of this case illustrates that the rabies in frugivorous bats in RS has similar characteristics to rabies in frugivorous bats in other regions of Brazil and suggests that it was contamined due to contact with haematophagous bats. With the purpose to allow the serological monitoring of rabies in bats and identify new potential reservoirs of the virus, in the second chapter of this thesis is reported the development of two serological tests for detection of antibodies against rabies. The first developed assay is the immunoperoxidase inhibition assay (IIA), that was tested with 422 sera from humans. The IIA was very efficient, with 97.63% of accuracy. This assay probably can be used to antibodies detection against rabies in other species, in despite of the present study, it was tested only with sera from humans. With the aim to research rabies antibodies in different animal species with small volume of serum, was developed the sandwich enzyme linked immunosorbent assay (S-ELISA). The S-ELISA was initially compared with the gold standard test Fluorescent Antibody Vírus Neutralization test and after used to search antibodies in sera from different species including bats, marmosets, foxes, wild felines, raccoons, coatis, bovines, mices and humans. The S-ELISA was efficient to detect antibodies in different species with 87.5% of accuracy. The characterization of rabies virus strains in specific epidemiological situations as well as the serological assays development to identify antibodies in distinct species and identify new potential rabies reservoirs for rabies, contribute to greater understanding of the biology of rabies in nature, particularly in our State, allowing the taking of appropriate control measures.

abstract: The healthcare system in this country is currently unacceptable. New technologies may contribute to reducing cost and improving outcomes. Early diagnosis and treatment represents the least risky option for addressing this issue. Such a technology needs to be inexpensive, highly sensitive, highly specific, and amenable to adoption in a clinic. This thesis explores an immunodiagnostic technology based on highly scalable, non-natural sequence peptide microarrays designed to profile the humoral immune response and address the healthcare problem. The primary aim of this thesis is to explore the ability of these arrays to map continuous (linear) epitopes. I discovered that using a technique termed subsequence analysis where epitopes could be decisively mapped to an eliciting protein with high success rate. This led to the discovery of novel linear epitopes from Plasmodium falciparum (Malaria) and Treponema palladium (Syphilis), as well as validation of previously discovered epitopes in Dengue and monoclonal antibodies. Next, I developed and tested a classification scheme based on Support Vector Machines for development of a Dengue Fever diagnostic, achieving higher sensitivity and specificity than current FDA approved techniques. The software underlying this method is available for download under the BSD license. Following this, I developed a kinetic model for immunosignatures and tested it against existing data driven by previously unexplained phenomena. This model provides a framework and informs ways to optimize the platform for maximum stability and efficiency. I also explored the role of sequence composition in explaining an immunosignature binding profile, determining a strong role for charged residues that seems to have some predictive ability for disease. Finally, I developed a database, software and indexing strategy based on Apache Lucene for searching motif patterns (regular expressions) in large biological databases. These projects as a whole have advanced knowledge of how to approach high throughput immunodiagnostics and provide an example of how technology can be fused with biology in order to affect scientific and health outcomes. / Dissertation/Thesis / Doctoral Dissertation Biological Design 2014

abstract: Measles is a contagious, vaccine-preventable disease that continues to be the leading cause of death in children younger than the age of 5 years. While the introduction of the Measles, Mumps, and Rubella vaccine (MMR) has significantly decreased morbidity and mortality rates worldwide, vaccine coverage is highly variable across global regions. Current diagnostic methods rely on enzyme immunoassays (EIA) to detect IgM or IgG Abs in serum. Commercially available Diamedix Immunosimplicity® Measles IgG test kit has been shown to have 91.1% sensitivity and 93.8% specificity, with a positive predictive value of 88.7% and a negative predictive value of 90.9% on the basis of a PRN titer of 120. There is an increasing need for rapid screening for measles specific immunity in outbreak settings. This study aims to develop a rapid molecular diagnostic assay to detect IgG reactive to three individual measles virus (MeV) proteins. Measles virus (MeV) genes were subcloned into the pJFT7_nGST vector to generate N- terminal GST fusion proteins. Single MeV cistrons were expressed using in vitro transcription/translation (IVTT) with human cell lysate. Expression of GST-tagged proteins was measured with mouse anti-GST mAb and sheep anti-mouse IgG. Relative light units (RLUs) as luminescence was measured. Antibodies to MeV antigens were measured in 40 serum samples from healthy subjects. Protein expression of three MeV genes of interest was measured in comparison with vector control and statistical significance was determined using the Student’s t-test (p<0.05). N expressed at the highest level with an average RLU value of 3.01 x 109 (p<0.001) and all proteins were expressed at least 50% greater than vector control (4.56 x 106 RLU). 36/40 serum samples had IgG to N (Ag:GST ratio>1.21), F (Ag:GST ratio>1.92), or H (Ag:GST ratio> 1.23). These data indicate that the in vitro expression of MeV antigens, N, F, and H, were markedly improved by subcloning into pJFT7_nGST vector to generate N-terminal GST fusion proteins. The expression of single MeV genes N, F and H, are suitable antigens for serologic capture analysis of measles-specific antibodies. These preliminary data can be used to design a more intensive study to explore the possibilities of using these MeV antigens as a diagnostic marker. / Dissertation/Thesis / Masters Thesis Biology 2016

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-05-17Bitstream added on 2014-06-13T19:55:42Z : No. of bitstreams: 1 santiago_meb_me_araca.pdf: 627508 bytes, checksum: 44ceb6f8db17a4d01854a3c87789a723 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / No período de março de 2005 a fevereiro de 2006, coletaram-se amostras de sangue e medula óssea de 112 gambás (Didelphis sp.) na região urbana da cidade de Bauru,estado de São Paulo, Brasil, com o objetivo de se verificar a possibilidade destes animais atuarem como reservatórios de Leishmania. Em amostras de soro foram detectados, anticorpos anti – Leishmania sp. pela técnica de ensaio imunoenzimático em fase sólida indireto (ELISA) e em medula óssea o DNA de Leishmania sp foi amplificado por meio da reação em cadeia pela polimerase (PCR) utilizando os primers 13A e 13B. Na reação de ELISA das 107 amostras analisadas 71,02% apresentaram se positivas, no PCR das 112 amostras de medula óssea analisadas 91,56% foram positivas. A evidência de fatores epidemiológicos de risco como, a presença do parasito circulante e dos vetores levam a acreditar que o gambá possa estar incluindo no ciclo da transmissão da Leishmaniose na cidade de Bauru. / Between March 2005 and February 2006, blood and Bone marrow samples were collected from 112 Opossums (Didelphis sp.) in the urban region of Bauru city - São Paulo state - Brazil . The objective was to verify the possibilities of these animals to be the reservoir of Leishmaniasis. Anti- Leishmania sp. antibodies were detected in serum by the Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) and DNA from Leishmania sp was detected in bone marrow through polymerase chain reaction (PCR). The 13A and 13B primers were used to perform the PCR. From 107 samples analysed with ELISA, 71,02% were positive for Leishmania sp, and positive outcome of 91,56% was observed by PCR. The evidence of epidemiologic risk factors like, the presence of a circulating parasite and of vectors leads to the conclusion that Opossums might be included in the leishmaniasis transmission cycle in Bauru city.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-12-13Bitstream added on 2014-06-13T19:55:43Z : No. of bitstreams: 1 teixeira_wfp_me_araca.pdf: 257034 bytes, checksum: 74c2e0dcd5f52341aac3382521691e4d (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo deste estudo foi padronizar a reação de Imunofluorescência direta (IFD) para detecção de oocistos de Cryptosporidium parvum em amostras fecais de bezerros. Os anticorpos policlonais anti-C. parvum foram produzidos em dois coelhos adultos da raça Nova Zelândia, e titulados por meio do ensaio imuno-enzimático indireto (ELISA). A fração de imunoglobulina G (IgG) foi purificada a partir do soro do coelho imunizado, utilizando-se diálise em sulfato de amônio seguida de cromatografia em coluna de DEAE celulose e conjugação com isotiocianato de fluoresceína. Por meio da IFD padronizada, foi testada a reatividade cruzada do conjugado produzido contra outras espécies de Cryptosporidium (C. andersoni e C. serpentis) e com outros agentes etiológicos presentes em fezes de bovinos (Escherichia coli, Eimeria sp. e Candida sp.). A IFD foi comparada à microscopia com contraste de fase em solução de Sheather (MCF), avaliando a capacidade de detecção de oocistos de Cryptosporidium sp. em alíquotas de fezes de bezerro inoculadas com oocistos de C. parvum, e em amostras fecais de bezerros naturalmente infectados provenientes de 37 propriedades leiteiras da região de Araçatuba, SP. Nas amostras comprovadas como positivas, foi ainda feita uma análise semi-quantitativa de oocistos de Cryptosporidium sp., visualizados por campo de microscopia em ambas as técnicas. O conjugado anti-C. parvum apresentou reatividade com C. andersoni e C. serpentis. A IFD foi utilizada com sucesso para detecção de oocistos de C. parvum em fezes de bezerros, apresentando sensibilidade para detecção de até 104 oocistos em 3 g de fezes. Entre as 300 amostras fecais de bezerros naturalmente infectados, 19,67% (59/300) foram positivas para a presença de oocistos de Cryptosporidium sp. pela IFD, apresentando diferença estatisticamente significante (p<0.05) em relação às amostras positivas pela MCF / The objective of this experiment was to standardize the direct immunofluorescence assay (DIF) for detection of Cryptosporidium parvum oocysts in fecal samples of calves. The anti-C. parvum polyclonal antibodies were produced in two adult rabbits of New Zealand breed, and titrated by an indirect enzyme-linked immunosorbent (ELISA). The immunoglobulin G (IgG) was purified from the serum of immunized rabbits by dialysis in ammonium sulfate followed by column chromatography on DEAE cellulose, and conjugated with fluorescein isothiocyanate. Using DIF the anti-C. parvum conjugate was tested for the presence of cross-reactivity against other species of Cryptosporidium (C. andersoni and C. serpentis), and other infectious agents present in cattle fecal samples (Escherichia coli, Eimeria sp. and Candida sp.). A comparison between the DIF and phase contrast microscopy in Sheather solution (MCF) was accomplished for evaluation of the efficiency of both techniques for detection of Cryptosporidium sp. oocysts in fecal samples of calves seeded with C. parvum oocysts, and in fecal samples from naturally infected calves from 37 dairy farms in the region of Araçatuba, SP. A semi-quantitative analysis of Cryptosporidium sp. oocysts per microscopic field was accomplished for both techniques. The anti-C. parvum conjugate showed cross-reactivity with C. andersoni and C. serpentis oocysts. The DIF has been used successfully in the detection of C. parvum oocysts in fecal samples of calves, with sensitivity for detecting 104 oocysts in 3 g of fecal samples. Among the 300 fecal samples from naturally infected calves, 19.67% (59/300) were positive for Cryptosporidium oocysts by DIF, with significant statistical difference (p <0.05) when compared to the number of positive samples by MCF

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2001Bitstream added on 2014-06-13T19:57:02Z : No. of bitstreams: 1 sene_mg_me_botfm.pdf: 956728 bytes, checksum: fe9e35a9180c7ad377bc30cbf9974ccd (MD5) / A paracoccidioidomicose (Pbmicose) é micose sistêmica causada pelo fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis, que acomete principalmente trabalhadores rurais do sexo masculino. A doença tem como principais manifestações clínicas a forma aguda/subaguda e a forma crônica. Métodos sorológicos têm considerável valor na Pbmicose e diferentes testes têm sido utilizados no diagnóstico e monitoramento da resposta do paciente ao tratamento. O objetivo deste estudo foi avaliar a IFI, a ID e o ELISA antes e após introdução do tratamento de pacientes com a forma aguda/subaguda e a forma crônica da Pbmicose. Para cada teste, os seguintes parâmetros foram avaliados: sensibilidade (SE), especificidade (EP), valor preditivo positivo (VPP), valor preditivo negativo (VPN) e eficiência (EF). No período pré-tratamento a IFI teve SE=92,3%, VPP= 87,5%, VPN= 92% e EF=88,6%. A ID teve SE=94,93%, VPP=97,4%, VPN=95% e EF=96,2%. Para o ELISA, SE=100%, VPP=95%, VPN=100% e EF=97,4%. No grupo de doadores de sangue, a EP da IFI, da ID e do ELISA foram, respectivamente, de 93,3%, 100% e 100%. Em soros de pacientes com outras micoses sistêmicas (histoplasmose, criptococose, actinomicose, aspergilose e adiaspiromicose), as EP para os testes foram de 60%, 90% e 80%, respectivamente. Durante o tratamento, maior correlação foi obtida entre a ID e o ELISA (r= 0,61591, p<0,05), obtendo-se baixas correlações com a IFI. O tempo necessário para negativar o ELISA (Md= 20,0 meses) foi maior do que a ID (Md= 13,5 meses). O ELISA se negativou em geral nove meses após a ID, o que sugere que este teste passe a ser um referencial para suspensão do tratamento de manutenção. Devido à sua elevada sensibilidade, especificidade, VPP, VPN e eficiência, o ELISA deve ser incluído na rotina sorológica de pacientes com Pbmicose. / Pararaccidioidomycosis (Pbmycosis) is a systemic mycosis caused by the dimorphic fungus Paracoccidioiodes brasiliensis, which often affects rural workers, usually male adults. The overt disease is manifested by two clinical forms, acute/subacute and chronic forms. Serological methods are of considerable value in Pbmycosis, and various tests has been utilized in the diagnostic and monitoring the patient's response to treatment. The aim of this study was to evaluated the reliability of the double immunodiffusion test (ID), indirect immunofluorescence (IIF) and immunoenzymatic assay (ELISA) in the pre-treatment and during the period of treatment of patients with acute/subacute and chronic forms of Pbmycosis. For each test the following parameters were evaluated: Sensitivity (SE), Specificity (SP), Positive and Negative Predictive Values (PPV and NPV) and Efficiency (EF). In the pre-treatment period these values for IFI were SE=92.3%, PPV=87.5%, NPV=92% and EF=88.6%. For ID: SE=94.9%, PPV=97.4%, NPV=95% EF=96.2%. For ELISA: SE=100%, PPV=95%, NPV=100% and EF=97.4%. In the group of blood donors, for IFI, ID and ELISA the ES were, respectively, 93.3%, 100% and 100%. In patients with other deep mycosis (histoplasmosis, cryptococcosis, actinomycosis, aspergillosis and adiaspiromycosis) the ES for these tests were respectively 60%, 90% and 80%. During the period of treatment, the highest correlation was observed between ID and ELISA (r= 0,61591, p<0,05), and the lowest correlations with IFI. The time elapsed to negative the ELISA was larger (Md=20 months) than for ID (Md= 13,5 meses). In overall, the ELISA negativated nine months after ID. This result suggests that the ELISA may be a referential test to monitoring the time for interruption of the treatment in Pbmycosis. Moreover, owing to its high values of SE, SP, PPV, NPV and EF, ELISA should be included in the serological routine for patients with Pbmycosis.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-28Bitstream added on 2014-06-13T19:56:58Z : No. of bitstreams: 1 silva_kr_me_jabo.pdf: 746958 bytes, checksum: 651e28fc6f5b0bad0768768aa6ff7a22 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A nucleoproteina do vírus da doença de Newcastle (VDN) é um dos componentes antigênicos ideais para fazer o imunodiagnóstico da DN, por ser mais conservada e possuir uma elevada imunogenicidade. A sequência completa do gene da nucleoproteína (NP) (1470 pb) da estirpe La Sota do VDN foi amplificada, nesse estudo, por RT-PCR e submetida a clonagem no vetor de expressão em Escherichia coli pETSUMO (Invitrogen). A proteína NP foi expressa sob a forma de uma proteína recombinante de fusão contendo o peptídeo SUMO e a sequência de poli-histidina, em seguida foi purificada em resina de níquel-agarose e caracterizada por SDSPAGE e Western-blotting, apresentando um peso molecular de cerca de 66kDa e reatividade com anticorpos policlonais de galinhas hiperimunizadas com esse mesmo vírus. Foi então desenvolvido um método indireto de ELISA com essa proteína (NPVDN- ELISA) para ser aplicado na detecção de anticorpos anti-virais específicos. O NP-VDN-ELISA revelou ser capaz de diferenciar amostras de soros positivos para o VDN das amostras de soros negativos e, na comparação dos resultados obtidos na análise de 125 soros de campo pelo NP-VDN-ELISA com os do teste de Inibição da Hemaglutinação (HI), foi encontrado um coeficiente de correlação significante entre estes métodos (r = 0,8345), bem como elevadas sensibilidade (89,3%), acurácia (90,4%) e especificidade (95,5%). Concluindo, a proteína NP recombinante expressa pelo sistema pET SUMO – E. coli compartilha os principais epítopos para interagir com anticorpos de galinhas produzidos contra a proteína NP do VDN, tendo, portanto, um bom potencial de ser aplicada de forma bem sucedida e com vantagens no teste de ELISA para realizar de forma mais rápida e prática, o imunodiagnóstico da DN de um maior número de amostras séricas de galinhas / The nucleocapsid protein (NP) of Newcastle Disease Virus (NDV), is a preferred choice to develop a serologic assay on account of highly conserved sequences, and high immunogenicity. The whole open-reading-frame (orf) of NP gene from LaSota strain of NDV was amplified by RT-PCR and cloned in pETSUMO vector (Invitrogen) and Escherichia coli as cellular host. The NP protein was expressed as a fusion recombinant protein containing SUMO peptide and poly-histidine tags. This protein was easily purified in nickel-agarose resin, and characterized by SDS-PAGE and Western-blotting, showing a molecular weight of approximately 66 kDa and reactivity with polyclonal antibodies from NDV hiperimmunized chickens. The recombinant NP protein was used as antigen to develop an indirect ELISA (NP-NDVELISA) for the detection chicken anti-NDV antibodies. The capability of the recombinant NP protein to differentiate positive from normal chicken sera was evident in NP-NDV-ELISA, and by comparing this ELISA with haemagglutination-inhibition test (HI) a high and significant correlation with the haemagglutination-inhibition test (r = 0,8345), as well as high sensitivity (89,3%), specificity (95,5%) and accuracy (90,4%) were obtained. In conclusion the results indicated that the recombinant NP protein shared the main epitopes with the homologous viral protein and has a great potential to be advantageously used in the ELISA for the analysis of large number of samples in the DN immunodiagnosis